傷科健骨湯對大鼠四肢開放性骨折模型中VEGF表達(dá)及局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響

林小永，陳亮

中山市中醫(yī)院骨二科，廣東 中山528400

傷科健骨湯對大鼠四肢開放性骨折模型中VEGF表達(dá)及局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響

林小永1，陳亮2

中山市中醫(yī)院骨二科，廣東 中山528400

目的：觀察在大鼠四肢開放性骨折模型早期愈合過程中，傷科健骨湯對血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)及骨折端局部組織學(xué)改變的影響。方法：將SPF級SD大鼠造成開放性股骨骨折模型，術(shù)后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各18只。實(shí)驗(yàn)組造模后第2天即開始以傷科健骨湯濃縮液灌服，對照組僅給予正常飼養(yǎng)。術(shù)后第1周、2周、4周，分批處死動(dòng)物取材行免疫組化染色及圖像分析測定，酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）測定血清VEGF表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周、4周的VEGF濃度與對照組相比，差異均有顯著性意義（P＜0.05）。局部組織免疫組化染色及圖像分析測定顯示，實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)在1、2、4周時(shí)均強(qiáng)于對照組，其中在第2周時(shí)染色陽性強(qiáng)度最高，第4周陽性強(qiáng)度降低，但仍強(qiáng)于對照組。結(jié)論：傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平，從而促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖，加快骨折端骨性連接形成，起到促進(jìn)骨折愈合的作用。

開放性骨折；傷科健骨湯；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）；大鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在骨創(chuàng)傷的正常血管生成、骨痂結(jié)構(gòu)和礦化以及軟骨改建中發(fā)揮著極其重要的作用，但目前該類研究多停留在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，中醫(yī)藥治療骨創(chuàng)傷有著悠久的歷史和突出的臨床效果，但對其具體作用機(jī)理的研究尚不深入，本研究將二者通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行結(jié)合，建立大鼠四肢開放性骨折模型進(jìn)行對照試驗(yàn)，觀察在四肢開放性骨折早期愈合過程中，傷科健骨湯對體內(nèi)血清中VEGF表達(dá)及骨折端局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響，探討其治療四肢開放性骨折的作用機(jī)制，以進(jìn)一步明確其促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級SD大鼠，58只，雌雄各29只，體質(zhì)量180～200 g，4～6周齡。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，遵循中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器 傷科健骨湯是本院骨科經(jīng)驗(yàn)方，組成：懷牛膝、續(xù)斷、透骨草、獨(dú)活各15 g，補(bǔ)骨脂、三七、川芎、當(dāng)歸、雞血藤各10 g，甘草5 g，水浸泡30m in，煎3次，每次煎開10m in后過濾取汁，將3次汁液混合，并統(tǒng)一濃縮為質(zhì)量濃度2 g/m L的藥液，由本院中藥房煎制；抗鼠VEGF的酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司提供）；即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，Sw-CJ）；GENIOS多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組58只SD大鼠飼養(yǎng)于本院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫20℃，相對濕度60%，自由攝食、飲水，每周監(jiān)測體質(zhì)量。用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字生成法將大鼠隨機(jī)分為造模組40只和正常對照組18只。2組均給予全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料（含12%脂肪、60%碳水化合物、28%蛋白質(zhì)）。

2.1.1 開放性骨折模型的建立 采用腹腔注射麻醉的方法，于大鼠右下腹部注射3%戊巴比妥鈉，按每1 kg體重1m g的劑量，計(jì)算藥物濃度，左后肢股骨部術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒，取前外側(cè)切口，沿肌間隙盡量鈍性分離骨面，顯露股骨干，于股骨干中1/3處呈短斜形截?cái)?，?.2～1.5mm的克氏針做髓內(nèi)固定以固定折端，檢查對位對線良好，固定穩(wěn)固后，沖洗縫合傷口，安爾碘每天消毒傷口預(yù)防感染。

2.1.2 分組方法 在造模成功的大鼠中選取健康狀況良好的36只，用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字生成法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各18只。

2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組造模后第2天即開始以傷科健骨湯濃縮液灌服，按10倍成人劑量換算為15m L/（kg·d），分2次給藥。對照組僅給予正常飼養(yǎng)。

2.3 血清中VEGF的測定 術(shù)后第1周、2周、4周應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字生成法，每組分別抽取6只大鼠拍X線片后處死，取骨折端局部組織標(biāo)本固定保存后待測。心臟取血，離心15m in分離血清，-70℃低溫保存待測。VEGF含量的測定采用ELISA。

2.4 VEGF免疫組織化學(xué)檢測 術(shù)后第1周、2周、4周，取大鼠的局部組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、硝酸脫鈣，石蠟切片。采用即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。免疫組化染色片電子顯微鏡下計(jì)算免疫組化染色的平均光密度值和積分光密度值進(jìn)行半定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得的數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較 見表1。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周、4周的VEGF濃度與前1周比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05），2組間第2周、4周的VEGF濃度分別比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較±s）mg/L

