傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜優(yōu)勢(shì)微生物及其代謝特性

熊 濤，彭 飛，李 嘯，李軍波，關(guān)倩倩

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜優(yōu)勢(shì)微生物及其代謝特性

熊 濤，彭 飛，李 嘯，李軍波，關(guān)倩倩

（南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

采用平板計(jì)數(shù)法分析泡菜發(fā)酵過程中主要微生物的變化規(guī)律，并利用高效液相色譜儀、pH計(jì)等儀器分析底物、代謝產(chǎn)物和pH值的變化。結(jié)果表明：我國(guó)傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵過程中的主要微生物有乳酸菌、醋酸菌、酵母菌及霉菌；發(fā)酵7 d后，鹵水的最終pH值由初始的5.7降至3.2；蔗糖作為發(fā)酵體系內(nèi)的主要碳源，在整個(gè)發(fā)酵過程中被大量代謝利用，發(fā)酵7 d后，蔗糖濃度由初始的74.4 mmol/L變?yōu)?8.4 mmol/L；而葡萄糖和果糖在發(fā)酵過程中沒有明顯被利用，其濃度分別維持在28.1 mmol/L和23.2 mmol/L；檸檬酸與蘋果酸分別在24 h和12 h時(shí)達(dá)到最大濃度（3.4 mmol/L和8.9 mmol/L），然后下降，最后維持穩(wěn)定，因此，發(fā)酵微生物對(duì)檸檬酸和蘋果酸有一定的利用能力；乳酸是發(fā)酵過程中的主要代謝產(chǎn)物并且呈現(xiàn)穩(wěn)定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，其濃度由初始的5.6 mmol/L增長(zhǎng)至149.6 mmol/L；乙酸和乙醇的產(chǎn)生則主要發(fā)生在泡菜的發(fā)酵前期。

泡菜；乳酸菌；發(fā)酵；代謝

泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一，距今已有3 000多年的歷史［1］。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜的加工方式多以自然發(fā)酵為主，即利用附著在蔬菜表面的微生物進(jìn)行發(fā)酵。在鹽水浸泡環(huán)境中，蔬菜本身攜帶的多種微生物（以乳酸菌為主）迅速繁殖，并利用以糖類為主的碳水化合物進(jìn)行代謝活動(dòng)，生成乳酸、乙醇、乙酸等代謝產(chǎn)物和多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從而得到風(fēng)味良好的成熟泡菜。對(duì)泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物和代謝物質(zhì)進(jìn)行分析，是深入研究我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜的必經(jīng)之路。國(guó)內(nèi)外不少研究學(xué)者對(duì)自然發(fā)酵泡菜中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定及特性研究［2］。國(guó)內(nèi)有學(xué)者對(duì)泡菜環(huán)境中的菌株進(jìn)行了分離且采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定［3］：燕平梅等［4］對(duì)泡白菜鹵水中乳酸菌、酵母菌、霉菌和腸桿菌等優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行了分離鑒定和抗菌特性的研究；張偉［5］研究了自然發(fā)酵泡菜過程中主要化學(xué)成分的變化以及乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物菌落長(zhǎng)勢(shì)變化；陳功等［6］對(duì)四川泡菜的揮發(fā)性成分和主體風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析研究。從已有的研究成果來看，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜的微生物動(dòng)態(tài)變化的研究多見于乳酸菌，酵母菌和霉菌則較少，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)泡菜中的醋酸菌進(jìn)行分離計(jì)數(shù)的研究；而在代謝物分析方面，已有的研究主要集中在對(duì)自然發(fā)酵泡菜的還原糖和總酸含量的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)及對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)利用不同的選擇性培養(yǎng)基及鑒定方法，對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物（乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌）進(jìn)行平板分離計(jì)數(shù)，并使用高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC），對(duì)發(fā)酵過程中的多種糖類及有機(jī)酸變化進(jìn)行分析，從而明確泡菜在自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)微生物的菌系變化、代謝底物和代謝產(chǎn)物的含量變化，為進(jìn)一步揭示我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中多菌種協(xié)同發(fā)酵的機(jī)理提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、培養(yǎng)基與試劑

