鲅魚蛋白水解產(chǎn)物功能性質(zhì)分析

孫協(xié)軍，李秀霞，蔡路昀，馮彥博，田　鑫，李佳偉

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013）

鲅魚蛋白水解產(chǎn)物功能性質(zhì)分析

孫協(xié)軍，李秀霞*，蔡路昀，馮彥博，田鑫，李佳偉

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013）

研究了鲅魚酶解產(chǎn)物水溶性、持油持水能力、粘度等特性及抗氧化活性等功能性質(zhì)。研究結(jié)果表明，鲅魚蛋白在被木瓜蛋白酶酶解后（水解度25%），酶解液在pH3～11條件下具有很好的水溶性，水解物分子質(zhì)量多集中在1350u以下，其TCA-NSI在46.0%～76.8%之間，但親油能力和水合能力均有所下降，由于較高的水解度和木瓜蛋白酶的酶切特性的影響，鲅魚蛋白水解液的起泡性和起泡穩(wěn)定性均不理想，在蛋白質(zhì)濃度10～80mg/mL范圍內(nèi)，鲅魚蛋白水解液20℃運動粘度為1.14～1.82mm2/s，具有較好的流動性。鲅魚蛋白水解產(chǎn)物具有較好的還原力、自由基清除能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，抗氧化活性隨著濃度的增加而升高，鲅魚蛋白水解液的抗氧化能力和其濃度間呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。本文對鲅魚蛋白水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)方面的研究可為其在食品加工中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

鲅魚，木瓜蛋白酶，酶解產(chǎn)物，功能性質(zhì)

鲅魚（Scomberomorus niphonius）學(xué)名為藍(lán)點馬鮫，屬于鱸形目鲅科，俗稱燕魚、青箭等。鲅魚肉富含蛋白質(zhì)、維生素A和多種礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。鲅魚是我國北方海區(qū)重要的經(jīng)濟魚類，資源豐富，2012年我國的鲅魚年捕獲量為45.9萬t［1］，捕撈產(chǎn)品主要以鮮食為主，加工水平較低。

魚肉蛋白質(zhì)主要由肌原纖維蛋白質(zhì)組成（50%～70%）［2］，而肌原纖維蛋白不溶于水，因此，魚肉蛋白質(zhì)的水溶性較差，而加熱、酶解、酸溶和堿溶是改善魚肉蛋白質(zhì)水溶性的主要方法，其中酶解作用條件溫和，對魚肉蛋白的營養(yǎng)價值和功能特性有很好的改善作用［3］，酶解后的魚蛋白水溶性得到改善，一定酶解程度的魚蛋白乳化性和流動性也得到了提高，更適合作為食品加工的原料［4］。利用酶解技術(shù)進(jìn)行蛋白高值化改性多集中在海產(chǎn)低值魚，一些小鲅魚由于體積小、肉薄、風(fēng)味差，在市場上不受歡迎，浪費情況嚴(yán)重。本實驗以小鲅魚為原料制備鲅魚蛋白水解產(chǎn)品，對鲅魚水解蛋白的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行研究，為低值小鲅魚的開發(fā)利用提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鲅魚購于錦州市水產(chǎn)品批發(fā)市場；木瓜蛋白酶（食品級，40萬U/g） 鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白北京普博斯生物科技有限公司；藍(lán)色葡聚糖2000美國Sigma-aldrich公司；氧化性谷朊甘肽、還原型谷朊甘肽和維生素B12（分量為614.307、1355u） 瑞典Rharmacia公司；其他試劑均為分析純。

