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    明膠、阿拉伯膠復(fù)合凹土制備乳酸菌微膠囊研究

    2015-10-19 06:01:32馮云琪
    中國(guó)飼料 2015年23期
    關(guān)鍵詞:阿拉伯膠壁材膠體

    馮云琪

    (淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇淮安 223001)

    明膠和阿拉伯膠均為具有良好生物親和性的天然高分子材料,明膠是一種蛋白質(zhì),阿拉伯膠是一種多聚糖,均可作為微膠囊制備的理想壁材。在pH=4左右,明膠帶正電荷較多,阿拉伯膠帶負(fù)電荷較多,可中和形成復(fù)合物,再加入固化劑,形成交聯(lián)狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成囊 (孫燕婷等,2013)。凹土是一種天然非金屬粘土礦物質(zhì),具有特殊纖維晶體形態(tài)結(jié)構(gòu),具有較好的生物親和性,其本身可作為益生菌載體,當(dāng)在微膠囊壁材中添加該物質(zhì)時(shí),又可較好地提高微囊的機(jī)械強(qiáng)度和通透性(趙玉萍等,2013、2012)。本試驗(yàn)以載菌凹土為芯材,以明膠、阿拉伯膠復(fù)合凹土作為壁材制備微囊膠,研究該壁材對(duì)益生菌在胃腸環(huán)境中的保護(hù)作用,旨在為飼料用益生菌制劑的制備提供一定的參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器 乳酸桿菌由江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過(guò)程集成工程實(shí)驗(yàn)室篩選保藏;凹土由江蘇省凹土資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、胃蛋白酶、胰蛋白酶購(gòu)自日本Sigma公司;其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    722N型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器(金壇市榮華儀器制造有限公司);TGL-16G-A型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);BSD-YX3200型立式雙層智能精密搖床 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);BL-50A型立式壓力蒸汽滅菌鍋 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);90-3型恒溫雙向磁力攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)。

    1.2 培養(yǎng)基及人工胃腸液的配制 乳酸桿菌的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基:牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,酵母浸膏 5 g,K2HPO42 g,檸檬酸二銨 2 g,乙酸鈉 2 g,葡萄糖 20 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,MgSO4·7H2O 0.58 g,吐溫-801 mL,水 1000 mL,pH 6.2 ~6.4(趙玉萍和方芳,2013)。

    人工胃液:胃蛋白酶10g,NaCl 2 g,加水定容至 1000 mL,pH 2.5(趙玉萍等,2013)。

    人工腸液:胰蛋白酶 10 g,KH2PO46.8 g,加水定容至 1000 mL,pH 6.8(李寧,2007)。

    人工胃腸液均用0.2 μm濾膜過(guò)濾備用。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 凹土的純化 將未經(jīng)處理的凹土研磨,過(guò)200目篩,以10%的量加入去離子水,磁力攪拌器攪拌24 h后,靜置4 h,取中間層凹土懸液,以10%的量加入去離子水,重復(fù)3次(趙玉萍等,2012)。

    1.3.2 復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊

    1.3.2.1 復(fù)凝聚法制備乳酸菌微膠囊方法 乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中于37℃靜置培養(yǎng),2000 r/mim離心 10 min,取沉淀備用(趙玉萍等,2013)。

    載菌凹土的制備:適量菌懸液和凹土在pH 6.5,35℃吸附40 min,冷凍干燥備用(趙玉萍等,2015;Rong 等,2008)。

    微囊的制備:將適量明膠、凹土、載菌凹土和Tween-80于40℃混合,攪拌均勻,恒溫加入阿拉伯膠溶液,繼續(xù)攪拌均勻,用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.6~4.0。

    微囊的固化:上述混合液自然冷卻至25℃左右,再以冰浴冷卻至10℃以下,加入一定量戊二醛固化劑,攪拌15 min后,用10%NaOH溶液調(diào)pH至8~9,繼續(xù)攪拌至膠囊析出(于樂(lè)軍,2009)。

    微膠囊的收集:離心收集并洗滌固化后的微膠囊產(chǎn)品。

    1.3.2.2 明膠-阿拉伯膠復(fù)合凹土微囊制備的適宜條件的確定 適宜菌膠比例的確定:明膠-阿拉伯膠膠體質(zhì)量總濃度為4%(質(zhì)量比為1∶1),凹土0.2%,pH 4.0,于25℃反應(yīng) 20 min,菌膠質(zhì)量比例分別為 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9(菌體的量為載菌凹土的質(zhì)量),考察其對(duì)乳酸菌微膠囊包埋率以及模擬胃腸環(huán)境的釋放率的影響。

