核桃仁去衣液中核桃黃酮的回收及抗氧化活性研究

宋　浩，趙聲蘭，陳朝銀，*，李汝榮，張?zhí)熵?，武萬興，史丹丹

（1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500；2.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南昆明650500；3.大理漾濞核桃有限責任公司，云南大理672500）

核桃仁去衣液中核桃黃酮的回收及抗氧化活性研究

宋浩1，趙聲蘭2，陳朝銀1，*，李汝榮3，張?zhí)熵?，武萬興1，史丹丹1

（1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500；2.云南中醫(yī)學院中藥學院，云南昆明650500；3.大理漾濞核桃有限責任公司，云南大理672500）

以核桃乳生產(chǎn)過程中核桃仁去衣時的浸泡液和堿液為原料，研究了用AB-8型大孔樹脂分離和純化核桃黃酮的工藝條件，分別進行了靜態(tài)和動態(tài)吸附與解吸實驗。結果表明：AB-8樹脂能夠很好的分離純化核桃仁去衣液中的核桃黃酮，在確定的工藝條件下，核桃黃酮的純度為61.35%～74.16%，回收率為81.73%～86.51%。所得核桃黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除率的IC50分別為1.460～1.911μg/mL、4.391～6.294mg/mL、0.415～0.472mg/mL。表明核桃仁去衣液是一種良好的核桃黃酮生產(chǎn)原料，是一種理想的天然抗氧化產(chǎn)品。

浸泡液，堿液，黃酮，抗氧化活性

核桃仁富含核桃多酚類物質(zhì)，且主要集中在核桃種皮或核桃衣中［1］，但在核桃乳加工過程中，通常需將核桃仁種皮除去［2-3］。目前，核桃仁去皮方法應用最廣泛的為堿液去皮法［4］。核桃仁經(jīng)浸泡及去衣，其多酚與黃酮含量分別下降81.7%和72.2%。此外，堿液去皮產(chǎn)生的廢水COD為20000mg/L左右，大大超過國家二級污水排放標準［5］。企業(yè)每生產(chǎn)一噸核桃乳，將會產(chǎn)生數(shù)噸廢水，廢水大量的排放，又會造成附近的田地、水質(zhì)等環(huán)境污染，給企業(yè)的生存和發(fā)展帶來巨大壓力［6-7］。

核桃仁已知含有蘆丁、鞣花酸、紅景天苷、長壽花苷、槲皮素、兒茶素等黃酮類化合物［8-10］，是一類具有很強抗氧化活性的天然抗氧化劑，具有清除自由基、預防心血管疾病、防癌、抗輻射、延緩機體衰老等功能［11-13］。核桃仁去衣液中核桃黃酮類化合物的開發(fā)利用研究目前尚未見報道。因此，本文研究AB-8樹脂對核桃仁去衣液中核桃黃酮類化合物的回收利用技術，并對核桃仁去衣液中核桃黃酮的體外抗氧化活性進行系統(tǒng)研究，以期為核桃乳企業(yè)廢水的利用提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃乳生產(chǎn)中的廢水來自云南省大理漾濞有限責任公司，備用；蘆丁標準品上海同田生物技術股份有限公司；AB-8大孔吸附樹脂天津南大樹脂科技有限公司；1，2-二苯基代苦味肼基自由基（DPPH） Sigma公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇等試劑均為分析純。

FA2104型電子分析天平上海天平儀器廠；VAL-1N酒精計上海振捷實驗設備有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計Amersham Biosciences；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、101-2型冷凍干燥機、HH-S型恒溫水浴鍋鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1蘆丁標準曲線的繪制黃酮采用蘆丁作對照品，并參照Sheng的方法制作標準曲線［14］。

1.2.2堿處理液與浸泡液的獲取將核桃仁放入不銹鋼網(wǎng)框中，加入80℃熱水浸泡5m in，取出核桃仁，剩下的水樣即為浸泡液；上述取出的核桃仁放入含有1%～5%NaOH的堿水槽中，5m in后取出核桃仁，剩下的堿水即為堿處理液。

