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    補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤小鼠脾組織Fas蛋白表達(dá)的影響

    2015-10-19 03:11:18孫志彬井歡李璐璐王哲劉春英
    新中醫(yī) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:益氣湯荷瘤空白對(duì)照

    孫志彬,井歡,李璐璐,王哲,劉春英

    1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,遼寧 沈陽110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽110847

    補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤小鼠脾組織Fas蛋白表達(dá)的影響

    孫志彬1,井歡2,李璐璐1,王哲2,劉春英2

    1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,遼寧 沈陽110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽110847

    目的:研究補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤小鼠脾組織中Fas蛋白表達(dá)的影響。方法:建立A549荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn),采用隨機(jī)對(duì)照法將30只BALB/c小鼠分為正常組、空白對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組,除正常組外,余組荷瘤,成功后,每天灌胃相應(yīng)藥物1次,連續(xù)10天后取材。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)脾組織中Fas蛋白的表達(dá);逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)脾組織中Fas的mRNA表達(dá)。結(jié)果:正常組中Fas蛋白在細(xì)胞膜有表達(dá),空白對(duì)照組出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,與正常組比較,F(xiàn)as表達(dá)明顯升高(P<0.01);補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后,F(xiàn)as蛋白表達(dá)減少,與空白對(duì)照組比較,中藥低劑量組、西藥組Fas表達(dá)明顯下降(P<0.05),中藥高劑量組下降最顯著(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組比較,F(xiàn)as表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。與正常組比較,空白對(duì)照組Fas的mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01);經(jīng)補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后,F(xiàn)asmRNA的表達(dá)減少,中藥高劑量組、中藥低劑量組及西藥組與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),而該3組的FasmRNA的表達(dá)與正常組無明顯差異。結(jié)論:補(bǔ)中益氣湯可下調(diào)A549荷瘤小鼠脾臟中Fas蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷。

    補(bǔ)中益氣湯;Fas蛋白;A549細(xì)胞株;脾組織

    Fas是體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的糖蛋白分子,除維持正常生理功能與生存繁殖外,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也有顯著意義[1]。補(bǔ)中益氣湯可用于晚期肺癌的患者,現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明,其中成分非常復(fù)雜,可調(diào)節(jié)免疫功能[2],有改善肺部通氣,治療癌性發(fā)熱,緩解癌性疼痛,調(diào)節(jié)精神狀態(tài)等作用[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究補(bǔ)中益氣湯對(duì)荷瘤小鼠脾組織免疫分子Fas水平的影響,從分子水平探討補(bǔ)中益氣湯調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能從而達(dá)到抗腫瘤效果的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)BALB/c小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證編號(hào):scxk(京)2011-0011;人肺腺癌A549細(xì)胞株由中國醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫提供。

    1.2 儀器與試劑Fas抗體購于武漢博士德(批號(hào):08G02);RIPA裂解液購于北京鼎國(批號(hào):WB-0071);熒光定量PCR儀購于ABI公司。

    1.3 藥物 順鉑注射液(DDP,生產(chǎn)批號(hào)2030132DB山東齊魯醫(yī)藥公司);補(bǔ)中益氣湯方(黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸)購于遼寧省中醫(yī)院。

    1.4 制備補(bǔ)中益氣湯煎劑 根據(jù)《中華人民共和國藥典》中規(guī)定補(bǔ)中益氣湯的用藥劑量(處方:黃芪18 g,白術(shù)、甘草各9 g,陳皮、升麻、柴胡、人參各6 g,當(dāng)歸3 g),并通過《人和動(dòng)物之間按體表面積折算的等效劑量比值表》,計(jì)算出小鼠等效劑量,分設(shè)高、低劑量,即5.82 g/kg(生藥)、1.46 g/kg(生藥)常規(guī)煎煮,煎至終濃度為每毫升含生藥2.33 g,常規(guī)煎煮3次,濃縮成1 kg/L的補(bǔ)中益氣湯煎液,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 動(dòng)物分組與處理BALB/c小鼠30只,隨機(jī)分成5組,每組6只(雌雄各半)。除正常組外,其余小鼠均于腋下注射A549細(xì)胞懸液0.2m L(密度為2×108/L),5天后,觀察小鼠腋下有米粒狀突起,開始用藥。具體用量為:正常組:生理鹽水灌胃,0.5m L/只,每天2次,連續(xù)10天;空白對(duì)照組:生理鹽水灌胃,0.5m L/只,每天2次,連續(xù)10天;中藥低劑量組:低劑量補(bǔ)中益氣湯灌胃,0.5m L/只,每天2次,連續(xù)10天;中藥高劑量組:高劑量補(bǔ)中益氣湯灌胃,0.5m L/只,每天2次,連續(xù)10天;西藥組:順鉑腹腔注射,1.38m g/m2,每天1次,連續(xù)3天。于第10天,灌胃后2 h取材。

