四川部分地區(qū)鴨蛋沙門氏菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

劉少文，郭春華，馬曉龍，柏　雪，張正帆，李文娟

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

四川部分地區(qū)鴨蛋沙門氏菌的分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

劉少文，郭春華，馬曉龍，柏雪*，張正帆，李文娟

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

為了解四川部分地區(qū)不同飼養(yǎng)方式的鴨蛋沙門氏菌（Salmonella spp.）污染與耐藥情況，本實(shí)驗(yàn)采集了集約化養(yǎng)殖（50枚）和農(nóng)戶散養(yǎng)（50枚）的100枚鴨蛋，采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2010對其蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行沙門氏菌檢測，同時進(jìn)行血清型鑒定和藥物敏感實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)鴨蛋的蛋殼和內(nèi)容物沙門氏菌污染率分別為28%和30%；集約化養(yǎng)殖的蛋殼污染率為24%，蛋內(nèi)容物無污染。血清凝集實(shí)驗(yàn)共檢測出8種血清型，流行菌株為鼠傷寒沙門氏菌（34.1%），其次為腸炎沙門氏菌（22%）和鴨源沙門氏菌（14.6%），其余菌株檢出率較低。分離得到的41株沙門氏菌對青霉素（100%）、氨芐西林（87.80%）、阿莫西林（75.61%）、四環(huán)素（73.17%）耐藥率較高，對鏈霉素呈現(xiàn)中等敏感，對其余抗生素表現(xiàn)不同程度的耐藥。研究結(jié)果表明四川地區(qū)鴨蛋沙門氏菌污染情況和耐藥性已較為嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)沙門氏菌流行病學(xué)監(jiān)測和抗生素的使用監(jiān)管。

鴨蛋，沙門氏菌，分離，鑒定，耐藥性

沙門氏菌（Salmonella spp.）是腸桿菌科中的一個大屬，屬革蘭氏陰性菌，生化特性與抗原結(jié)構(gòu)相似，廣泛存在于自然界中［1］。沙門氏菌是主要的食源性致病菌之一，對人和動物危害極大?？蓪?dǎo)致鴨傳染性漿膜炎、鴨病毒性肝炎、卵巢炎、仔豬副傷寒、羊流產(chǎn)等多種動物疾病，人一旦攝入含大量沙門氏菌的動物源性食品后會引起腸胃炎、腹瀉等［2-3］。全世界因沙門氏菌造成的食物中毒和食源性疾病案例居高不下。同時，畜牧業(yè)長期以來大劑量不合理使用抗生素，也使沙門氏菌的耐藥性日趨增強(qiáng)。研究表明，各國相關(guān)部門紛紛對食源性致病菌的耐藥性進(jìn)行了監(jiān)測，該菌的多重耐藥率已從上世紀(jì)90年代的20%～30%增加到了本世紀(jì)初的70%［4］。目前國內(nèi)有關(guān)雞蛋沙門氏菌的檢測較多，而鴨蛋沙門氏菌檢測較少。因此，本實(shí)驗(yàn)對來自四川部分地區(qū)集約化養(yǎng)殖和農(nóng)戶散養(yǎng)的共100枚鴨蛋蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行沙門氏菌檢測與鑒定，同時進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。旨在了解2014年四川地區(qū)鴨蛋沙門氏菌的污染情況和耐藥情況，為該地區(qū)食品安全和沙門氏菌的耐藥性安全評價提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鴨蛋2014年3月至2014年5月，從四川省成都市等10個地區(qū)隨機(jī)采集來自集約化養(yǎng)殖（50枚）和農(nóng)戶散養(yǎng)（50枚）的100枚鴨蛋，采集的每枚樣品蛋分別放入無菌食品塑料袋內(nèi)，4h內(nèi)送回西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，立即檢測蛋殼表面和蛋內(nèi)容物沙門氏菌污染情況；緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、三糖鐵瓊脂（TSI）、桿菌科生化鑒定培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管均由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)；沙門氏菌屬診斷血清由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；藥敏試紙片（青霉素類：青霉素、阿莫西林、氨芐西林，氨基糖苷類：慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素，喹諾酮類：洛美沙星、諾氟沙星、環(huán)丙氟哌酸，四環(huán)素類：四環(huán)素。） 均由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋

