酒花多酚對高脂血癥小鼠的降脂與抗氧化作用

郭 苗，楊小蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

酒花多酚對高脂血癥小鼠的降脂與抗氧化作用

郭 苗，楊小蘭*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

啤酒釀造廢酒花（超臨界CO2萃余物）中富含多酚，評價從廢酒花中分離的多酚提取物（hop polyphenol extract，HPE，純度為88.7%）對高脂血癥小鼠的降脂抗氧化作用，并與同劑量的茶多酚降脂抗氧化效果進(jìn)行比較。用HPE以200～800 mg/（kg·d）的劑量持續(xù)灌胃高脂小鼠5 周，高脂血癥小鼠血清和肝臟中的總膽固醇和甘油三酯以及血清中的低密度脂蛋白膽固醇水平和動脈粥樣硬化指數(shù)顯著下降，血清中高密度脂蛋白水平顯著升高。另外，小鼠血液、肝臟中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量顯著減少，過氧化氫酶活力顯著提高，紅細(xì)胞和肝臟中的超氧化物歧化酶活力、全血和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶活力均顯著提高。研究結(jié)果表明，HPE對高脂血癥小鼠具有顯著的降脂和抗氧化作用。

酒花多酚；高脂血癥；脂質(zhì)過氧化；小鼠

啤酒花（Humulus lupulus L.）屬于?？迫劜輰俣嗄晟荼局参铮喎Q酒花［1］。它是一種應(yīng)用歷史悠久的藥食同源植物，能治療肺結(jié)核、麻風(fēng)病、鎮(zhèn)靜和失眠等癥［2］，還可用于啤酒釀造，能給啤酒提供獨特的苦味、香氣和抑菌力。目前，采用超臨界CO2萃取酒花釀造有效成分制成酒花浸膏用于啤酒生產(chǎn)的方法已被廣泛應(yīng)用。但是酒花中含有4%～14%的多酚［3］，由于其極性原因不能被超臨界CO2萃取出來，而殘留在萃余物（廢酒花）中［4］，王旭蘋［5］和楊小蘭［6］等研究了從廢酒花中提取多酚和黃酮的方法。

有研究表明酒花多酚與綠茶多酚一樣是很有前途的功能性成分，酒花多酚具有抗氧化［7-8］、抗病毒、抗菌［9-10］和抗炎［11-12］作用。酒花多酚對變形鏈球菌引起的齲齒的抑制作用優(yōu)于同濃度的茶多酚［13］。脂代謝紊亂引起的高脂血癥是導(dǎo)致心血管病蔓延和惡化的最重要的風(fēng)險因素之一［14］。流行病學(xué)資料表明，在中國成年人血脂異常癥的患病率為18.6%，也就是說，血脂異常患者的數(shù)目已達(dá)1億6千萬［15］，還有報道稱全世界每年大約有1 200萬人死于心血管病和腦中風(fēng)。因此，采用各種方法對高脂血癥進(jìn)行早期預(yù)防和控制非常重要。由于降脂藥物的成本昂貴，且有潛在的副作用，因而現(xiàn)在越來越多的人尋找天然資源來降低脂質(zhì)水平。以植物為基礎(chǔ)的飲食療法，因為一般很少或無副作用［16］而被公認(rèn)為在治療應(yīng)用方面具有潛力。大量研究表明，植物中的多酚、類黃酮等天然抗氧化物質(zhì)可降低患高脂血癥的風(fēng)險［17-20］。酒花多酚對高脂血癥動物體內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響作用還未見報道，本研究評價從廢酒花中分離的多酚提取物（hop polyphenol extract，HPE，純度為88.7%）對高脂血癥小鼠的降脂抗氧化作用，并與同劑量的茶多酚降脂抗氧化效果進(jìn)行比較，以期為酒花多酚在保健食品和藥品行業(yè)中的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

清潔級昆明雄性小鼠72 只，體質(zhì)量（20±2）g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

