蓬莪術(shù)多糖體外抗氧化活性研究

茍學(xué)梅，王　茜，高　剛，周永紅，楊瑞武，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江611130）

蓬莪術(shù)多糖體外抗氧化活性研究

茍學(xué)梅1，王茜1，高剛1，周永紅2，楊瑞武1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江611130）

以多年生草本藥用植物蓬莪術(shù)根莖為原材料，熱水浸提法提取多糖，測(cè)定蓬莪術(shù)多糖的總糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量，并對(duì)蓬莪術(shù)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行紅外光譜分析。通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究蓬莪術(shù)多糖對(duì)自由基的清除能力以及總還原能力。結(jié)果表明，蓬莪術(shù)多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.13%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.65%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.53%。體外抗氧化活性研究結(jié)果表明對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子有明顯清除作用和較強(qiáng)的還原能力，其清除自由基的IC50值分別為0.29、0.44、0.36mg/mL。

蓬莪術(shù)，多糖，抗氧化

近年來(lái)對(duì)藥用植物的研究發(fā)現(xiàn)，其含有豐富的多糖類(lèi)物質(zhì)，是中醫(yī)和中藥應(yīng)用的重要物質(zhì)成分。研究表明，藥用植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)［1-2］、抗腫瘤［3］、抗病毒［4］、抗輻射［5］及降血糖［6］等方面有眾多藥理功能，且無(wú)毒副作用，有“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（biological response modifier，BRM）”［7］之稱(chēng)。因此從藥用植物中提取具有生物活性的多糖類(lèi)物質(zhì)，具有重要意義和較好的研究前景。

蓬莪術(shù)（Curcuma phaeocaulis Valeton）是2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的3種基原莪術(shù)中的一種，是姜科姜黃屬的多年生草本植物，為川產(chǎn)道地藥材［8］。中醫(yī)認(rèn)為蓬莪術(shù)有破淤、行氣、消積和止痛的功效［9］；還有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等活性［10］。蓬莪術(shù)的主要有效部位為根莖，其主要活性成分是揮發(fā)油和多糖。蓬莪術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血等作用［11］，已廣泛應(yīng)用于臨床。目前有關(guān)蓬莪術(shù)的研究主要集中在莪術(shù)油的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)上。然而關(guān)于蓬莪術(shù)多糖的物理化學(xué)性質(zhì)以及清除自由基活性方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)從蓬莪術(shù)根莖中提取多糖，考察其理化性質(zhì)和體外抗氧化活性，為蓬莪術(shù)資源的綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試材料采集于四川雙流，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊瑞武教授鑒定為蓬莪術(shù)（Curcumaphaeocaulis Valeton），洗凈于50℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，干燥保存?zhèn)溆?；抗壞血酸（VC） 成都科龍化工試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH） 美國(guó)Sigma公司；重蒸酚國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、無(wú)水乙醇、石油醚（60～90℃）、葡萄糖等所用其他試劑均為分析純；本實(shí)驗(yàn)用水均為自制雙蒸水。

FW 80型中草藥粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科技有限公司；HWSY 11-K型電熱恒溫水浴鍋北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司；RB-52AA型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化有限公司；H-1650型離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱天津泰斯特儀器有限公司；UV-3200PC型紫外分光掃描儀上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多糖的提取及純化準(zhǔn)確稱(chēng)取100g的蓬莪術(shù)粉末分別經(jīng)石油醚和無(wú)水乙醇索氏提取5h至無(wú)色，烘干得預(yù)處理粉末。準(zhǔn)確稱(chēng)取50g預(yù)處理粉末，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上按料液比1∶30加入水，在90℃提取4h，重復(fù)提取兩次合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至400m L后加入95%乙醇至乙醇最終濃度為80%（v/v），于4℃下醇沉24h，離心，沉淀即為蓬莪術(shù)粗多糖。將粗多糖溶于50m L雙蒸水中，采用Sevage法（氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v）［12］除去糖液中的蛋白，重復(fù)多次，然后流水透析24h，蒸餾水透析48h，濃縮透析袋內(nèi)糖液，冷凍干燥，得蓬莪術(shù)多糖（CPP）。