SZF-06A型脂肪測定儀上海新嘉電子有限公司；微量凱氏定氮裝置泉州市萬達(dá)化玻儀器設(shè)備公司；PB-10型酸度計北京賽多利斯公司；JB-90-2型定時磁力攪拌器上海衡平儀器儀表廠；FJ-200型高速分散均質(zhì)機上海標(biāo)本模型廠；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市金城國盛實驗儀器廠；101B-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海申光儀器儀表有限公司；FA2004型電子分析天平上海恒平科學(xué)儀器有限公司；TD5A-WS型臺式低速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；721型分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵上海申光儀器有限公司；烏氏粘度計（0.5～0.6mm） 臺州市椒江區(qū)玻璃儀器廠；labconco free zone 2.5L型真空冷凍干燥機上海匯分電子科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1鲅魚蛋白粉和水解粉的制備選擇新鮮度良好的冷凍小鲅魚，加冰運到實驗室后，流水解凍，取魚肉經(jīng)絞肉機絞碎成肉糜，取少量魚糜冷凍干燥后粉碎即為鲅魚蛋白粉；另取適量魚糜置于大燒杯中，按照底物濃度5%加入一定量去離子水，燒杯置于水浴中加熱至50℃，按照5000U/g底物的酶濃度加入適量木瓜蛋白酶，攪拌酶解6h，煮沸滅酶5m in，酶解液冷卻至室溫后，4000r/m in離心15m in，收集上清液于磨口平底燒瓶中，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉大部分水分后，凍干成粉，真空封裝后冷藏備用。

1.2.2水解產(chǎn)物基本成分分析蛋白質(zhì)的測定參照GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用微量凱氏定氮法測定；脂肪含量測定參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》，采用索氏抽提法測定；水分測定參照GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》，采用直接干燥法測定；灰分測定參照GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》所述方法測定。

1.2.3三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）測定

1.2.3.1蛋白質(zhì)含量和分子量測定鲅魚蛋白水解液蛋白質(zhì)含量測定參照陳毓荃所述考馬斯亮藍(lán)G250法測定［5］。

鲅魚蛋白水解液分子量測定采用Sephadex G-15凝膠層析進(jìn)行。Sephadex G-15凝膠填料按照說明進(jìn)行前處理后，濕法裝柱，柱體積為600mm×16mm，凝膠沉積到距離柱頂端約10cm處停止裝柱，去離子水洗脫6h后0.1mg/m L葡聚糖2000檢查裝柱質(zhì)量。Sephadex G-15分離的分子量范圍為500～1500u，分別將牛血清白蛋白（分子量≈66，800u）、維生素B12（分子量1355u）、氧化型谷胱甘肽（分子量614u）和還原型谷胱甘肽（分子量307u）配制成濃度為1mg/m L的溶液，分別進(jìn)樣1m L，去離子水洗脫，流速0.5m L/m in，每3m in收集一管，280nm測定各管收集液的吸光度，繪制分子量對數(shù)對洗脫體積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，鲅魚蛋白水解凍干粉稀釋成蛋白質(zhì)濃度為1mg/m L的溶液，相同條件下進(jìn)樣，測定鲅魚蛋白水解液的分子量分布情況。

1.2.3.2水解度的測定游離氨基態(tài)氮的測定：甲醛滴定法［5］。

1.2.3.3TCA-NSI的測定將鲅魚蛋白粉和水解凍干粉分別溶解于適量去離子水中，配制成蛋白質(zhì)濃度為5mg/m L的水溶液，分別量取該水溶液10m L，均加入1mol/L鹽酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)水解液pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10和11，再各加入10m L 10%三氯乙酸（TCA）溶液，混合后放置10m in，于4000r/m in離心20min，采用考馬斯亮藍(lán)法測上清液中蛋白質(zhì)含量，計算TCA氮溶指數(shù)。

1.2.4起泡性和起泡穩(wěn)定性測定參考陳志軍實驗方法［3］，分別稱取2g鲅魚蛋白粉和鲅魚蛋白水解凍干粉，各溶于200m L的去離子水中，分別加入1mol/L鹽酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)水解液pH分別為2、4、6、8和10，1600r/m in分散1m in，靜置2m in后量取起始泡沫體積，計算起泡性，起泡溶液室溫放置5、10、15m in后量取放置后的泡沫體積，計算起泡穩(wěn)定性。

1.2.5親油能力和水合能力的測定參考陳志軍［3］和張濤等［6］實驗方法，稱取0.5g鲅魚蛋白粉和蛋白水解凍干粉，分別與10m L大豆色拉油或去離子水一起置于離心管中，渦旋混合1m in后，靜置1m in，于4000r/m in離心30m in，量取游離油或水的體積，體積減少量即為樣品親油量或親水量。以每g樣品吸收的油或水的體積分別表示蛋白質(zhì)親油能力和水合能力。