表1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較±s）mg/L

與本組第1周比較，①P＜0.05；與本組第2周比較，②P＜0.05；與對照組同期比較，③P＜0.05

組別實(shí)驗(yàn)組對照組n 18 18第1周158.30±11.06 147.65±4.55第2周178.50±9.97①③151.28±8.30第4周170.45±12.55②③160.37±3.15

3.2 局部組織學(xué)觀察結(jié)果 見圖1、2、3。實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)在1、2、4周時(shí)均強(qiáng)于對照組，其中在第2周時(shí)染色陽性強(qiáng)度最高，第4周陽性強(qiáng)度降低但仍優(yōu)于對照組。其中術(shù)后第1周，2組均出現(xiàn)較強(qiáng)陽性染色，實(shí)驗(yàn)組程度稍強(qiáng)于對照組，但優(yōu)勢不明顯；術(shù)后第2周，實(shí)驗(yàn)組局部組織染色陽性強(qiáng)度高于對照組，二者差異明顯，且實(shí)驗(yàn)組局部軟骨痂、成骨細(xì)胞、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯高于對照組，端斷組織增生活躍。術(shù)后第4周，2組VEGF仍呈持續(xù)陽性表達(dá)，但差異程度稍有下降。

圖1 術(shù)后第1周

圖2 術(shù)后第2周

圖3 術(shù)后第4周

4 討論

隨著人們對骨折愈合機(jī)制研究的深入，逐漸認(rèn)識到人類骨骼在骨折發(fā)生后的愈合過程中，受到諸多因素的影響，這之中骨折斷端的血供是最基本的因素，也是最重要的因素，而創(chuàng)傷后血管的生成可通過很多誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)，有研究顯示，唯有VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞有特異性，能促使其增殖及血管的生成，同時(shí)又能增加血管的通透性［1～2］。類似的研究也證實(shí)，VEGF在骨骼生成及其代謝過程中均起到極為關(guān)鍵的作用，如初同偉等［3］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用VEGF組骨折端局部血流量明顯高于對照組，而使用VEGF抗體組則出現(xiàn)骨不連及不愈合。文獻(xiàn)［4］報(bào)道顯示，在骨折的愈合過程中，VEGF能通過促進(jìn)骨折端及其周圍軟組織血管的生成，特異性增加局部的血流量，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)軟骨的生成與成熟，增進(jìn)成骨細(xì)胞與軟骨內(nèi)骨化之間的相互作用，誘導(dǎo)成骨，進(jìn)而加快骨折愈合過程。國外有研究也發(fā)現(xiàn)，在骨折部位應(yīng)用VEGF腺病毒轉(zhuǎn)染的方法可促進(jìn)骨折愈合［5］。

傷科健骨湯為本院骨科應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方，臨床效果明顯，但其具體作用機(jī)理尚不明確，極大地制約了對外學(xué)術(shù)交流及進(jìn)一步現(xiàn)代化開發(fā)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平，從而促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖，加快骨折端骨性連接形成，起到促進(jìn)骨折愈合的作用。尤其是術(shù)后第2周，實(shí)驗(yàn)組骨折斷端局部組織中VEGF表達(dá)明顯高于對照組，提示傷科健骨湯能促進(jìn)VEGF的合成分泌，從而有效地促進(jìn)了骨修復(fù)過程中血管的形成和骨生成，這可能是其促進(jìn)骨折愈合的重要機(jī)制。但必須指出的是，骨折愈合是多種因素共同參與、相互協(xié)同的復(fù)雜過程，VEGF只是其中的一個(gè)方面，關(guān)于傷科健骨湯是如何干預(yù)其他骨生長因子的，還需進(jìn)一步研究。

［1］Ferrara N，Henzel WJ.Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding grow th factor［J］.Biochem Biophys Res Comm un，1989，161（2）：851-858.

［2］Keck PJ，Hauser SD，KriviG，et al.Vascular permeability factor，an endothelial cell mitogen regulated to PDGF［J］.Science，1989，246（4935）：1309-1312.

［3］初同偉，王正國，朱佩芳，等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在骨折愈合過程中的作用［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2002，16（2）：75-78.

［4］鐘剛，裴福興，樊瑜波.血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國矯形外科雜志，2004， 12（8）：604-606.

［5］Lattermann C，Baltzer AW，Zelle BA，et al.Feasibility of percutaneous gene transfer to an atrophic nonunion in a rabbit［J］.Clin Orthop Relat Res，2004（425）：237-243.

（責(zé)任編輯：劉淑婷，吳凌）

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0256-7415（2015）02-0218-02

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.102

2014-10-09

廣東省中山市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（20132A176）

林小永（1978-），男，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)傷骨科的臨床及研究工作。

陳亮，E-mail：chenliang211@163.com。