由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱由上?？茖W(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺由蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2檢測方法

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》方法對100枚鴨蛋的蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行生化檢測。藥敏實(shí)驗(yàn)參照WHO推薦的K-B瓊脂紙片擴(kuò)散法，藥敏結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)作出判斷。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1鴨蛋沙門氏菌污染情況

表1　鴨蛋沙門氏菌污染情況Table 1　The duck eggs，contamination of Salmonella

不同檢測部位的鴨蛋沙門氏菌檢出結(jié)果見表1，由表1可知，來自集約化養(yǎng)殖的鴨蛋內(nèi)容物未檢出沙門氏菌，蛋殼檢出率為24%；來自農(nóng)戶散養(yǎng)的鴨蛋蛋殼及內(nèi)容物檢出率均高于集約化養(yǎng)殖的鴨蛋，分別為28%和30%，且二者無顯著差異（p=1.00）。

趙磊等［5］檢測發(fā)現(xiàn)北京市售集約化雞蛋的蛋殼表面沙門氏菌平均污染率為15%，內(nèi)容物為3.3%。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致。這可能是因?yàn)榍莸皬男怪城划a(chǎn)出，被糞便污染，沙門氏菌可能主要寄生在蛋殼表面，故使得禽蛋表面帶菌率較高。但同時本研究發(fā)現(xiàn)來自農(nóng)戶散養(yǎng)型鴨蛋蛋殼與內(nèi)容物沙門氏菌污染率均較高。游洋等［6］對某地區(qū)來自農(nóng)貿(mào)市場和超市的市售鮮鴨蛋進(jìn)行沙門氏菌檢測，結(jié)果顯示在該地區(qū)抽樣的15批次鮮鴨蛋中，內(nèi)容物未檢測出沙門氏菌，蛋殼污染率為13.3%。本研究結(jié)果與其相比，差異較大。分析原因可能是市售鮮鴨蛋經(jīng)過某些消毒處理，而本研究采集的散養(yǎng)型鴨蛋全部來自農(nóng)戶，樣品采集時發(fā)現(xiàn)農(nóng)戶儲存的鴨蛋大多表面不清潔，污漬較多，部分鴨蛋可能儲存時間較長，加之未經(jīng)過任何消毒處理。因此，這類鴨蛋極易受沙門氏菌的污染，且污染率較高。趙瑞宏等［7］對皖南山區(qū)散養(yǎng)土雞蛋蛋殼及內(nèi)容物進(jìn)行了沙門氏菌檢測，結(jié)果表明蛋殼檢出率為27.5%，內(nèi)容物蛋黃檢出率2.5%，蛋清為5.0%。雞蛋內(nèi)容物沙門氏菌污染率較低可能是因?yàn)殡u蛋蛋清中的溶菌酶含量較多，具有較好的殺菌作用［8］。而本實(shí)驗(yàn)中造成散養(yǎng)型鴨蛋內(nèi)容物沙門氏菌污染率較高的可能原因除散養(yǎng)型鴨蛋未經(jīng)任何消毒處理，沙門氏菌可通過氣孔進(jìn)入內(nèi)容物外，還可能是由于鴨蛋內(nèi)容物含溶菌酶較雞蛋少或鴨蛋儲存時間較長而使溶菌酶含量下降所致［9］。因此，禽蛋在銷售和食用前應(yīng)保持蛋殼表面清潔，作合理的消毒處理，同時注意保質(zhì)期。

2.2不同飼養(yǎng)方式對鴨蛋沙門氏菌污染的影響

蛋殼或蛋內(nèi)容物任一部位檢出沙門氏菌均視為陽性樣品。不同飼養(yǎng)方式對鴨蛋沙門氏菌污染的影響見表2。由表2可知，集約化養(yǎng)殖與農(nóng)戶散養(yǎng)的鴨蛋沙門氏菌檢出率分別為24%和48%，農(nóng)戶散養(yǎng)檢出率顯著高于集約化養(yǎng)殖（p=0.021）。