1.2.6粘度測定在室溫（20℃）條件下采用烏氏粘度儀（0.5～0.6mm內(nèi)徑）測定。參照使用說明，將烏氏粘度計先使用洗液浸泡，丙酮、自來水和蒸餾水依次清洗后，調(diào)節(jié)恒溫槽的溫度為（20±1）℃，在粘度計中加入10m L樣品溶液，然后將加了樣品溶液的粘度計垂直掛于恒溫槽的支架上，恒溫10min后測定。

1.2.7抗氧化活性測定

1.2.7.1還原力測定參考榮建華等測定方法并略加改動［7］，將鲅魚蛋白水解濃縮液及VC溶液（標(biāo)準(zhǔn)參照物）分別稀釋為0.05、1、5、10、15、20、30mg/m L的溶液。精確吸取不同濃度的樣品溶液及VC溶液各2.0m L，并加入2.0m L pH6.6的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L）及2.0m L 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，于50℃恒溫水浴20m in后，向混合液中加入2.0m L 10%（w/v）的三氯乙酸溶液，混勻后以3000r/m in離心10m in。取上清液2.5m L，加入2.5m L蒸餾水和0.5m L 0.1%（w/v）的三氯化鐵溶液，混合均勻，待室溫下反應(yīng)10m in后，于700nm處測定吸光度值。吸光值越高則表示樣品還原能力越強，比較不同濃度的鲅魚蛋白水解液還原力的大小。各濃度樣液重復(fù)處理3次，求其平均值。以相同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照。

1.2.7.2羥自由基清除能力采用鄰二氮菲-亞鐵化學(xué)法測定比較不同濃度的鲅魚蛋白水解液清除羥自由基能力［8］。將鲅魚水解蛋白凍干粉分別配制成為蛋白質(zhì)含量分別為10、20、30、40、50、60、70、80mg/m L的樣品溶液。精確吸取1.5mmol/L鄰二氮菲溶液1.0m L于試管中，依次加入0.2mol/L的pH 7.4磷酸緩沖液2.0m L和不同濃度鲅魚蛋白水解稀釋液1.0m L，充分混合后，再加入1.5mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0m L，混勻，再加入1.0m L 0.1%H2O2，混勻后置于恒溫水鍋中，38℃保溫60m in后于波長536nm處測吸光度值，記為As；再用1.0m L去離子水代替1.0m L H2O2，測得吸光度值為Ab?？瞻坠芤?.0m L蒸餾水代替1.0m L樣液作為參照。各濃度樣液重復(fù)處理3次，求其平均值。以相同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照。按下式計算羥自由基清除率：

1.2.7.3超氧陰離子自由基（O2·-）清除能力將鲅魚蛋白水解凍干粉分別配制成蛋白質(zhì)含量為10、20、30、40、50、60、70、80mg/m L的樣品溶液。精密量取50mmol/L的pH 8.2 Tris-HCl緩沖溶液4.5m L及0.1m L樣品液于試管中，混勻后在室溫下放置4m in，然后于325nm處測定吸光值A(chǔ)j；精密量取Tris-HCl緩沖溶液4.5m L，向其中加入7mmol/L的鄰苯三酚溶液3.0m L，待反應(yīng)平衡4min后，于325nm處測定吸光值A(chǔ)0。按上述方法，精密量取Tris-HCl緩沖溶液4.5m L及0.1m L樣品液于試管中，混勻后在室溫下放置4m in，立即加入3.0m L鄰苯三酚并開始計時，以10mmol/L HCl為參比，于325nm處每隔30s測定吸光值A(chǔ)，共記錄前6min；各濃度樣液重復(fù)處理3次，求其平均值。以相同濃度VC溶液作為對照。