1.2.3堿處理液與浸泡液上柱樣品液的制備取廢液各500m L，靜置沉淀，然后真空抽濾各兩次，除去其中的濾渣和仁皮。測定各廢液中黃酮的含量，并根據(jù)需求用鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)廢液的pH，備用。

1.2.4核桃乳加工過程中廢液中黃酮含量的測定

精確稱量1L水樣，真空抽濾，收集濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后冷凍干燥，稱重。取1g干燥物用60%乙醇定容至100m L，吸取樣品液2m L，按照標準曲線的方法測定吸光值后，然后根據(jù)標準曲線計算黃酮的含量。

1.2.5樹脂的預處理將AB-8樹脂用95%乙醇浸泡24h，用蒸餾水洗去乙醇；然后用5%HCl溶液浸泡4h，用蒸餾水洗至中性；再用5%NaOH溶液浸泡4h，用蒸餾水洗至中性。

1.2.6AB-8樹脂對堿處理液與浸泡液黃酮的靜態(tài)吸附-解吸實驗準確稱取處理好的AB-8樹脂5g，置于250m L錐形瓶中，加入處理過的堿處理液與浸泡液各100m L，25℃恒溫振蕩，在12h內(nèi)，每小時取1m L，測黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。然后將吸附有黃酮的樹脂，用80%的乙醇洗脫，25℃恒溫振蕩12h，測定其黃酮含量，AB-8樹脂對堿處理液與浸泡液的吸附量，解吸量與解吸率按下式計算：

式中，Qe為樹脂吸附量（mg/g）；Qd為解吸量（mg/g）；D為解吸率（%）；C0為黃酮初始濃度（mg/g）；Ce為吸附平衡時的黃酮濃度（mg/g）；Cd為解吸后溶液中黃酮濃度（mg/g）；Vi為加入的樣品溶液體積（m L）；Vd解吸液體積（m L）；W為干樹脂重量（g）。

1.2.7AB-8樹脂對堿處理液與浸泡液黃酮的動態(tài)吸附-解吸實驗將預處理好的AB-8樹脂裝入玻璃層析柱（1.6cm×40cm），采用濕法裝柱，使柱床體積為30nm。將調(diào)成最適pH的200m L的堿處理液和浸泡液分別以不同的流速上柱，分段收集流出液，并測定其黃酮含量。吸附液全部流過后，用蒸餾水過柱至流出液無色，然后用80%的乙醇對其進行洗脫，分段收集洗脫液，測定其黃酮含量，繪制洗脫曲線。

1.2.8核桃仁去衣液中核桃黃酮回收率與純度的測定將堿處理液與浸泡液按最佳工藝上柱洗脫，收集洗脫液，測定黃酮濃度，蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，計算黃酮的回收率和純度。

其中，C0為上樣黃酮濃度（mg/m L）；C1為洗脫液中黃酮濃度（mg/m L）；V0為上樣溶液體積（m L）；V1為洗脫液體積（m L）；G為黃酮提取物干重（mg）。

1.2.9堿處理液與浸泡液黃酮體外抗氧化活性測定

1.2.9.1DPPH自由基清除能力［15］將2m L不同濃度的堿處理液與浸泡液樣品加入到2m L 0.1mol/L DPPH溶液中（95%乙醇配制），混合均勻，然后在暗室中振蕩60min，在517nm處測得吸光值A1，樣品液與95%乙醇溶液為空白記A0，DPPH與95%乙醇的混合液為A2。清除率計算公式為：

1.2.9.2超氧陰離子（O2-·）自由基清除活性采用鄰苯三酚自氧化法［16］。吸取不同濃度的樣品溶液1m L，加入4m L pH8.2 Tris-HCl緩沖液中，25℃水浴20m in，然后加入1m L鄰苯三酚溶液，反應5m in，加入1m L 8.0mol/L的HCl溶液終止反應，在325nm處測吸光值Ai，以去離子水代替樣品液為空白，測定吸光值Ap。按下式計算清除率：