表2　不同飼養(yǎng)方式的鴨蛋沙門氏菌污染情況Table 2　The duck eggs，contamination of Salmonella with different rearingmethods

尹曉楠等［10］對北京地區(qū)散養(yǎng)雞蛋進(jìn)行沙門氏菌檢測，結(jié)果表明該地區(qū)散養(yǎng)雞蛋污染率為40%。陳飛等［11］對江蘇省不同地區(qū)的集約化雞蛋進(jìn)行沙門氏菌檢測，結(jié)果顯示該地區(qū)雞蛋沙門氏菌污染率為18.24%。以上研究表明農(nóng)戶散養(yǎng)型禽蛋更易受到沙門氏菌侵染。除上述可能原因外，還可能與禽蛋保存條件較差、散養(yǎng)母鴨產(chǎn)蛋環(huán)境不清潔易于沙門氏菌的滋生，從而導(dǎo)致垂直傳播等因素有關(guān)［12］。本研究采集的集約化鴨蛋均來自農(nóng)貿(mào)市場和超市，部分農(nóng)貿(mào)市場環(huán)境潮濕，貨物流通量較大，鴨蛋在銷售過程中不可避免地感染沙門氏菌。此外，集約化鴨蛋蛋殼表面可能經(jīng)過某些消毒處理，但大多數(shù)鴨蛋仍然不清潔，表面污垢清晰可見。故這類鴨蛋內(nèi)容物受到沙門氏菌的污染可能性較大。因此，在飼養(yǎng)家禽時，應(yīng)該保證飼養(yǎng)環(huán)境以及孵化、產(chǎn)蛋環(huán)境的干凈清潔，定期消毒。除此之外，潔凈、通風(fēng)和有序的銷售市場也至關(guān)重要。

2.3血清型鑒定

100枚鴨蛋蛋殼及內(nèi)容物共檢測出41株沙門氏菌，8種血清型，流行菌株為鼠傷寒沙門氏菌，占分離菌株總數(shù)的34.1%。此外，腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌比例較高，分別為22.0%和14.6%。其余結(jié)果見表3。

表3　100枚鴨蛋蛋殼及內(nèi)容物沙門氏菌血清型鑒定結(jié)果Table 3　The results of identification of the Salmonella serotype from 100 duck eggshells and its contents

鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌、白痢沙門氏菌（SalmonellaPullorum）等具有廣泛的宿主性，能夠引起人畜共患，是鴨沙門氏菌病的主要病原菌。余曉龍等［13］在2012年對四川省7個地區(qū)規(guī)?；唸鲋幸伤粕抽T氏菌病的患病鴨中展開了血清型調(diào)查，結(jié)果共分離出6種血清型，流行菌株為鼠傷寒沙門氏菌，占分離菌株的37.5%，腸炎沙門氏菌占14.6%，本研究結(jié)果與其一致。而程平等［14］在2013年對四川、重慶地區(qū)部分鴨場的死胚、弱雛進(jìn)行沙門氏菌檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌檢出率較低，均不超過3%，本研究的其他血清型未檢出。這說明時間、地點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)材料等因素可能對沙門氏菌血清型影響較大。但值得注意的是雷丁沙門氏菌很少在禽蛋中檢測出來，而本研究在集約化鴨蛋中檢測出該菌屬，說明目前畜牧業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境與以前相比有所改變，可能有利于一些不常見的血清型生長。這提示沙門氏菌的流行病學(xué)發(fā)生了變化，應(yīng)加強(qiáng)跟蹤監(jiān)管。

2.4耐藥性

采用肉湯微量稀釋法對上述檢出的沙門氏菌進(jìn)行抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，41株鴨源性沙門氏菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素耐藥率較高，分別為100%、87.80%、75.61%、73.17%；鏈霉素的中等敏感率較高，為75.61%。對其余抗生素的耐藥率在10%以下。