按下式計算超氧陰離子自由基O2·-清除率：

1.2.7.4DPPH自由基清除能力參照李紅實驗方法［9］，精密量取蛋白質(zhì)含量為2.0g不同樣品溶液于試管中，加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0m L，混合均勻后，于室溫下暗處放置20m in，以樣品提取溶劑，無水乙醇溶液為參比調(diào)零，于517nm處測定其吸光度值A(chǔ)i；精密量取蛋白質(zhì)含量為2.0g的不同濃度鲅魚蛋白水解稀釋液于試管中，加入蒸餾水2.0m L，混合均勻后，于室溫下暗處放置20m in，后于517nm處測定其吸光度值A(chǔ)j；精密量取0.2mmol/L的DPPH溶液2.0m L，加入蒸餾水2.0m L，混合均勻后，于室溫下暗處放置20min，后于517nm處測定其吸光度值A(chǔ)c。各濃度樣液重復(fù)處理3次，求其平均值。以相同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照。

按下式計算DPPH自由基清除率：

1.2.7.5抗脂質(zhì)過氧化能力的測定［10］試液的配制：脂質(zhì)體PBS（磷酸緩沖液）分散系（LLS）：300mg卵磷脂溶解于30m L 10mmol/L pH 7.4 PBS中，冰水冷卻條件下超聲處理一段時間，制得人工脂質(zhì)體；三氯乙酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-鹽酸混合液：15g TCA、0.37g TBA和2.1m L濃鹽酸依序放入100m L水中。

測定步驟：分別于樣品管中依次加入1m L卵磷脂溶液（LLS）、1m L 0.4mmol/L硫酸亞鐵和1m L樣品，混勻。避光于37℃水浴60m in，加入2m L TCA-TBA-HCl混合液，90～100℃水浴15min，迅速冷卻，以3000r/min離心10m in，取上清液在535nm測定吸光度As。對照管以1m L超純水代替1m L樣品，操作方法同樣品管，可測得對照管的吸光度Ac，參比管中以1m L超純水代替1m L卵磷脂，以相同濃度的BHT溶液為對照。

按下式計算抑制脂質(zhì)過氧化能力：

1.2.8數(shù)據(jù)處理實驗所得數(shù)據(jù)采用Excel 2003及SPSS 10.0數(shù)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1基本成分分析

鲅魚蛋白粉原料與水解凍干粉成分分析結(jié)果見表1，水解后的凍干粉蛋白質(zhì)含量略有增加，水解液中主要含可溶性蛋白、多肽和氨基酸類、可溶性糖、水分及可溶的鹽類等，而一些不易溶解于水中的組分在離心等步驟中去除。經(jīng)酶解后，凍干粉中蛋白質(zhì)含量達(dá)到80%以上，木瓜蛋白酶適合pH在7.0附近，酶解過程沒有調(diào)節(jié)pH，減少了無機鹽的殘留，灰分增加很小，因此，水解后的蛋白粉適合作為蛋白質(zhì)原料來利用。

表1　鲅魚蛋白酶解前后主要成分分析（%）Table 1　Analysis of protein components and hydrolysis from spanishmackerel（%）

2.2TCA-NSI測定結(jié)果

2.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及鲅魚蛋白水解液分子量分布測定結(jié)果牛血清白蛋白溶液濃度在0～5mg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y= 0.0517x+0.0577（式中y為吸光度；x為蛋白質(zhì)含量，單位為mg），R2=0.9996。

采用SephadexG-15對鲅魚蛋白水解液進(jìn)行了初步分離，結(jié)果如圖1所示，各分子量標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積見表2，超過1500u的物質(zhì)直接走凝膠間隙出來，不能分離，牛血清白蛋白的分子量為66800u，其分子量可校正為1500u。以標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)對洗脫體積作圖，得到回歸方程如下：y=-29.16x+129.24，其中x為分子量對數(shù)，y為洗脫體積（單位：m L），R2=0.9928。從圖1可以看出，絕大部分鲅魚蛋白水解液的洗脫體積在38～60m L之間，由回歸方程計算出相對應(yīng)的分子量分別為237～1346u之間，說明鲅魚蛋白水解液中多肽的分子量片段多數(shù)在1350u以下。

圖1　鲅魚蛋白水解液SephadexG-15凝膠層析譜圖Fig.1　Elutein profiles of protein hydrolysates of spanish mackerel using Sephadex G-15 chromatography

