組織干細(xì)胞的培養(yǎng)及定向分化實(shí)驗(yàn)

邵志華， 許 潔， 沙繼宏， 呂立夏， 徐 磊，李 姣， 賈 松， 李思光

(同濟(jì)大學(xué)a.醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心;b.醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海 200092)

0 引言

科學(xué)思維能力和解決問題的能力是全球醫(yī)學(xué)教育的基本要求之一，也是我國進(jìn)行素質(zhì)教育與卓越醫(yī)師培養(yǎng)的目標(biāo)之一[1-3]。而實(shí)驗(yàn)教學(xué)能促進(jìn)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題素質(zhì)的形成，引導(dǎo)他們養(yǎng)成科學(xué)思維和團(tuán)結(jié)協(xié)作精神，因此是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的有效途徑[4-5]。隨著實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的推進(jìn)，高校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)已經(jīng)突破了傳統(tǒng)單一的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑⒘司C合型、設(shè)計型和開放型等多種形式的實(shí)驗(yàn)，充分發(fā)揮了實(shí)驗(yàn)教學(xué)培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力和實(shí)踐能力的作用[6-7]。細(xì)胞培養(yǎng)作為醫(yī)學(xué)研究中普遍應(yīng)用的基本技術(shù)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)本科及研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，其在一定程度上促進(jìn)了學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)[8-10]。然而，目前的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)教學(xué)還有許多不足之處。如在實(shí)驗(yàn)方法方面，往往為孤立的實(shí)驗(yàn)或多個實(shí)驗(yàn)拼合而成，割裂了一般科學(xué)實(shí)驗(yàn)的過程。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容方面，常常注重經(jīng)典，缺乏經(jīng)典與前沿的結(jié)合;注重基礎(chǔ)，缺乏基礎(chǔ)與臨床實(shí)踐的結(jié)合;注重傳承，缺乏科研成果的轉(zhuǎn)化教學(xué)。

干細(xì)胞(Stem Cells，SC)是一類具有自我更新及分化潛能的細(xì)胞，在疾病的細(xì)胞治療和器官移植方面有著巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力，是世界醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[11-12]。因其重大的理論意義和無可估計的實(shí)際價值，高校特別是醫(yī)學(xué)院校應(yīng)積極開展干細(xì)胞教學(xué)[13]。隨著干細(xì)胞研究熱潮的興起[14]，同濟(jì)大學(xué)成立了干細(xì)胞研究中心和臨床轉(zhuǎn)化中心，取得了一些研究成果，特別是在干細(xì)胞的培養(yǎng)及分化方面積累了一些經(jīng)驗(yàn)。

針對目前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題，結(jié)合本校的辦學(xué)定位和專業(yè)特色，我們設(shè)計并開展了“組織干細(xì)胞的培養(yǎng)及定向分化”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，并在醫(yī)學(xué)院5年制和7年制本科生開展。該實(shí)驗(yàn)為一個完整的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，能使學(xué)生親歷科學(xué)實(shí)驗(yàn)的全過程，在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力和解決問題的能力，對學(xué)生了解科學(xué)發(fā)展動態(tài)，掌握前沿科學(xué)知識和實(shí)驗(yàn)技能具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計與實(shí)施

1.1 組織干細(xì)胞的選擇

根據(jù)細(xì)胞來源，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞。雖然胚胎干細(xì)胞具有萬能性，能分化為幾乎所以的組織細(xì)胞，但是因其來源于胚胎，具有倫理問題。而組織干細(xì)胞存在于成人各種組織和器官，不存在倫理問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)是一群來源于骨髓的組織干細(xì)胞，因其分離方法簡便，體外可大量擴(kuò)增，細(xì)胞存活率高，便于自體移植及調(diào)控，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種細(xì)胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞治療及組織再生及修復(fù)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[15]。鑒于此，我們選擇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。

在誘導(dǎo)分化方面，考慮脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化時間短(7～11 d)，分化效率高(80% ～90%)，容易鑒定(油紅O染色10 min)等優(yōu)點(diǎn)[16-17]，所以我們選擇BMSCs誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞并用油紅O染色鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)安排及流程

本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容包括原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、定向分化和脂肪細(xì)胞染色鑒定。為了培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)習(xí)慣和團(tuán)隊(duì)合作精神，實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行(2個同學(xué)一組)，每次實(shí)驗(yàn)完畢后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，包括細(xì)胞培養(yǎng)記錄和實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄。具體安排如下(見圖1):

第1次，分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)48 h。

第2次，觀察細(xì)胞形態(tài)及密度，傳代培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)4～6 h后，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

第3次，觀察細(xì)胞形態(tài)、密度及生長特點(diǎn)，換液，37°C培養(yǎng)72 h。

第4次，油紅O染色鑒定，統(tǒng)計分化效率。

圖1 實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)流程

1.3 實(shí)驗(yàn)考核體系

實(shí)驗(yàn)考核是教學(xué)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，為了取得良好的效果，對實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果進(jìn)行綜合考核并給出合理的成績，是有效地提高教學(xué)質(zhì)量的保證。一種“全過程-多方式-立體化”的評價體系，能確切、客觀、全面地評定學(xué)生的學(xué)習(xí)能力[18]。因此，我們從以下4個環(huán)節(jié)全面考核學(xué)生，以達(dá)到促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的目的。具體考核內(nèi)容如下:

(1)動手參與程度和團(tuán)隊(duì)合作精神。通過有效的團(tuán)隊(duì)協(xié)作，培養(yǎng)學(xué)生溝通和交流的能力。

(2)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和結(jié)果。規(guī)范實(shí)驗(yàn)記錄，設(shè)計細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)記錄表，要求每次觀察細(xì)胞后進(jìn)行拍照，并及時對結(jié)果進(jìn)行描述。目的是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度及數(shù)據(jù)信息的管理能力。