1.2.2化學(xué)組成

1.2.2.1CPP總糖含量的測(cè)定CPP的糖含量采用苯酚硫酸法［13］測(cè)定，以干燥葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確配制0.40mg/m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及6%的苯酚溶液。分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0～10.0m L至10.0m L容量瓶中加水定容。精密移取各梯度濃度溶液2.0m L于20m L具塞試管中，依次加入1m L 6%的苯酚溶液和5m L濃硫酸，振蕩混勻，沸水浴30min。冷卻至室溫后在490nm處測(cè)定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度（mg/m L）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以超純水替代標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0129x-0.0073，R2=0.9998。

樣品的測(cè)定：配制樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行樣品的測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，求取平均值，通過(guò)樣品溶液的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出樣品中葡萄糖的含量，按照下式計(jì)算各樣品中總糖含量：

式中，c為樣品測(cè)定液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/m L）；d為測(cè)定液的稀釋倍數(shù)；v為測(cè)定液的總體積（m L）；m為稱(chēng)取的樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2.2糖醛酸含量測(cè)定糖醛酸含量采用硫酸咔唑法［14］測(cè)定，以半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確配制濃度為1.0mg/m L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.02～0.1m L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，補(bǔ)水至1m L。然后緩慢加入6m L硫酸-硼砂溶液，混合均勻后沸水浴5m in。冷水浴冷卻至室溫后分別加入0.2m L 0.1%的咔唑無(wú)水乙醇溶液，沸水浴10m in后取出，冷卻至室溫后在530nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的半乳糖醛酸濃度（mg/m L）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以超純水替代標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=9.6514x+0.0011，R2= 0.9987。

樣品的測(cè)定：配制樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行樣品的測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，求取平均值，通過(guò)樣品溶液的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出樣品中糖醛酸的含量，按照下式計(jì)算樣品中糖醛酸的含量：

式中，c為供試液中糖醛酸質(zhì)量濃度（mg/m L）；d為測(cè)定液的稀釋倍數(shù)；v為測(cè)定液的總體積（m L）；m為供試樣品的質(zhì)量（mg）。

1.2.2.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量采用王文平的方法［15］測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確配制濃度為100μg/m L牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密移取0.2～1.0m L牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于10m L具塞試管中，各管補(bǔ)水至1m L，然后分別加入5m L考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，常溫下靜置15m in，待顏色穩(wěn)定后，在595nm處測(cè)定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)含量（μg）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以超純水替代標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0045x-0.0058，R2=0.9983。

樣品的測(cè)定：配制樣品溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行樣品的測(cè)定，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，求取平均值，通過(guò)樣品溶液的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出樣品中可溶性蛋白質(zhì)的含量，按照下式計(jì)算樣品中可溶性蛋白質(zhì)的含量：

式中，m為供試液中可溶性蛋白質(zhì)含量（μg）；d為測(cè)定液的稀釋倍數(shù)；M為供試樣品的質(zhì)量（mg）。

1.2.3紅外光譜分析準(zhǔn)確稱(chēng)取CPP 1～2mg，與干燥KBr碾碎混勻，壓成1.0mm薄片，采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（FT-IR）進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，波長(zhǎng)掃描范圍4000～500cm-1。

1.2.4抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1DPPH自由基清除活性的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)［16］中的方法：取2m L不同質(zhì)量濃度的CPP和VC樣品溶液與2m L 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，靜置30m in，517nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除能力通過(guò)以下公式計(jì)算：

式中，Ai為DPPH與樣液反應(yīng)后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，Ac為未加樣的DPPH吸光度，每一樣品平行測(cè)三次，取其平均值。

1.2.4.2羥基自由基清除活性的測(cè)定采用參考文獻(xiàn)［17］中的方法，取2mmol/L FeSO4溶液3m L，加入1mmol/L H2O2溶液3m L，再加入6mmol/L水楊酸溶液3m L，立即搖勻，37℃水浴下加熱15m in后取出，然后加入1.0m L不同質(zhì)量濃度的樣品液，繼續(xù)水浴加熱15m in，冷卻至室溫在520nm下測(cè)定吸光度，VC作為對(duì)照。羥基自由基清除能力通過(guò)以下公式計(jì)算：