2.2.2TCA氮溶指數(shù)測定結(jié)果鲅魚蛋白酶解前后隨pH變化的TCA氮溶指數(shù)測定結(jié)果見圖2所示，在pH 3～11的范圍內(nèi)，酶解后的鲅魚蛋白溶解度遠(yuǎn)大于未酶解時，隨著pH增加，酶解前后蛋白質(zhì)溶解度的差距逐漸加大，當(dāng)pH為11時，鲅魚蛋白中僅有少量小分子蛋白能夠不被TCA沉淀，溶解度為20.8%，而水解液溶解指數(shù)已經(jīng)達(dá)到76.8%，這與酶解產(chǎn)物分子量較低有關(guān)，水解產(chǎn)生大量小肽和氨基酸，水溶性顯著增加（p＜0.05）。魚體肌肉蛋白質(zhì)可分為肌原纖維蛋白質(zhì)、肌漿蛋白質(zhì)和肌基質(zhì)蛋白質(zhì)，而肌原纖維蛋白由肌動蛋白（等電點5.4）和肌球蛋白（等電點4.7）組成，魚肉蛋白質(zhì)沉淀量最大時pH應(yīng)在肌球蛋白等電點附近［11］。在本實驗中，鲅魚蛋白在堿性條件下溶解度更好，在pH 5.0附近溶解度最低，推測鲅魚蛋白質(zhì)等電點在pH 5.0左右，當(dāng)溶液pH＞5.0后，鲅魚蛋白原液的溶解度隨著pH增加而變大［12］。蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，水解液中蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生了變化，等電點對蛋白水解液溶解度的影響變小，從實驗結(jié)果看，鲅魚蛋白水解液的溶解度隨著pH的增加而增加，沒有出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，這與鰱魚為原料的實驗規(guī)律相一致［3］。

表2　標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子量及洗脫體積Table 2　Themolecularweightand elution volume of peptide standards

圖2　鲅魚蛋白酶解前后在不同pH條件下溶解性的變化Fig.2　Solubility of spanishmackerel protein under different pH before and after hydrolyzing

圖3　pH對鲅魚蛋白酶解前后起泡性的影響Fig.3　Effectof foaming ability of spanishmackerel protein before and after hydrolyzing

圖4　鲅魚蛋白酶解前后的起泡穩(wěn)定性的變化Fig.4　Foaming stability of spanishmackerel protein before and after hydrolyzing

2.3起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定結(jié)果

鲅魚蛋白酶解前后起泡性和起泡穩(wěn)定性測定結(jié)果見圖3和圖4。良好的溶解性是蛋白質(zhì)溶液形成泡沫的基礎(chǔ)，木瓜蛋白酶為內(nèi)肽酶，它可以水解蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的短肽，所以，酶解后的鲅魚蛋白水解液主要由可溶性蛋白、多肽和游離氨基酸組成，水解液的氮溶解指數(shù)和粘度均高于未酶解的鲅魚蛋白原液，但由于本實驗中鲅魚蛋白水解度較高（甲醛滴定法測定DH為25%），影響了水解液的起泡性［13］，因此，酶解后的鲅魚蛋白起泡性只是略有提高（見圖3）。從圖3可以看出，酶解前后的鲅魚蛋白起泡穩(wěn)定性均迅速下降，在放置15m in后泡沫基本消失，說明鲅魚蛋白起泡穩(wěn)定性較差，而酶解則加速了起泡穩(wěn)定性的降低，這可能與木瓜蛋白酶專一性切除非疏水氨基酸組成的肽鍵有關(guān)［14］，水解液相對分子量較低，可溶性酶解產(chǎn)物含量高，水溶性較好，而粘度較低，起泡穩(wěn)定性差。