    1.6 免疫組化測(cè)定各組脾組織Fas蛋白的表達(dá) 組織塊石蠟包埋后切片,常規(guī)脫蠟至水,EDTA抗原熱修復(fù)(95℃水浴30 min),3%過氧化氫滅活內(nèi)原性過氧化物酶20m in,10%山羊血清封閉20m in,滴加一抗,4℃冰箱過夜,取出后恢復(fù)至室溫,二抗作用30m in,DAB顯色,自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,自來水沖洗返藍(lán),脫水,中性樹膠封片。結(jié)果判定:以細(xì)胞核周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各自的平均光密度值,作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。

    1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法測(cè)定各組脾組織Fas的mRNA表達(dá) 按照試劑盒說明書采用Trizol一步法,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Fas引物序列:上游引物5'-GAATG CAAGGGACTGATAGC-3',下游引物5'-TGGTTCGTGTGCA AGGCTC-3';內(nèi)參序列:上游引物5'-CCAACCGTGAAAAG ATGACC-3',下游引物5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3';25μL反應(yīng)體系,預(yù)變性94℃1m in,退火60℃1m in,延伸72℃2m in,循環(huán)35次。余按試劑盒說明進(jìn)行操作,用反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的吸光度比值表示該基因表達(dá)強(qiáng)度。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組Fas蛋白表達(dá)比較 見表1。正常組中Fas蛋白在細(xì)胞膜有表達(dá),空白對(duì)照組出現(xiàn)較多棕黃色顆粒,與正常組比較,F(xiàn)as表達(dá)明顯升高(P<0.01);補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后,F(xiàn)as蛋白表達(dá)減少,與空白對(duì)照組比較,中藥低劑量組、西藥組Fas表達(dá)明顯下降(P<0.05),中藥高劑量組下降最顯著(P<0.01)。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組比較,F(xiàn)as表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。

    2.2 各組Fas mRNA表達(dá)比較 見圖1。與正常組比較,空白對(duì)照組Fas的m RNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01);經(jīng)補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后,F(xiàn)as m RNA的表達(dá)減少,中藥高劑量組、中藥低劑量組及西藥組與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),而該3組的Fasm RNA的表達(dá)與正常組無明顯差異。

    表1 各組Fas蛋白表達(dá)比較±s)

    表1 各組Fas蛋白表達(dá)比較±s)

    與正常組比較,①P<0.05;與空白對(duì)照組比較,②P<0.01,③P<0.05

    組別正常組空白對(duì)照組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 Fas蛋白表達(dá)(平均光密度值)0.10±0.039 0.20±0.047①0.11±0.048②0.13±0.042③0.14±0.043③

    圖1 各組Fas m RNA表達(dá)比較

    3 討論

    中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,正氣內(nèi)虛,臟腑失調(diào)是肺癌發(fā)病的基礎(chǔ)。由于正氣不足,邪氣趁虛而入,阻滯胸中,肺失宣降,氣機(jī)不調(diào),血瘀于絡(luò),且津液疏布不利,凝結(jié)成痰,痰瘀互結(jié)成塊。至于晚期,患者均有不同程度的咳嗽咳痰,氣短乏力,消瘦,面色無華等癥狀,中醫(yī)辨證屬肺脾氣虛,病位在肺,治療當(dāng)“虛則補(bǔ)其母”,培土生金,健脾益氣。目前,臨床治療多以放化療為主,取得一定療效的同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫功能造成損傷,因此提高機(jī)體的免疫能力也是治療過程的關(guān)鍵。有研究證明,補(bǔ)中益氣湯可以上調(diào)脾虛小鼠的免疫功能,主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞增殖能力有明顯提高[4]。