酒花多酚提取物（HPE，多酚純度88.7%），本實驗室制備，參照楊小蘭等［6］的方法。

茶多酚提取物（tea polyphenol extract，TPE，多酚純度為90%） 江西綠康天然產(chǎn)物有限公司；膽固醇（純度≥90%，飼料級）、膽酸鈉（純度≥90%，飼料級）安徽天啟化工科技有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、蛋白質(zhì)試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法） 南京建成生物工程研究所；豬油 市售；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

MR23低溫冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；Spectra Max M5酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；AnkeTGL-16G臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；25 mL玻璃組織勻漿器 海門市盛泰實驗器材廠。

1.3方法

1.3.1動物分組及處理

雄性昆明小鼠60 只，體質(zhì)量（20±2）g，分籠飼養(yǎng)（控制光照12 h明/12 h暗，室內(nèi)溫度（20±1）℃，相對濕度為（55±10）%，自由飲食（基礎(chǔ)飼料）和進(jìn)水，室內(nèi)無菌消毒，每兩天換一次墊料，飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)將其分為6 組，每組10 只。正常對照組（NG組）：飼喂基礎(chǔ)飼料（飼料組成依照GB 14924.3—2001《實驗動物 配合飼料營養(yǎng)成分》配制）；高脂模型組（HG組）：飼喂高脂飼料（熟豬油10%、膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料87.5%）；3 個酒花多酚實驗組（HPL、HPM、HPH組）均飼喂高脂飼料，同時分別以200、400、800 mg/（kg·d）的多酚劑量給小鼠灌胃HPE（用蒸餾水將HPE配制成不同劑量的混懸液）；茶多酚組（TPM組）：飼喂高脂飼料，同時以400 mg/（kg·d）的多酚劑量給小鼠灌胃TPE。NG組和HG組每天灌胃蒸餾水。每組自由進(jìn)食和飲水。每隔7 d稱一次體質(zhì)量，在實驗第35天時，禁食12 h（不禁水），摘除眼球取血，3 000 r/min離心5～10 min，分離血清，分裝后于-20 ℃冷凍保存測定生化指標(biāo)［21］。頸錐脫臼法處死小鼠，分離肝臟，用冷生理鹽水漂洗，拭干，用滅菌生理鹽水4 ℃條件下制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液用于測定生化指標(biāo)。

1.3.2全血溶血液制備

取肝素抗凝全血20 μL，以蒸餾水稀釋至1 mL，配成1：49（V/V）溶血液。充分混勻，放置5 min直至玻璃管中的溶血液對光呈完全透明狀，方可檢測溶血液中GSH-Px活力。

1.3.3紅細(xì)胞抽提液制備

在裝有3 mL生理鹽水的帶刻度離心管中，加入肝素抗凝血50 μL，2 000 r/min離心3 min。用玻璃吸管吸去上清液，在余留下沉淀的紅細(xì)胞中加入雙蒸水0.2 mL，混勻。再加入95%的乙醇0.1 mL，振蕩30 s，加入三氯甲烷0.1 mL置旋渦混勻器充分抽提混勻1 min，然后3 500 r/min離心8 min。此時液體分為3 層：上層為紅細(xì)胞抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。分離上層的紅細(xì)胞抽提液，冷凍保存［21］，用于紅細(xì)胞SOD活力的測定。

1.3.4小鼠血脂和肝脂水平測定

小鼠血清和肝臟中TC、TG含量以及血清中HDL-C水平按照試劑盒說明書方法測定，肝勻漿蛋白質(zhì)的測定按照試劑盒說明書采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定。血清中的低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）和動脈粥樣硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）按公式（1）、（2）計算。

式中：LDL-C含量、TC含量、HDL-C含量的單位均為mmol/L。

1.3.5小鼠血液和肝臟抗氧化指標(biāo)的測定

小鼠血清和肝臟MDA含量及CAT活力、紅細(xì)胞和肝臟SOD活力、全血和肝臟GSH-Px活力均按照試劑盒說明書方法測定。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1各組小鼠體質(zhì)量的變化