2.4親油能力和水合能力測定結(jié)果

酶解對鲅魚蛋白親油能力和水合能力的測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，鲅魚蛋白水解后親油能力由2.5m L/g降為1.8m L/g，鲅魚水解蛋白液的親油能力低于番茄籽蛋白和漢麻籽蛋白等植物種籽蛋白［6］，但酶解后的鲅魚蛋白水解液親油能力高于鰱魚蛋白水解液（1.2m L/g）［3］。經(jīng)木瓜蛋白酶水解后，鲅魚蛋白水解液中產(chǎn)生大量小肽和氨基酸，小分子量物質(zhì)增加，水溶性增加，疏水性減弱，親油能力降低。由于鲅魚蛋白水解液溶解于水，沒有計算酶解后的水合能力，而酶解前鲅魚蛋白的水合能力為2.0m L/g。

圖5　鲅魚蛋白酶解前后的親油能力和水合能力Fig.5　Hydrophilic-lipophilic ability of spanishmackerel protein before and after hydrolyzing

2.5粘度測定結(jié)果

鲅魚蛋白粉在水中溶解性很差，形成的是懸浮液，取其上清液測得的粘度很低，因此，本實驗中只測定了鲅魚蛋白水解液的粘度。測定結(jié)果見圖6，從圖6可知，隨著鲅魚蛋白水解液濃度從10～80mg/m L，20℃運動粘度從1.14m2/s升高到1.82m2/s。酶解增加了鲅魚蛋白的水溶性［4］，從而增加了粘度，隨著濃度的增加，蛋白水解液的粘度逐漸增加。鲅魚蛋白水解液的流動性很好，實驗過程中觀察到，在受熱情況下，蛋白水解物不發(fā)生膠凝變性，所以其粘度在一定濃度內(nèi)可能不受溫度的影響。這主要是因為蛋白質(zhì)水解后的疏水性降低了，且凈電荷量增加，肽與肽之間的靜電排斥，防止了蛋白水解物的膠凝，因此即使高濃度的蛋白水解液，也具有低粘度［15］。這種性質(zhì)的改變，使蛋白水解物在加工過程中泵輸送、攪拌、噴霧干燥、熱殺菌等工藝更易實施，比魚蛋白粉更適合作食品加工原料。

圖6　鲅魚蛋白水解液粘度Fig.6　Viscosity of spanishmackerel protein hydrolysates

2.6還原力測定結(jié)果

作為電子供體的還原劑通過提供電子給自由基，從而起到淬滅自由基的作用，還原力高低反應(yīng)自由基清除能力的大小。由圖7可見，鲅魚蛋白水解液還原力隨著濃度的增加而線性增加，表明其還原力和濃度間呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，且鲅魚蛋白水解液還原力與濃度之間存在線性關(guān)系，回歸方程為：y= 0.2194x-0.2487（R2=0.9934），其中x為吸光度，y為水解液濃度（mg/m L）。鲅魚蛋白水解液的還原力始終低于同濃度的維生素C，與斑鰶魚蛋白酶解產(chǎn)物的還原力測定結(jié)果和變化規(guī)律相近［16］，在水解液蛋白質(zhì)濃度為10mg/m L時，還原力為0.389，當(dāng)水解液蛋白質(zhì)濃度為30mg/m L，還原力為1.350。

圖7　鲅魚蛋白水解液還原力Fig.7　Reducing power of spanishmackerel protein hydrolysates

圖8　鲅魚蛋白水解液羥自由基清除能力Fig.8　Hydroxyl radical（OH·）scavenging activities of spanishmackerel protein hydrolysis

2.7羥自由基清除能力測定結(jié)果

羥自由基是高度活潑的一種自由基，在脂質(zhì)過氧化的早期階段中發(fā)揮作用，羥自由基清除能力部分是由于金屬螯合作用［17］。由圖8可見，水解液蛋白質(zhì)濃度從10～80mg/m L時，羥自由基清除率從72.28%增加到92.28%，30mg/m L維生素C的清除率已經(jīng)達(dá)到了100%，在鐵氰化鉀體系中，羥自由基是由Fe2+和H2O2反應(yīng)而產(chǎn)生的，而鲅魚蛋白酶解產(chǎn)物對Fe2+螯合能力較強［12］，因此，鲅魚蛋白水解液的羥自由基清除作用可能與其能夠很好地螯合金屬離子有關(guān)。