1.2.9.3羥自由基（·OH）清除能力的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［17］，取0.75mmol/L的鄰二氮菲溶液1m L于試管中，依次加入0.2mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液2m L、蒸餾水1m L、0.75mmol/L硫酸亞鐵液1m L，充分混勻，然后加入不同濃度樣品溶液1m L與0.01%的H2O21m L，于37℃下恒溫反應60min，于536nm測其吸光度記為A1。用等體積蒸餾水代替樣品溶液，測得吸光值A2。用等體積蒸餾水代替樣品溶液，等體積蒸餾水代替0.01%雙氧水，測得吸光值A3。羥自由基清除能力的計算公式如下：

1.2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有實驗均重復3次，結果所列數(shù)據(jù)是3次重復的平均值。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行多重差異分析（p＜0.05）。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線的回歸方程為Y=0.0096X+0.0191，R2=0.9906。表明蘆丁標準曲線在0～90μg/m L范圍內(nèi)具有良好的線性關系。

2.2樣品中黃酮的含量及AB-8樹脂的靜態(tài)吸附解吸結果

表1　廢液中黃酮含量與靜態(tài)吸附及解吸結果Table 1　Flavonoid contentofwastewater and resultof static adsorption and desorption of AB-8 resin

由表1可知，堿處理液與浸泡液中黃酮的含量分別可達0.178%與0.105%。由于堿處理液與浸泡液來源廣泛，因此，具有較好的回收潛力。并且，一種好的樹脂，不但要有良好的吸附能力，還要有好的解吸能力［18］。從表1中可以看出，AB-8樹脂對其吸附效果和解吸效果良好。

2.2.1AB-8樹脂的靜態(tài)吸附動力學特征通常在達到吸附飽和之前，黃酮的吸附能力隨著吸附時間的延遲而持續(xù)增長［19］。由圖1可以看出，堿處理液在吸附4h后，AB-8樹脂的吸附量隨著時間的增加變化很小，即說明樹脂基本達到吸附平衡。浸泡液在吸附3h后，樹脂的吸附量基本達到吸附平衡。因此，堿處理液與浸泡液采用的靜態(tài)吸附時間分別為4h與3h。

圖1　AB-8樹脂吸附黃酮的動力學曲線Fig.1　Adsorption kinetics curves for flavonoid on AB-8 resin

2.2.2pH對靜態(tài)吸附作用的影響溶液的pH作為一個重要參數(shù)影響著樹脂對其的吸附效果，pH影響溶質(zhì)的離子化程度，從而影響溶質(zhì)和溶劑之間的親和力［20］。從表2可以看出，隨著pH的降低，AB-8樹脂對堿處理液與浸泡液黃酮的吸附量逐漸升高。其原因可能是黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，故要達到良好的吸附效果，必須在酸性或偏酸性條件下進行，在此條件下，黃酮類物質(zhì)呈分子狀態(tài)被吸附，吸附量大［21］。同時從企業(yè)角度考慮，堿處理液與浸泡液pH的改變，意味著投入成本的增加。因此，綜合考慮選擇pH分別為7（堿處理液）和6（浸泡液）作為最適pH。

表2　pH對靜態(tài)吸附作用的影響Table 2　Effectof pH values to static adsorption

2.2.3動態(tài)泄露曲線通常當流出液中黃酮濃度達到上樣液中黃酮濃度的1/10時，認為已經(jīng)發(fā)生泄漏［22］。將堿處理液與浸泡液分別通過AB-8樹脂層析柱，上樣速度為1m L/m in，分段收集并測定黃酮濃度。由圖2可知，隨著上樣液體積的增加，流出液中黃酮含量也逐漸提高，即樹脂對黃酮的吸附效果隨上樣體積的增加而下降。因此，選擇50m L和90m L分別作為堿處理液與浸泡液的上樣量。