    Fas也稱CD95,APo-1,為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體和神經(jīng)生長因子(NGF)受體超家族成員。在不同組織中表達(dá)不同,具有明顯差異性。在機(jī)體內(nèi),F(xiàn)as可以與其配體FasL結(jié)合,啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終使表達(dá)Fas的細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白降解,并最終使其凋亡。而惡性腫瘤細(xì)胞可以通過上調(diào)Fas的配體FasL的表達(dá),與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Tum or Infiltrating Lymphocytes,CTL)表面的Fas結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致CTL凋亡,該現(xiàn)象被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫反攻擊從而逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),把高表達(dá)FasL的腫瘤細(xì)胞與人T細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后,發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的凋亡比例明顯上升,證實(shí)了上述現(xiàn)象[5]。而使用FasL中和抗體,通過封閉腫瘤細(xì)胞表面的FasL,可以使免疫系統(tǒng)得到有效保護(hù)[6]。

    基于上述,筆者對(duì)補(bǔ)中益氣湯影響A549荷瘤小鼠脾組織的Fas表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,對(duì)照組小鼠脾組織中的Fas表達(dá)明顯升高,而高劑量補(bǔ)中益氣湯可明顯下調(diào)荷瘤小鼠脾組織的Fas表達(dá);在基因檢測(cè)方面,高劑量補(bǔ)中益氣湯下調(diào)Fasm RNA的作用明顯。該研究提示,補(bǔ)中益氣湯有一定的抗腫瘤作用,該作用可能與下調(diào)T細(xì)胞Fas表達(dá),減少其凋亡有關(guān),可推廣用于晚期肺癌的輔助用藥。對(duì)于補(bǔ)中益氣湯抗腫瘤、提高免疫功能的機(jī)制值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。

    [1]Le Deist F,Emile JF,Rienx-Lancat F,et al.Clinical,immunological and pathological consequences of Fas deficient conditions[J].Lancet,1996,348:719.

    [2]季宇彬.中藥復(fù)方化學(xué)與藥理[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:315-322.

    [3]李瑞池.補(bǔ)中益氣湯治療晚期肺癌的體會(huì)[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,15(3):343-344.

    [4]羅晶,顧紅纓,徐國憲.補(bǔ)中益氣湯對(duì)脾虛小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(17):2613-2615.

    [5]Zhang W,Ding EX,Wang Q,et al.Fas ligand expression in colon cancer:A possible mechanism of tum or immune privilege[J].World Journal of Gastroenterology,2005,11(23):3632-3635.

    [6]向青,徐波,徐梅.Fas/FasL途徑介導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞免疫逃逸[J].中國病理生理雜志,2006,22(1):168-171.

    (責(zé)任編輯:駱歡歡)

    Effect of Buzhong Yiqi Decoction on Fas Protein Expression in Splenic Tissue of A549 Tumor Bearing Mice

    SUN Zhibin,JING Huan,LI Lulu,et al

    Objective:To investigate the effect of Buzhong Yiqi Decoction on the protein expression of Fas in splenic tissue of A549 tum or bearing m ice.Methods:Lung cancer A549 mouse model was established for anti-lung cancer experiment.Thirty BALB/c mice were randomly divided into normal group,blank control group and high-dose Chinese medicine(CM)group,low-dose CM group,and western medicine group.Mice were given corresponding drug by intragastric administration for ten continuous days.Fas protein expression analyzed by immunohistochemistry(IHC),and Fas m RNA content was analyzed by reverse transcription polym erase chain reaction(RT-PCR).Results:The protein and expression the content of m RNA of Fas were significantly increased in blank control group(P<0.01 com pared with the normal group).Com pared with the blank control group,the protein expression of Fas was decreased in low-dose CM group,CM high-dose group and western medicine group(P<0.05,P<0.01).No statistical significant differences of Fas m RNA expression were found among the medication groups(P>0.05).Conclusion:Buzhong Yiqi Decoction can promote the immune system to attack the lung cancer cell by decreasing Fas protein expression in splenic tissue of A549 tumor bearing mice.

    Buzhong Yiqi Decoction;Fas protein;A549 cell lines;Spleen

    R285.5

    A

    0256-7415(2015)02-0227-03

    10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.106

    2014-10-09

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072743);遼寧省教育廳項(xiàng)目(L2010355)

    孫志彬(1981-),男,在讀碩士研究生,研究方向:中藥抗腫瘤。

    井歡,E-mail:huanj99@163.com。

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