2.8超氧陰離子自由基清除能力測定結(jié)果

O2·-是生物活性最高的氧中心自由基之一，由于產(chǎn)生時間早、壽命長，可繼發(fā)氧化損傷等反應(yīng)，危害較大。從圖9可見，鲅魚蛋白水解液對超氧陰離子自由基O2·-有一定的清除作用，其清除作用較相同濃度維生素C溶液弱，且隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，其蛋白質(zhì)對超氧陰離子自由基O2·-的清除能力增強。當(dāng)水解液蛋白質(zhì)濃度在10～50mg/m L時，隨濃度的增加超氧陰離子自由基清除率上升幅度較大，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度超過50mg/m L時，清除率上升幅度變慢，仍低于維生素C的清除能力。

圖9　鲅魚蛋白水解液超氧陰離子自由基清除能力Fig.9　Superoxide anion（O2·-）scavenging activities of spanishmackerel protein hydrolysis

2.9DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種早期合成的穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基有機自由基，含有奇數(shù)個電子，常用來評估抗氧化物的供氫能力［18］。鲅魚蛋白水解液對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果見圖10，從圖10中可以看出，鲅魚蛋白水解液對DPPH自由基有一定的清除作用，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，蛋白水解液對DPPH自由基的清除能力增強。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度從10～80mg/m L時，DPPH自由基清除率從16.3%增加到63.7%，清除率低于同濃度的維生素C溶液。

圖10　鲅魚蛋白水解液DPPH自由基清除能力Fig.10　DPPH radical scavenging activities of spanishmackerel protein hydrolysis

2.10抗脂質(zhì)過氧化能力測定結(jié)果

由圖11可見，鲅魚蛋白水解液對于Fe2+引發(fā)的卵磷脂體系中脂質(zhì)體氧化有明顯的抑制作用，抑制率隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增大。不同濃度蛋白質(zhì)對脂質(zhì)過氧化的抑制率差異較小，當(dāng)鲅魚蛋白質(zhì)濃度為2mg/m L時，對脂質(zhì)過氧化的抑制率為23%，當(dāng)鲅魚蛋白質(zhì)的濃度為4mg/m L時，對脂質(zhì)過氧化的抑制率為42%。鲅魚蛋白水解液抗脂質(zhì)過氧化能力明顯低于BHT（二丁基羥基甲苯）的抗脂質(zhì)過氧化能力。

圖11　鲅魚蛋白水解液抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.11　Antioxidantactivities on lipid peroxidation of spanishmackerel protein hydrolysis

3　結(jié)論

研究了小鲅魚木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的體外抗氧化功能及性質(zhì)，以甲醛滴定法為測定水解度方法，鲅魚蛋白水解度在25%條件下，鲅魚蛋白水解產(chǎn)物凍干粉中蛋白質(zhì)含量為82.00%、水分含量7.36%、灰分含量3.69%和少量脂肪（1.85%）。酶解顯著增加了鲅魚蛋白的溶解度，且水解液的溶解度隨著pH的增加而增加；酶解后，鲅魚蛋白分子量多數(shù)集中于1350u以下，水解產(chǎn)物中小分子的多肽和游離氨基酸含量較高，水解產(chǎn)物的起泡性沒有得到很好的改善；酶解也不利于改善鲅魚蛋白的親油能力和水合能力；鲅魚蛋白水解液的流動性很好，較高濃度的蛋白水解液（蛋白質(zhì)濃度40.0～80.0mg/m L）也具有較低粘度（20℃運動粘度為1.14～1.82mm2/s）；鲅魚蛋白水解產(chǎn)物具有較好的還原力、自由基清除能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，隨著濃度的上升，鲅魚蛋白水解液的抗氧化能力和其濃度間呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。對鲅魚蛋白水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)方面的研究可為其作為食品基料添加到食品中提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局編制.2013中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［2］郭曉風(fēng)，鄒勝祥譯.水產(chǎn)利用化學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994.

［3］陳志軍，李向紅，劉永樂，等.鰱魚蛋白酶法水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2012，33（5）：62-65.