周佳等［15］對四川省動物性食品源沙門氏菌的耐藥性監(jiān)測與分析中顯示，分離到的沙門氏菌對青霉素類、氨芐西林（60.53%）和阿莫西林（56.58%）耐藥率較高，本研究結(jié)果與其相比，耐藥率相對偏高。趙愛華等［16］在2010～2011年江蘇泰州周邊地區(qū)分離的腸炎沙門氏菌對氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率分別為74.2%和64.5%。但與廖成水等［17］報道的61.22%和19.39%相比差異較大。除上述幾種抗生素外，本研究中分離到的沙門氏菌對其余抗生素也表現(xiàn)不同程度耐藥性。沙門氏菌耐藥性增加可能與細(xì)菌耐藥性存在地區(qū)差異、抗菌藥物廣泛使用、菌體本身因素（產(chǎn)生耐藥質(zhì)?；蛲蛔儯┑纫蛩赜嘘P(guān)。

表4　鴨源性沙門氏菌耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　The results of drug resistance of the Salmonella from duck eggs

3　結(jié)論

本研究對四川地區(qū)動物源性沙門氏菌的污染情況和血清型作了較為系統(tǒng)的調(diào)查，并對沙門氏菌耐藥性進(jìn)行了抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)集約化養(yǎng)殖的鴨蛋內(nèi)容物未檢測出沙門氏菌，蛋殼污染率顯著（p=0.01）高于內(nèi)容物；農(nóng)戶散養(yǎng)型鴨蛋蛋殼與內(nèi)容物沙門氏菌污染率均較高，且二者無顯著差異。同時，農(nóng)戶散養(yǎng)型鴨蛋沙門氏菌污染率明顯高于集約化鴨蛋。本研究共分離出8種沙門氏菌血清型，流行菌株為鼠傷寒沙門氏菌，其次為腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌。分離得到的沙門氏菌對一些抗生素如青霉素類、四環(huán)素類等耐藥性較嚴(yán)重，對其余抗生素存在不同程度的耐藥性。

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Isolation，identification and drug susceptibility experimentof Salmonella from duck eggs in some parts of Sichuan

LIU Shao-wen，GUO Chun-hua，MA Xiao-long，BAIXue*，ZHANG Zheng-fan，LIW en-juan
（College of life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

In order to understand the Salmonella spp.contam ination and d rug resistance from duck eggs w ith different rearing methods in some parts of Sichuan，the experiment detected Salmonella in eggshell and its contents w ith the national standard GB 4789.4-2010 detection method after collecting 100 duck eggs from intensive farm s（50）and farmers backyard（50），while doing serotype identification and d rug suscep tibility testing.The results showed that the contam ination rates of free-range egg shellwere 28%and contents were 30%.Meanwhile，the contam ination rates of intensive farm ing eggshellwere 24%and w ith no Salmonella in the contents of intensive farm ing egg.Serum agg lutination test detected outof 8 serotypes，S.typhimurium（34.1%）was most p revalent.Besides，S.enteritid is（22%）and S.anatum（14.6%）were higher than other strains.The 41 isolated Salmonella had high d rug resistance to Penicillin（100%），Amp icillin（87.80%），Amoxicillin（75.61%），Tetracyc line（73.17%），showed moderate sensitivity to strep tom ycin and suggested that the Salmonella had different deg rees of resistance to the rest of the antibiotics.These find ings ind icated that the Salmonella from duck eggs contam ination and d rug resistance had become more serious in Sichuan region，therefore，the ep idem iological surveillance of salmonella should be strengthened and the use of antibiotics should be regulated，too.

duck eggs；Salmonella；isolation；identification；d rug resistance

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0072-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.007

2014-06-23

劉少文（1990-），男，碩士研究生，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。

柏雪（1985-），女，在讀博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動物營養(yǎng)研究。

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（CX2014SZ79）。