表1　小鼠體質(zhì)量變化情況Table1 Body weight changes of mice

表1　小鼠體質(zhì)量變化情況Table1 Body weight changes of mice

注：同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

組別NG組HG組HPL組HPM組HPH組TPM組第1天19.86±0.60a19.94±0.59a19.64±0.70a19.56±0.51a19.86±0.78a20.19±0.53a第3周29.72±1.54a29.99±1.63a29.86±1.54a29.19±1.97a28.14±1.95a29.60±1.58a第5周36.38±2.27a37.98±2.31a35.46±3.14a35.59±1.73a35.46±2.97a35.79±1.70a

實驗期間各組小鼠的健康情況良好，攝食量無明顯差別，小鼠行為、排便及精神狀態(tài)正常。由表1可知，5 周后多酚組（HPE和TPE）體質(zhì)量增加較少，但6 組小鼠之間體質(zhì)量變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2HPE對高血脂癥小鼠血脂和肝脂水平的影響

表2　5 周后各組小鼠血脂、肝脂水平Table2 Lipid levels in serum and liver of mice fed with experimental diets for 5 weeks

表2　5 周后各組小鼠血脂、肝脂水平Table2 Lipid levels in serum and liver of mice fed with experimental diets for 5 weeks

組別NG組HG組HPL組HPM組HPH組TPM組血清TC含量/（mmol/L）3.59±0.25a5.57±0.33d5.02±0.39c4.73±0.42c4.11±0.30b4.70±0.37cTG含量/（mmol/L）1.11±0.06a1.40±0.06c1.21±0.15b1.04±0.09a1.03±0.11a1.09±0.12aHDL-C含量/（mmol/L）3.12±0.10b2.88±0.15a3.32±0.13c3.39±0.14c3.31±0.16c3.00±0.07abLDL-C含量/（mmol/L）0.25±0.25a2.41±0.22e1.46±0.33d1.12±0.44c0.59±0.29b1.49±0.38dAI0.15±0.08a0.94±0.06d0.51±0.10c0.39±0.13b0.24±0.09b0.57±0.13c肝臟TC含量/（mg/g）1.16±0.12a2.78±0.54c1.66±0.47b1.16±0.17a0.94±0.14a1.71±0.40bTG含量/（mg/g）15.76±1.12a29.31±1.58d19.38±1.12c18.72±1.83bc16.83±1.33a17.90±1.51b

實驗?zāi)└鹘M小鼠的血脂、肝脂水平如表2所示。與NG組相比，HG組小鼠血清和肝臟中TC、TG含量、血清LDL-C水平和AI值顯著升高（P＜0.05），血清HDL-C水平顯著降低（P＜0.05），表明高脂血癥小鼠造模成功；與HG組相比，酒花多酚各劑量組（HPL、HPM、HPH組）小鼠血清和肝臟中的TC和TG含量、血清中LDL-C水平和AI值顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）；HPM組小鼠血清LDL-C水平和AI值以及肝臟TC含量均顯著低于TPM組（P＜0.05），血清HDL-C水平顯著高于TPM組（P＜0.05），而兩組間的血清和肝臟TG含量沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3HPE對高血脂癥小鼠脂質(zhì)過氧化物和抗氧化性的影響

實驗?zāi)┬∈笱汉透闻K的脂質(zhì)過氧化物水平和抗氧化酶活性如表3所示。與NG組相比，HG組小鼠血清和肝臟的MDA含量顯著增加（P＜0.05），抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活力顯著降低（P＜0.05）；與HG組相比，酒花多酚3 個劑量組（HPL、HPM和HPH組）血清和肝臟中的MDA含量均顯著降低（P＜0.05），全血GSH-Px和肝臟CAT活力顯著提高（P＜0.05）；與HG組相比，HPM和HPH組小鼠紅細(xì)胞SOD、血清CAT活力和肝臟GSH-Px活力均顯著提高（P＜0.05）。與TPM組相比，HPM組小鼠全血GSH-Px活力和血清CAT活力均顯著升高（P＜0.05）。

表3 5周后小鼠血液和肝臟的各項抗氧化指標(biāo)Table3 Antioxidant capacities in blood and liver from mice fed with experimental diets for 5 weeks

表3 5周后小鼠血液和肝臟的各項抗氧化指標(biāo)Table3 Antioxidant capacities in blood and liver from mice fed with experimental diets for 5 weeks