(3)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的故障處理。要求以學(xué)生為主體，教師為指導(dǎo)的原則，通過學(xué)生自主學(xué)習(xí)、自主分析，最終自主解決問題。達(dá)到調(diào)動學(xué)習(xí)的積極性和主動性，形成好的學(xué)習(xí)方法和習(xí)慣，培養(yǎng)其發(fā)現(xiàn)問題及解決問題的能力。

(4)實(shí)驗(yàn)報告完成情況。要求小組撰寫實(shí)驗(yàn)論文，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生分析和整理數(shù)據(jù)的能力。

2 實(shí)驗(yàn)建設(shè)效果

2.1 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目安全、穩(wěn)定、可行

經(jīng)過嘗試和摸索，建立了以細(xì)胞培養(yǎng)為主線，組織干細(xì)胞培養(yǎng)為特色的綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，編寫了實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，并在臨床醫(yī)學(xué)5/7年制本科生中連續(xù)開展了3年，每組均可獲得分化的脂肪細(xì)胞(見圖2)，效率穩(wěn)定在60% ～80%左右。實(shí)驗(yàn)使用的BMSCs來源于生物安全級大鼠，不涉及倫理問題，沒有生物安全隱患。實(shí)驗(yàn)不涉及強(qiáng)腐蝕、毒性試劑和具潛在危險的儀器。因此，此實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目安全、穩(wěn)定、可行。

圖2 BMSCs的培養(yǎng)及脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

2.2 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為綜合型實(shí)驗(yàn)

以往的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)往往為孤立的實(shí)驗(yàn)或多個實(shí)驗(yàn)的拼合，缺乏系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性，不能真實(shí)地體現(xiàn)科學(xué)實(shí)驗(yàn)的過程。為了培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，適應(yīng)當(dāng)代醫(yī)學(xué)生的培養(yǎng)目標(biāo)，我們設(shè)計了此綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，具有系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性。

實(shí)驗(yàn)是以細(xì)胞培養(yǎng)為中心的綜合實(shí)驗(yàn)，涉及組織干細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)，干細(xì)胞的分化和組織化學(xué)檢測4項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)及分子生物學(xué)、生物化學(xué)、組織化學(xué)等方面的理論知識。采用原代培養(yǎng)—傳代培養(yǎng)—定向分化—細(xì)胞鑒定4個連續(xù)的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)際的科學(xué)研究一致，為一個完整的科學(xué)實(shí)驗(yàn)過程，具有系統(tǒng)性、連續(xù)性和完整性。由于4個實(shí)驗(yàn)內(nèi)容環(huán)環(huán)相扣，需要學(xué)生認(rèn)真地完成每一個實(shí)驗(yàn)，直至獲得最終的結(jié)果，因此增加了學(xué)生的動腦、動手機(jī)會，有利于培養(yǎng)學(xué)生的科研思維能力及基本實(shí)驗(yàn)技能，為學(xué)生的科研能力的培養(yǎng)打下較為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.3 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目體現(xiàn)了經(jīng)典與前沿的結(jié)合

以前的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)常常是用傳統(tǒng)的細(xì)胞系進(jìn)行的，如Hela或293細(xì)胞，未能與科學(xué)發(fā)展的前沿結(jié)合，不利于學(xué)生掌握先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)知識和技能。

建設(shè)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是進(jìn)行組織干細(xì)胞的培養(yǎng)、分化和鑒定，而干細(xì)胞因其重大的理論意義和無可估計的實(shí)際價值，目前成為世界科學(xué)界研究的熱點(diǎn)，因此，本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在最經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合前沿理論知識和實(shí)驗(yàn)技能，既傳承了經(jīng)典，又跟上時代的發(fā)展，與培養(yǎng)新時期高素質(zhì)和創(chuàng)新人才的需要相一致。對于學(xué)生了解科學(xué)發(fā)展的動態(tài)，掌握前沿科學(xué)知識和實(shí)驗(yàn)技能具有重要意義。

2.4 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目體現(xiàn)了科研成果的轉(zhuǎn)化教學(xué)

組織干細(xì)胞因其具有多分化潛能，在創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞替代治療、基因治療等方面具有很好的臨床應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景，是目前世界性課題，也是項(xiàng)目所在的教學(xué)團(tuán)隊(duì)主要從事研究的課題之一。其中，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為脂肪細(xì)胞的研究取得了較好的研究成果，分化的脂肪細(xì)胞成熟度高、重現(xiàn)性好、難易程度適中，適合轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目[19]。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在教學(xué)中的順利實(shí)施證明了科研成果的轉(zhuǎn)化可使實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容緊跟學(xué)科技術(shù)的發(fā)展，充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)教學(xué)是實(shí)現(xiàn)科研成果向教學(xué)內(nèi)容轉(zhuǎn)化的主要途徑[19-20]。

3 結(jié)語

細(xì)胞培養(yǎng)為具有百年歷史的經(jīng)典細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)教育中具有重要的作用。而干細(xì)胞具有十分誘人的臨床應(yīng)用前景，是當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)。因此，干細(xì)胞的培養(yǎng)、分離、分化和鑒定是當(dāng)代醫(yī)學(xué)生應(yīng)該了解和掌握的實(shí)驗(yàn)技能。

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上，結(jié)合前沿理論知識和實(shí)驗(yàn)技能，既使學(xué)生掌握了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技能，又使學(xué)生了解學(xué)科發(fā)展的方向，使學(xué)生跟上時代的發(fā)展，體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的前沿性與前瞻性，這與培養(yǎng)新時期高素質(zhì)和創(chuàng)新人才的需要相一致。

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