圖2　吸附泄露曲線Fig.2　Adsorption leakage curve of flavonoid

表3　上樣流速吸附效果的影響Table 3　Effect of the sample flow rate on adsorption

2.2.4上樣流速的選擇由表3可知，隨著上樣液流速的增加，AB-8樹脂對黃酮的吸附量逐漸下降。原因是黃酮溶液越慢通過樹脂柱，越能和樹脂充分接觸，從而提高吸附效果，隨著流速的增大，吸附量就會降低［23］。從工業(yè)化生產(chǎn)成本上考慮，為了縮短工藝時間，有保證工藝效果，因此選擇上樣流速為1m L/m in。

2.2.5洗脫液體積對黃酮吸附效果的影響按上述實驗得到的最佳條件，將堿處理液和浸泡液分別上柱，吸附飽和后，用80%的乙醇洗脫，分段收集洗脫液。從圖3可以看出，用5BV的80%乙醇洗脫可以將絕大部分黃酮從樹脂上洗脫下來。

圖3　洗脫曲線Fig.3　The desorption curve of flavonoid

2.3核桃去衣液中核桃黃酮回收率和純度測定

表4　核桃黃酮的回收率及純度Table 4　Recovery and purity ofwalnut flavonoid

陳全斌等采用磨漿法研究了從生產(chǎn)葛根淀粉廢水中回收黃酮的最佳工藝，且在該條件下，黃酮純度為18.94%［24］。而本實驗從兩種廢液中得到黃酮純度為61.35%～74.16%（如表4所示），結果明顯高于前者。

2.4抗氧化活性測定結果

將回收得到的干燥物配制成不同濃度的溶液用于體外抗氧化活性測定，并與天然抗氧化劑VC比較，確定其抗氧化活性的強弱。

2.4.1DPPH自由基清除能力對DPPH自由基的清除能力是評價物質(zhì)是否具有抗氧化活性的指標之一。核桃黃酮清除DPPH自由基的結果見圖4。由圖4可知，浸泡液與堿處理液核桃黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，分析得到VC與兩種樣品對DPPH自由基IC50值分別為：2.209、1.460（浸泡液）、1.911μg/m L（堿處理液），而李鳳霞等研究薇菜黃酮類化合物對DPPH自由基的IC50為4.95μg/m L［25］。而在本實驗堿處理液和浸泡液黃酮化合物對DPPH自由基的IC50明顯低于前者。DPPH法體外抗氧化能力依次為：浸泡液核桃黃酮＞堿處理液核桃黃酮＞VC，但最高清除率VC則略高于兩種處理液。

圖4　核桃黃酮和VC對DPPH自由基清除率Fig.4　Scavenging rate ofwalnut flavonoid and Vitamin c on DPPH radical

2.4.2超氧陰離子自由基清除能力在鄰苯三酚體系中，鄰苯三酚的自身氧化速度較快，加入純化液后，由于黃酮類化合物含有活潑的3’和4’位酚羥基，能提供活潑的氫，從而阻斷自由基反應。因此，抗氧化時通過供氫來完成清除超氧陰離子的目的［26］。由圖5可知，隨著堿處理液與浸泡液核桃黃酮和VC濃度的增加，其對超氧陰離子自由基清除率也均呈上升趨勢。但VC清除超氧陰離子的能力明顯優(yōu)于核桃黃酮，當濃度為0.8μg/m L時，VC對超氧陰離子的清除率達到90%左右。通過SPSS數(shù)據(jù)分析，得到VC與兩種樣品對DPPH自由基IC50值分別為3.376、4.391（浸泡液）、6.294mg/m L（堿處理液）。在此濃度下，鄰苯三酚法體外抗氧化能力依次為：VC＞浸泡液核桃黃酮＞堿處理液核桃黃酮。

圖5　核桃黃酮和VC對超氧陰離子自由基清除率Fig.5　Scavenging rate ofwalnut flavonoid and Vitamin c on superoxide anion radical

圖6　核桃黃酮和VC對羥基自由基清除率Fig.6　Scavenging rate ofwalnut flavonoid and Vitamin c on Hydroxyl radical