組別NG組HG組HPL組HPM組HPH組TPM組血液血清MDA含量/（μmol/mL）5.63±0.18a9.37±1.02d7.65±0.26c7.35±0.23bc6.11±0.50a6.94±0.19b紅細(xì)胞SOD活力/（U/g Hb）26 803.9±3 925.1c21 667.3±1 659.0a23 099.7±2 034.7ab25 270.2±2 296.3bc26 648.0±4 197.4c23 433.4±3 414.7abc全血GSH-Px活力/（U/mL）131.37±10.77d64.89±5.71a73.58±4.60b82.85±4.20c84.98±5.04c74.57±4.53b血清CAT活力/（U/mL）25.93±4.30c16.89±2.38a17.51±2.52a24.44±3.03c23.73±1.99bc21.12±3.63b肝臟MDA含量/（μmol/mg pro）2.41±0.36a4.11±0.22c3.46±0.19b3.33±0.23b3.28±0.26b3.39±0.42bSOD活力/（U/mg pro）79.54±6.63b68.31±6.94a71.58±3.01a72.74±4.68a72.41±3.02a73.63±4.90aGSH-Px活力/（U/mg pro）399.99±25.80d162.69±25.36a180.11±15.10ab197.13±20.18b261.65±52.58c186.36±16.76bCAT活力/（U/mg pro）96.04±6.73de77.58±7.46a83.79±5.37b86.37±4.52bc97.60±5.88e90.18±4.35cd

3　討 論

脂質(zhì)代謝紊亂與冠心病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，血清和肝臟中TC和TG水平的長期增高是導(dǎo)致動脈粥樣硬化、誘發(fā)心血管疾病的重要原因［22］。TG是心血管事件的獨立預(yù)測因子，同時與肥胖癥也密切相關(guān)［23］。在東方人群中，血清TC水平每升高0.16 mmol/L，冠心病發(fā)病的相對危險性升高34%［24］。因此，降低TC和TG水平對防治高脂血癥和心血管疾病有重要意義。本研究結(jié)果顯示，給高脂血癥小鼠飼喂200～800 mg/（kg·d）劑量的HPE，可顯著降低血清和肝臟的TC、TG含量，表明酒花多酚有顯著的降脂作用。

已被證實高水平的HDL-C有助于抗動脈粥樣硬化，包括其抑制低密度脂蛋白的氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞不受低密度脂蛋白氧化對細(xì)胞毒性作用的能力［25］。有報道稱原花青素和黃酮類化合物可以增加HDL-C含量［26-27］。Qin Yu等［28］報道了給血脂異?；颊撸?0～65 歲）補充原花青素膠囊（每天4 次，每次80 mg）12 周后，血清LDL-C水平顯著下降了13.63%（P=0.037＜0.05），HDL-C增高了12.42%（P=0.024＜0.05），但血清TC、TG水平?jīng)]有顯著改變。本研究結(jié)果顯示，飼喂酒花多酚能使高脂血癥小鼠血清中HDL-C水平顯著升高，LDL-C水平顯著降低。這可能是由于酒花多酚中含有大量的原花青素和黃酮類化合物，本課題組已有的研究分析表明［6］，HPE中含有原花青素489.6 mg/g，黃酮類化合物261.8 mg/g，它們都有助于高脂血癥動物體內(nèi)HDL-C水平的增加和LDL-C水平的降低。

氧化應(yīng)激與高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要原因［29］。自由基的生成量超出天然抗氧化劑的平衡容量則導(dǎo)致氧化應(yīng)激，高脂飲食可使機(jī)體內(nèi)自由基的生成量增加［30-31］，飲食中的膽固醇在代謝中被運至肝細(xì)胞，生成大量多種氧化產(chǎn)物［32］。因此，高脂飲食導(dǎo)致了體內(nèi)自由基的增加，從而激發(fā)了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成［33］。在本研究中，高脂模型組大鼠血液和肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的顯著增加也證實了以上觀點。本課題組先前［34］報道了酒花多酚醇提物在體外有顯著抗氧化活性，但體外活性不能代表真正的體內(nèi)活性，多酚的抗氧化活性可能會被在體內(nèi)的生物利用度和生物轉(zhuǎn)化率所影響［35］。本研究的結(jié)果顯示，飼喂200～800 mg/（kg·d）劑量的酒花多酚35 d，可使高脂血癥小鼠血液和肝臟的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低，抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT活力顯著增高，表明酒花多酚在體內(nèi)同樣有顯著的抗氧化活性。