    在單因素試驗(yàn)中,明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量分別為2%、3%、4%、5%、6%,其質(zhì)量比分別為1.5∶1、1.2∶1、1∶1、1∶1.2、1∶1.5, 凹 土 用 量 分 別 為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%, 反應(yīng)溫度分別為15、20、25、30、35 ℃,凝聚 pH 分別為 3.6、3.7、3.8、3.9、4.0,反應(yīng)時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min。

    1.3.2.3 微膠囊質(zhì)量初步評(píng)價(jià) 包埋率按以下公式計(jì)算:

    活菌數(shù)測(cè)定采用菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法。

    包埋前活菌數(shù)計(jì)數(shù):取包埋前的菌液,稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后取0.2 mL涂布,37℃培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù)。

    未包埋活菌數(shù)計(jì)數(shù):取微膠囊離心上清液,用無(wú)菌水洗滌數(shù)次,收集上清和洗滌液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后取0.2 mL涂布,37℃培養(yǎng)24~48 h,計(jì)數(shù)。

    1.3.2.4 耐胃腸環(huán)境試驗(yàn) 將1 g微膠囊置于100mL人工胃液中,于37℃水浴恒溫振蕩150r/min,分別于0、l、2、3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),然后將微膠囊于2000 r/min離心10 min并經(jīng)生理鹽水洗滌后,轉(zhuǎn)至100 mL人工腸液中,于37℃水浴恒溫振蕩150 r/min, 分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)與未經(jīng)包埋的菌體與載菌凹土作對(duì)照(尹尉翰等,2011)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 菌膠比的確定 菌膠比對(duì)微囊包埋率影響較大,若菌膠比過(guò)高,菌體過(guò)量,壁材不能將菌體完全包裹;若菌膠比例過(guò)低,壁材過(guò)量,雖然包埋率高,但因包埋過(guò)于致密不利于菌體釋放。菌膠比對(duì)乳酸菌微膠囊包埋率的影響結(jié)果如圖1所示。

    圖1 菌膠比對(duì)包埋率的影響

    由圖1可以看出,隨著菌膠比的不斷減小,微膠囊的包埋率不斷增大。當(dāng)菌膠比為1∶5時(shí)包埋率最低,為70.1%;菌膠比為1∶9時(shí)包埋率最高,為79.5%。當(dāng)菌膠比從1∶5降低到1∶8時(shí),微膠囊粒徑有所減小,包埋率明顯提高,達(dá)79.3%,但隨著菌膠比的降低,微膠囊包埋菌體量亦逐漸降低,綜合包埋率和包埋量?jī)蓚€(gè)因素,確定菌膠比為 1∶8。

    2.2 明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量的確定 壁材濃度過(guò)低或過(guò)高均會(huì)影響微膠囊產(chǎn)品的外觀均勻度和圓整性。若明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體用量過(guò)少,形成的微膠囊量少,包埋率亦隨之下降,若用量過(guò)多,加入戊二醛后會(huì)形成凝膠狀而非微膠囊。復(fù)合膠體用量對(duì)包埋率影響結(jié)果如圖2所示。

    圖2 復(fù)合膠體用量對(duì)微膠囊包埋率的影響

    由圖2可以看出,隨著復(fù)合膠體用量的不斷增大,微膠囊的包埋率先增大后減小,當(dāng)復(fù)合膠體用量為4%時(shí),包埋率最大為79.9%??赡苁钱?dāng)復(fù)合膠體濃度較低時(shí),膠體電離電荷較少,能夠形成的微膠囊數(shù)量少,包埋率亦較低;隨著復(fù)合膠體濃度的增大,兩者電離電荷增加,因此能夠形成的膠囊數(shù)量增加,包埋率增大;當(dāng)明膠-阿拉伯膠復(fù)合膠體的濃度大于5%時(shí),由于復(fù)合膠體濃度過(guò)高、黏度較大,形成的微膠囊相互粘連,導(dǎo)致包埋率也隨之下降。

    2.3 適宜明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比的確定 由圖3可知,隨著明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比的增加,微膠囊的包埋率先增加后減小,當(dāng)明膠∶阿拉伯膠為1∶1時(shí),包埋率最大為90.4%,可能是因?yàn)槊髂z所帶正電荷和阿拉伯膠所帶負(fù)電荷恰好完全中和。