羥基自由基清除率（%）=（Ai-Aj）/（Ac-Aj）×100

式（5）

式中，Ai為·OH與樣液反應(yīng)后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，Ac為未加H2O2的吸光度，每一樣品平行測(cè)三次，取其平均值。

1.2.4.3超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)［18］中的方法：用0.05mol/L、pH=7.4的PBS緩沖液為溶劑配制3.3×10-6mol/L核黃素，0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蘭（NBT），分別取上述溶液各2.0m L，加入各濃度CPP和VC溶液1.0m L，混勻光照30m in后，在560nm下測(cè)定吸光度。超氧陰離子自由基清除能力通過(guò)以下公式計(jì)算：

超氧陰離子自由基清除率（%）=（1-Ai/Aj）×100

式（6）

式中，Ai為樣液反應(yīng)后的吸光度，Aj為樣品空白的吸光度，每一樣品平行測(cè)三次，取其平均值。

1.2.4.4還原力的測(cè)定采用鐵氰化鉀法參照參考文獻(xiàn)［19］。以VC為對(duì)照，將CPP和VC配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別取樣品溶液2.5m L加入到2.5m L PBS（0.2mol/L，pH 6.6）中，再加入1.0m L鐵氰化鉀（1%，w/v），混勻后50℃水浴20m in。冷卻至室溫加入2.5m L三氯乙酸（10%，w/v），3000r/min離心10min。分別取2.0m L上清液加入2.0m L超純水，再加入0.5m L三氯化鐵（0.1%，w/v），室溫放置10m in后，700nm處測(cè)定光吸收值。吸光值越高表明樣品的還原力越強(qiáng)。

2　結(jié)果與分析

2.1CPP的化學(xué)組成

苯酚硫酸法測(cè)得CPP總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.13%，硫酸咔唑法測(cè)得其中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.65%，王文平法測(cè)得其蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.53%。說(shuō)明蓬莪術(shù)多糖是含有少量蛋白的酸性糖。

2.2CPP的紅外光譜

紅外光譜是研究多糖官能團(tuán)的有效手段，如圖1所示，紅外光譜檢測(cè)結(jié)果表明：CPP在3380～3400cm-1處有O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，2929～2933cm-1處有C-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，這兩組峰是糖類(lèi)的特征吸收峰。1616cm-1附近的吸收峰為C=O非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，1417cm-1附近的吸收峰為C=O對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰。1100～1000cm-1處的吸收峰是由C-O-C伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，在890cm-1左右出現(xiàn)吸收峰β-糖苷鍵的特征吸收峰。

圖1　CPP的紅外光譜圖Fig.1　Infrared spectra of CPP

2.3CPP的抗氧化活性

2.3.1CPP對(duì)DPPH自由基的清除作用DPPH自由基是一種比較穩(wěn)定的自由基，廣泛應(yīng)用于測(cè)定純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。由圖2可以看出，在低濃度范圍內(nèi)，CPP對(duì)DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，但隨著CPP質(zhì)量濃度的增加，清除率趨于平緩，質(zhì)量濃度大于0.75mg/m L后，CPP的清除率基本穩(wěn)定在82.33%，清除DPPH自由基50%時(shí)的CPP質(zhì)量濃度即IC50為0.29mg/m L。較低的IC50值表示CPP較高的DPPH自由基清除能力。

圖2　CPP和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2　DPPH radical scavenging abilities of CPP and VC

圖3　CPP和VC對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.3　Hydroxyl radical scavenging abilities of CPPand VC

2.3.2CPP對(duì)·OH的清除作用羥基自由基是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，清除羥基自由基的能力是評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖3可知CPP有很強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，CPP的清除能力依次增加。在低濃度范圍內(nèi)，CPP對(duì)·OH的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，小于0.5mg/m L時(shí)，CPP清除·OH的能力大于VC，但大于0.5mg/m L后，對(duì)照品VC的清除能力迅速上升，在1.0mg/m L后，VC對(duì)羥基自由基的清除率接近100%，而CPP對(duì)清除羥基自由基有明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg/m L時(shí)，CPP對(duì)·OH的清除率達(dá)到最大值86.13%，其IC50值為0.44mg/m L。