［4］楊東，王慥.水解魚蛋白及其功能特性的研究［J］.食品科學(xué)，1999，20（11）：23-26.

［5］陳毓荃.生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2002.

［6］張濤，盧蓉蓉，錢平，等.漢麻籽蛋白的提取及性質(zhì)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（8）：173-179.

［7］榮建華，李小定，謝筆鈞.大豆肽體外抗氧化效果的研究［J］.食品科學(xué)，2002，23（11）：118-120.

［8］謝海玉，紀(jì)銀莉，高維東，等.鄰二氮菲-Fe2+法測定牦牛乳酪蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（11）：175-178.

［9］李紅，郅潔，馬彥梅，等.沙棗黃酮的提取及其抗氧化作用的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，2（1）：35-36.

［10］張爾賢，俞麗君，周意林，等.Fe2+誘發(fā)脂蛋白PUFA過氧化體系及對若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評價［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1996，28（2）：218-292.

［11］陳申如，張其標(biāo)，倪輝.酸法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì)技術(shù)的研究［J］.海洋水產(chǎn)研究，2004，25（5）：61-64.

［12］史策，韓烽烽，劉鵬，等.鱈魚和鲅魚魚肉蛋白酶解產(chǎn)物功能特性及抗氧化性［J］.肉類研究，2013，27（8）：5-7.

［13］劉騫，施雪，孔保華.鯉魚魚肉蛋白酶水解物抗氧化性及功能特性［J］.食品科學(xué)，2012，33（5）：19-24.

［14］王鏡巖.生物化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［15］趙玉紅，孔保華，張立鋼，等.魚蛋白水解物功能特性的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，32（2）：105-110.

［16］肖月娟，李潤豐，鄭立紅，等.斑鰶魚蛋白控制酶解及其酶解物抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報，2010，10（5）：91-97.

［17］Feng T，Du Y M，Wei Y A.Antioxidant activity of half N-acetylated water-soluble chitosan in vitro［J］.Eur Food Res Technol，2007，225（1）：133-138.

［18］Soares JR，Dins TCP，Cunha A P，etal.Antioxidantactivity of some extracts of Thymus zygis［J］.Free Radical Res，1997，26（5）：469-478.

Functional properties of protein hydrolysate abstained from spanish mackerel

SUN Xie-jun，LIXiu-xia*，CAILu-yun，F(xiàn)ENG Yan-bo，TIAN Xin，LI Jia-wei
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，BohaiUniversity，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，Engineering and Technology Research Center of Food Preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

Founctional p roperties of solubility，hyd rophilic and lipophilic ability，viscosity，and antioxidant activity of p rotein hyd rolysates from spanish mackerel were investigated in this paper.The results showed that when spanish mackerel p rotein was hyd rolyzed by papain（DH 25%），high solubility of the hyd rolysates was observed w ithin pH range of 3.0～11.0（TCA-NSIwas between 46.0%and 76.8%），most fractions Mw of hyd rlysates were lower than 1350u，but hyd rophilic and lipophilic ability were all reduced，due to the high degree of hyd rolysis and d igestion characterization of papain，foam ing ability and foam ing stability ofmackerel p rotein hyd rolyzates was undesirab le.Itwas observed that hyd rolates had high p rotein content（10～80mg/m L）and low viscosity which was of 1.14～1.82mm2/s of kinematic viscosity under 20℃.It was p rovided that mackerelp rotein hyd rolyzate had good reducing power，free rad icalscavenging and anti-lip id peroxidation，the antioxidant capacity increased w ith the inc rease of hyd rolysate concentration in a dose-effect relationship.The research of this paper about the functional p roperties of p rotein hyd rolyzates from spanish mackerelwould be useful for p roviding technicalsupporton its app lication in food p rocessing.

spanish mackerel；papain；hyd rolysate；founctinalp roperties

TS219

A

1002-0306（2015）06-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.032

2014-07-02

孫協(xié)軍（1969-），男，本科，實驗師，主要從事食品資源開發(fā)利用方面的研究。

李秀霞（1973-），女，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工方面的研究。

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B06）；遼寧省食品安全重點實驗室開放課題（LNSAKF2011015）。