2.4.3羥基自由基清除能力羥基自由基是比較難清除的自由基，許多抗氧化劑對其的清除能力都較差。已有研究指出山核桃仁對羥基自由基清除率較強［27］。由圖6可知，堿處理液與浸泡液核桃黃酮和VC濃度的增大均對羥基自由基的清除率起促進作用，當濃度為1.6mg/m L時，堿處理液與浸泡液核桃黃酮對羥基自由基的清除率分別為85.41%、90.07%，略低于VC（98.12%）。經(jīng)過SPSS數(shù)據(jù)分析，得到VC與兩種樣品對DPPH自由基IC50值分別為0.372、0.415（浸泡液）、0.472mg/m L（堿處理液）。表明核桃堿處理液與浸泡液核桃黃酮與VC之間的差距較小，具有作為清除羥基自由基抗氧化劑的潛力。

由以上抗氧化分析可以看出，在一定的濃度范圍內(nèi)，核桃浸泡液的抗氧化能力優(yōu)于核桃堿處理液，其原因可能是堿液的濃度偏高，加熱時破壞了黃酮類化合物的母核［28］。多數(shù)研究表明，堿性條件下，蘆丁與兒茶素易被氧化分解，同時槲皮素的3′、3′、4三個位置上的羥基對堿敏感，易發(fā)生自氧化作用，從而影響其清除自由基能力［29-31］。此外，堿液浸出的雜質(zhì)較多不利于純化［32］，從而導致堿處理液中核桃黃酮純度降低，而且在相同體積條件下，堿處理液與浸泡液相比，其抗氧化能力降低。

3　結論

核桃仁去衣廢液中黃酮類化合物含量豐富，本實驗采用大孔樹脂對其進行回收。結果表明，最佳工藝條件為：吸附時間為3～4h，上樣pH為6～7，上樣流速為1m L/min，洗脫液體積為5BV 80%的乙醇，最后得到黃酮的純度為61.35%～74.16%。此外，核桃仁去衣液中的黃酮具有較強的體外抗氧化活性，有較好的開發(fā)利用前景。利用核桃仁去衣液中的黃酮類物質(zhì)，采用大孔樹脂法對廢液中有價值的物質(zhì)回收利用，不但能得到較高價值的副產(chǎn)品，還可以減輕對環(huán)境的污染。

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Recovery ofwalnut flavonoid in peeling wastewater ofwalnut kernel and its antioxidative activity

SONG Hao1，ZHAO Sheng-lan2，CHEN Chao-yin1，*，LIRu-rong3，ZHANG Tian-cai1，WUW an-xing1，SHIDan-dan1

（1.Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650200，China；3.Dali YangbiWalnut Co.，Ltd.，Dali672500，China）

The paper w ith soaking and lye from p roduction p rocess of walnutm ilk as raw material，stud ied the systematically the craft of purification ofwalnut flavonoid by AB-8 macroporous resin.The result ind icated that AB-8 macroporous resin possessesed the strong ability of purification for the peeling wastewater of walnut kernel.Under the op tim ized cond itions，the purity and recovery of walnut flavonoid ranged from 61.35%，81.73%to 74.16%，86.51%，respectively.The results also showed that the walnut flavonoid had strong scavenging capabilities.Walnut flavonoid from soaking and lye on DPPH·，superoxide anion free rad icals and hyd roxyl w ith IC50values ranged from 1.460μg/m L，4.391mg/m L，0.415mg/m L to 1.911μg/m L，6.294mg/m L，0.472mg/m L，respectively.It was conc luded that soaking and lye of walnut kernelwas a good source for p roducing walnut flavonoid and an ideally naturalantioxidant.

soaking；lye；flavonoid；antioxidative activity

TS255.6

A

1002-0306（2015）06-0094-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.013

2014-06-04

宋浩（1990-），男，碩士研究生，研究方向：生物資源開發(fā)。

陳朝銀（1957-），男，博士，教授，研究方向：藥食資源開發(fā)。

云南省科技計劃項目（2009EB081，2011AB006）；科技部支撐計劃項目（20112011BAD46B00）。