2.3.3CPP對(duì)·O2-的清除作用·O2-即是陰離子，又是自由基，性質(zhì)活潑，具有很強(qiáng)的氧化性和還原性，既是氧化劑，又是還原劑，過(guò)量生成可致組織損傷。圖4表明，CPP對(duì)超氧陰離子有一定的清除作用，在低濃度范圍內(nèi)，CPP對(duì)超氧陰離子清除作用一直隨濃度增加而增大。在1.0mg/m L時(shí)達(dá)到最大（83.33%），而后清除率不變，IC50值為0.36mg/m L，表明CPP具有較強(qiáng)的·O2-清除活性。

圖4　CPP和VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.4　Superoxide anion radical scavenging abilities of CPP and VC

2.3.4CPP的總還原能力抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯(lián)系，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。由圖5可知，在小于1.0mg/m L的質(zhì)量濃度內(nèi)，CPP的還原力隨著濃度的增加而增加；當(dāng)濃度為1.0mg/m L時(shí)，吸光度為0.95；當(dāng)濃度為1.25mg/m L時(shí)，吸光度為1.01。對(duì)于分光光度法而言，當(dāng)吸光度高于1.0時(shí)，測(cè)量結(jié)果的相對(duì)誤差較大，故不再進(jìn)一步增加CPP質(zhì)量濃度。在已測(cè)量的質(zhì)量濃度內(nèi)，CPP的還原力不及VC，但與濃度呈正相關(guān)。

圖5　CPP和VC的還原力Fig.5　Reducing power of CPP and VC

3　結(jié)論

已有許多研究表明從藥用植物中提取的多糖具有很好的抗氧化活性。從杜仲中提取的多糖具有很強(qiáng)的DPPH自由基的清除能力和較強(qiáng)的還原能力，在相同濃度下清除能力高于維生素C［20］。從魚(yú)腥草中提取的多糖具有較好的DPPH自由基，羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除活性［21］。通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，從藥用植物蓬莪術(shù)中提取的多糖是含有少量蛋白的酸性糖，具有糖類(lèi)典型的紅外吸收峰，含有β糖苷鍵。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，CPP對(duì)DPPH自由基、·OH和·O2-都具有一定清除能力以及較強(qiáng)的還原能力，隨著質(zhì)量濃度的提高，清除效果越明顯，清除DPPH、·OH、·O2-自由基的IC50值分別為0.29、0.44、0.36mg/m L。蓬莪術(shù)多糖具有明顯的抗氧化能力，可以開(kāi)發(fā)成為高效、低毒的天然抗氧化劑應(yīng)用于食品及保健領(lǐng)域，而有關(guān)蓬莪術(shù)多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Antioxidant activities of polysaccharides from rhizomes of the herb Curcuma phaeocaulis in vitro

GOU Xue-mei1，WANG Qian1，GAO Gang1，ZHOU Yong-hong2，YANG Rui-wu1，*
（1.College of life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Triticeae Research Institute，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China）

Water-solub le polysaccharides were obtained from rhizomes on roots of the herb Curcuma phaeocaulis Valeton.In add ition，the total contents of carbohyd rate，uronic acid and p rotein of C.phaeocaulis polysaccharide were measured by chem icalmethods，and the structural characteristic of CPP was detected by FT-IR spectra. Furthermore，the antioxidantactivities of CPPwere evaluated on the basis of DPPH，hyd roxyl radical，superoxide anion rad icals scavenging ability and reducing power in vitro.The results showed that the contents of carbohyd rate，uronic acid and p rotein were 56.13%，8.65%and 4.53%，respectively.The results showed that the CPP possessing remarkab le free rad ical scavenging activity and a good reducing power in vitro antioxidant assay.The IC50values of scavenging free radicals were 0.29，0.44，0.36mg/m L，respectively.

Curcuma phaeocaulis Valeton；polysaccharides；antioxidantactivity

TS201.2

A

1002-0306（2015）06-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.019

2014-07-03

茍學(xué)梅（1990-），女，碩士研究生，研究方向：植物化學(xué)與成分分析。

楊瑞武（1969-），男，博士，教授，主要從事植物系統(tǒng)與進(jìn)化方面的研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31270243）。