    圖3 明膠-阿拉伯膠質(zhì)量比對(duì)微膠囊包埋率的影響

    2.4 適宜凹土用量的確定 載菌凹土減少了復(fù)凝聚過(guò)程中菌體的損失,在壁材中添加凹土?xí)黾游⒛z囊的機(jī)械強(qiáng)度(趙玉萍等,2012)。凹土用量對(duì)包埋率的影響結(jié)果如圖4所示。

    圖4 凹土添加量對(duì)微膠囊包埋率的影響

    由圖4可知,隨著凹土用量的不斷增加,微膠囊的包埋率先增大后減小。當(dāng)凹土用量為0.4%時(shí),包埋率最高為91.1%,再增加凹土用量包埋率反而下降,原因可能是隨著凹土用量的增加,降低了成囊性。

    2.5 適宜復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)間的確定 足夠的反應(yīng)時(shí)間會(huì)使明膠-阿拉伯膠凹土復(fù)合體系反應(yīng)充分,可將菌體盡可能地充分包埋,保證了形成的微膠囊數(shù)量,結(jié)果如圖5所示。

    圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響

    由圖5可以看出,隨著復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)間的增加,微膠囊包埋率逐漸增加后趨于穩(wěn)定,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí),包埋率已達(dá)到92.4%。

    2.6 適宜凝聚pH的確定 在不同的pH條件下,明膠和阿拉伯膠帶電性質(zhì)不同,交聯(lián)反應(yīng)程度不同,試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

    圖6 凝聚pH對(duì)微膠囊包埋率的影響

    由圖6可以看出,當(dāng)pH在3.9時(shí),微膠囊的包埋率最高,為93.6%??赡苁且?yàn)閜H為3.9時(shí),明膠所帶的正電荷最多,而阿拉伯膠此時(shí)帶負(fù)電荷,因此形成的微膠囊量也最多(于樂(lè)軍,2009)。

    2.7 適宜反應(yīng)溫度的確定 低溫時(shí)復(fù)凝聚反應(yīng)不易發(fā)生,因?yàn)槊髂z溶液呈凍凝狀,阿拉伯膠溶液黏度較大;高溫時(shí),分子熱運(yùn)動(dòng)速率較快,且不易凝聚在載菌凹土周?chē)?,因此?huì)影響微膠囊的形成,所以適宜的反應(yīng)溫度會(huì)對(duì)微膠囊的包埋率產(chǎn)生影響,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 反應(yīng)溫度對(duì)微膠囊包埋率的影響

    由圖7可以看出,隨著溫度的升高,微膠囊的包埋率先升高后下降,溫度為25℃時(shí),包埋率最高,為93.3%。

    2.8 微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中的釋放率 按上述方法和步驟制得乳酸菌微膠囊,經(jīng)冷凍干燥后獲得活菌制劑。將未經(jīng)任何保護(hù)的乳酸桿菌、負(fù)載在凹土上的乳酸桿菌和微膠囊制劑在模擬人工胃腸環(huán)境下進(jìn)行試驗(yàn),0~3 h為模擬胃環(huán)境,3~15 h為模擬腸環(huán)境。由圖8可知,在胃環(huán)境中載菌凹土和微膠囊釋放比率接近,但在腸環(huán)境中,微膠囊能較長(zhǎng)時(shí)間地保持活菌比率,證明明膠-阿拉伯膠-凹土復(fù)合壁材對(duì)于乳酸菌具有較好的保護(hù)作用。

    圖8 人工腸胃環(huán)境下活菌釋放率與時(shí)間的關(guān)系

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)以明膠、阿拉伯膠復(fù)合凹土作為壁材,以載菌凹土作為芯材,制備乳酸桿菌微膠囊制品,經(jīng)人工模擬胃腸環(huán)境作用發(fā)現(xiàn),載菌凹土與微膠囊在胃環(huán)境中的乳酸桿菌的釋放率接近,但在腸環(huán)境中,微膠囊中的乳酸桿菌卻能在很長(zhǎng)時(shí)間保持活性,說(shuō)明本試驗(yàn)中所用的壁材對(duì)乳酸桿菌具有較好的保護(hù)作用。在微膠囊的制備過(guò)程中,與僅以明膠、阿拉伯膠作為壁材的微膠囊相比,本試驗(yàn)所用的膠體總量、交聯(lián)pH、固化時(shí)間和溫度等參數(shù)均發(fā)生了變化,尤其是膠體用量從15%降為4%,但仍可保持較高的包埋率,節(jié)約了成本??赡苁且?yàn)榘纪恋奶砑?,其表面的電荷影響了明膠、阿拉伯膠的表面電荷,從而使固化條件均發(fā)生了變化,關(guān)于這方面的機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

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