TGF-β對鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

楊 薇

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)口腔科，北京 102618)

1 引 言

生長因子作為誘導(dǎo)信號在上皮-間充質(zhì)相互作用中有著重要作用，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)是TGF-β細(xì)胞因子超家族的成員之一，參與調(diào)控牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和胞外基質(zhì)形成，在牙齒發(fā)育和牙髓損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要功能[1～2]。最新報(bào)道TGF-β與酸性成纖維細(xì)胞生長因子共同作用可促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞極化和成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的功能分化以及前期牙本質(zhì)的分泌[3]。本實(shí)驗(yàn)對出生后4 d大鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞離體培養(yǎng)并從時(shí)間效應(yīng)上探討TGF-β對其增殖和分化的影響，旨在探討TGF-β對牙齒發(fā)育的調(diào)控作用模式。

2 材料與方法

2.1 動(dòng)物、試劑、儀器

4～5 d SD大乳鼠,DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶,MTT,TGF-β,ALP檢測試劑盒,Triton-100,CO2孵箱,體視顯微鏡,倒置顯微鏡,酶聯(lián)免疫檢測儀。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

出生后4 d SD大鼠,分離上、下頜骨，取第一、二磨牙牙胚,DMEM液漂洗三遍,剪成糜狀,置于含10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中，2～3 d換液，細(xì)胞伸展覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%時(shí),細(xì)胞貼壁法進(jìn)行消化并傳代。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞粘附情況

取生長良好的第四代牙源性間充質(zhì)細(xì)胞，配成1.0×105/ml濃度接種于24孔板中，每孔1 ml，2～3 d換液1次，每隔24 h取3孔細(xì)胞，PBS沖洗，消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)三次，取平均值。以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)(n×104)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

2.4 TGF-β對細(xì)胞增殖及 ALP 活性的影響

2.4.1接種細(xì)胞 將第四代牙源性間充質(zhì)細(xì)胞，消化，離心，調(diào)整密度為1.0×104/ml，接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入5 ng/ml的TGF-β培養(yǎng)液200 μl，設(shè)立無細(xì)胞的空白組和TGF-β濃度為零的對照組，2～3 d換液。

2.4.2MTT測定 1、3、5、7 d，每組取四孔，每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，微量振蕩器震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀，波長490 nm，檢測每孔光密度值(OD)。

2.4.3ALP活性測定 1、3、5、7 d，每組取四孔，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，加50 μl 0.1% Triton X-100，4℃過夜，加入100 μl ALP抗體，孵育30 min，加入0.2 mol/L氫氧化鈉50 μl，酶聯(lián)免疫檢測儀410 nm波長測定OD值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)觀察

培養(yǎng)3～4 d后細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，形成“生長暈”，最早出現(xiàn)多星形或梭形成纖維樣細(xì)胞，散在，體積大，略扁平，傳代后細(xì)胞生長旺盛，呈長梭形，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，少數(shù)細(xì)胞胞體可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)突起。

圖1 傳代牙源性間充質(zhì)細(xì)胞×100

圖2 TGF-β誘導(dǎo)后的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞×400

3.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

經(jīng)TGF-β誘導(dǎo)5 d后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好，排列整齊，大量細(xì)胞具有細(xì)長的單極細(xì)胞漿突起，胞核位于突起的一側(cè)，一些單極細(xì)胞出現(xiàn)平行排列狀；對照組生長狀態(tài)良好，但突起細(xì)胞較少(見圖2)。

3.3 細(xì)胞生長曲線

在接種后1 d，細(xì)胞數(shù)有所下降，但到第2 d細(xì)胞總數(shù)開始增加，到第3～5 d進(jìn)入指數(shù)增長期，第6 d以后，細(xì)胞增殖速度減慢，進(jìn)入平臺期，整個(gè)曲線呈“S”形，符合一般細(xì)胞生長規(guī)律。

3.4 TGF-β對牙源性間充質(zhì)細(xì)胞的增殖的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OD值逐漸增高，培養(yǎng)第1、3、5、7 d均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明TGF-β對牙源性間充質(zhì)細(xì)胞增殖起作用且隨時(shí)間的延長而加強(qiáng)(見表1)。

表1 TGF-β對于牙源性間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

3.5 TGF-β對細(xì)胞ALP活性的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OD值逐漸增高，培養(yǎng)第1、3、5、7 d均與對照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明TGF-β能夠增強(qiáng)牙源性間充質(zhì)細(xì)胞的ALP活性且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而加強(qiáng)(見表2)。

表2 TGF-β對于牙源性間充質(zhì)細(xì)胞ALP活性的影響

4 討論

牙齒是一種多胚層起源的器官，牙源性間充質(zhì)細(xì)胞是牙本質(zhì)和牙髓組織共同的起源細(xì)胞，其增殖和分化能力很強(qiáng)，其中牙釉質(zhì)來源于牙胚發(fā)育早期的牙源性上皮細(xì)胞,而牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體起源于其周圍的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞,兩種細(xì)胞通過信號分子產(chǎn)生復(fù)雜的交互作用發(fā)育成牙齒,這種交互作用調(diào)控牙胚發(fā)育朝著精確而有序的方向進(jìn)行[4-5]。TGF-β是 TGF-β細(xì)胞因子超家族的成員之一，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞粘附分子等的表達(dá)，在牙胚發(fā)育、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和第三期牙本質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用[6]。最新報(bào)道 TGF-β與酸性成纖維細(xì)胞生長因子共同作用可促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞極化和成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的功能分化以及前期牙本質(zhì)的分泌[3]。

本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)牙源性間充質(zhì)細(xì)胞，因缺乏牙源性上皮中各種信號分子的誘導(dǎo)作用，所以在培養(yǎng)液中加入5 ng/mLTGF-β。鏡下觀察可見大量細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，出現(xiàn)單側(cè)較長的細(xì)胞突起。MTT法發(fā)現(xiàn)1、3、5、7 d，TGF-β對于細(xì)胞增殖活力均與對照組相比有顯著性差異，提示TGF-β能刺激體外培養(yǎng)的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞增殖。

ALP是重要的礦化組織相關(guān)蛋白，在硬組織形成中促進(jìn)鈣化的作用較為肯定，是牙乳頭細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成的重要標(biāo)志之一。ALP活性增高被認(rèn)為是成牙本質(zhì)前體細(xì)胞分化、發(fā)生生物礦化的前提條件，與細(xì)胞分化狀態(tài)密切相關(guān)。分化程度越高，分泌礦化基質(zhì)的能力越強(qiáng)，則ALP活性越高。研究顯示，成牙本質(zhì)細(xì)胞和前體成牙本質(zhì)細(xì)胞的ALP活性水平均比未分化的間充質(zhì)細(xì)胞高[7-5]。在本實(shí)驗(yàn)中，1、3、5、7 d，TGF-β對ALP的影響持續(xù)增加，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明隨著作用時(shí)間的延長，發(fā)生分化的細(xì)胞數(shù)量增多、分化程度增高，提示TGF-β在鼠牙源性間充質(zhì)細(xì)胞分化和礦化過程中可能起著重要的作用。綜上所述， TGF-β可以誘導(dǎo)培養(yǎng)早期的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化，并隨時(shí)間延長，效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。