茶多酚的降脂抗氧化作用已被證實［36］，本研究選取了茶多酚作為陽性對照組與酒花多酚的降脂抗氧化效果進(jìn)行比較。實驗結(jié)果顯示，與同等劑量（400 mg/（kg·d））的茶多酚組相比，酒花多酚組（HPM，400 mg/（kg·d））小鼠血清LDL-C水平、AI和肝臟TC含量均顯著降低，血清HDL-C水平、CAT活力和全血GSH-Px活力均顯著升高，提示酒花多酚降脂抗氧化效果優(yōu)于同劑量的茶多酚。這可能是由于酒花多酚比茶多酚含有更多的原花青素和黃酮類物質(zhì)。先前的研究表明［6］，酒花多酚中55%以上的多酚物質(zhì)是原花青素，29%以上的多酚物質(zhì)是黃酮類，而茶多酚中原花青素僅占總多酚的8.75%，黃酮類物質(zhì)僅占總多酚的3.72%。原花青素和黃酮類物質(zhì)都是強有力的天然抗氧化劑，能激發(fā)動物體內(nèi)的SOD和GSH-Px活力，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）含量和改善脂質(zhì)代謝狀況。

經(jīng)分析，本實驗所用啤酒花提取物HPE的多酚含量為88.7%，水分含量為4.8%，蛋白質(zhì)含量為5.9%，灰分含量為0.4%，可以認(rèn)為HPE中的少量非酚類物質(zhì)對實驗結(jié)果不構(gòu)成影響，HPE對小鼠的降脂功效主要來自于酒花多酚。

綜上所述，酒花多酚對高脂血癥小鼠具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制脂質(zhì)過氧化、提高抗氧化酶活力、延緩動脈粥樣硬化發(fā)展的功效。目前的研究結(jié)果證實了酒花多酚是一種甚至比茶多酚效果更好的天然降脂抗氧化成分，可以作為預(yù)防動脈粥樣硬化的新藥來源并應(yīng)用到保健食品中。

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Hypolipidemic and Antioxidant Effects of Hop Polyphenols in Hyperlipidemic Mice

GUO Miao， YANG Xiaolan*
（College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

In this study， the hop polyphenol extract （HPE， 88.7% purity） obtained from the supercritical CO2raffinate of waste hops from beer brewing was evaluated for hypolipidemic and antioxidant effects in hyperlipidemia mice in comparison with tea polyphenols at the same dose. The hyperlipidemia mice were orally administered with HPE at doses of 200-800 mg/（kg?d） for five weeks. The results showed that total cholesterol and triglyceride contents in serum and liver，low-density lipoprotein cholesterol level in serum， and atherogenic index in hyperlipidemia mice were decreased significantly in response to HPE administration. Meanwhile， the serum level of high-density lipoprotein cholesterol was significantly increased. In addition， the contents of malondialdehyde in blood and liver were significantly reduced， and catalase activities were significantly enhanced. Superoxide dismutase activities in red blood cells and liver， and glutathione peroxidase activities in blood and liver were significantly elevated. Therefore， HPE has significant hypolipidemic and antioxidant effects in hyperlipidemic mice.

hop polyphenols； hyperlipidaemia； lipid peroxidation； mice

TS201.1

A

1002-6630（2015）03-0183-05

10.7506/spkx1002-6630-201503035

2014-03-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（31171748）；山西省自然科學(xué)基金項目（2006011019）

郭苗（1991—），女，碩士，研究方向為食品與生物技術(shù)。E-mail：851657762@qq.com

楊小蘭（1956—），女，教授，本科，研究方向為食品與生物技術(shù)。E-mail：13934214833@163.com