圓白菜、食鹽、冰糖、生姜、大蒜、干辣椒、花椒等購于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

乳酸菌分離計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，配制方法參照GB 4789.35—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 食品中乳酸菌檢驗(yàn)》。酵母菌及霉菌分離計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：虎紅瓊脂，購于北京奧博星公司。醋酸菌分離計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：醋酸菌固體培養(yǎng)基［7］。

氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸鈣、無水乙醇、氯化鐵、濃硫酸（均為分析純） 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸（均為分析標(biāo)準(zhǔn)品） 美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；Aminex-87H色譜柱 美國(guó)伯樂公司、TG-16W微量高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Airtech生物安全柜 蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-25型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1傳統(tǒng)泡菜的制作工藝及配方

表1　泡菜配方Table1 Formulation of Chinese sauerkraut

1.3.2取樣

泡菜入壇后，0～7 d內(nèi)，每隔12 h，取發(fā)酵液進(jìn)行代謝產(chǎn)物、pH值的測(cè)定以及優(yōu)勢(shì)微生物的分離計(jì)數(shù)。

1.3.3優(yōu)勢(shì)微生物的分離計(jì)數(shù)

無菌條件下，取1 mL發(fā)酵液于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分搖勻，制成1：10稀釋菌懸液，然后按照每級(jí)10 倍的次序梯度稀釋。選擇3 個(gè)合適梯度，分別涂布于MRS培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)48 h、虎紅培養(yǎng)基和醋酸菌固體培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度做2 個(gè)平行樣。

1.3.4發(fā)酵液中糖和有機(jī)酸的分析

發(fā)酵液經(jīng)離心（12 000 r/min，10 min）后，取上清液過0.22 μm濾膜，得到濾液用于高效液相色譜分析。色譜條件：進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相為6 mmol/L硫酸溶液，流速為0.5 mL/min，溫度45 ℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。以保留時(shí)間定性，以峰面積定量。示差折光檢測(cè)器檢測(cè)糖醇（蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇）含量，紫外檢測(cè)器檢測(cè)有機(jī)酸（檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸）含量。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵期內(nèi)發(fā)酵液pH值的變化

圖1　發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during the fermentation

由圖1可知，傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中pH值呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵前24 h，pH值即由5.7迅速降至4.2；發(fā)酵第2天pH值下降速率放緩，從4.2降至3.9；發(fā)酵進(jìn)入第3天，pH值持續(xù)下降，并在進(jìn)入第5天后趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值降至3.2。

泡菜發(fā)酵啟動(dòng)后，圓白菜中的蘋果酸和檸檬酸等有機(jī)酸滲出到鹵水中，同時(shí)腸膜明串珠菌、糞腸球菌等乳酸球菌迅速繁殖并代謝產(chǎn)酸，造成了pH值在發(fā)酵初期的快速下降。乳球菌的代謝活動(dòng)會(huì)因低pH值環(huán)境的影響而受到抑制［8］，從而導(dǎo)致菌數(shù)和產(chǎn)酸量的減少，推測(cè)這是造成發(fā)酵第2天pH值下降速率變緩的主要原因。發(fā)酵進(jìn)入第3天后，乳桿菌大量繁殖并產(chǎn)酸，使得泡菜發(fā)酵液pH值進(jìn)一步降低。在整個(gè)發(fā)酵期內(nèi)，乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是發(fā)酵液pH值下降的主要原因。

2.2發(fā)酵期內(nèi)優(yōu)勢(shì)微生物的動(dòng)態(tài)變化

圖2　發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)菌數(shù)的變化Fig.2 Changes in microbial counts during the fermentation

傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌的菌數(shù)變化如圖2所示。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌的數(shù)量快速增長(zhǎng)，并保持穩(wěn)定至發(fā)酵終點(diǎn)。醋酸菌的數(shù)量在發(fā)酵第1天持續(xù)上升至最高值5.2 （lg（CFU/mL）），之后在發(fā)酵的1～1.5 d內(nèi)，緩慢下降至4.9 （lg（CFU/mL））；接著在1.5～3 d內(nèi)，菌數(shù)迅速下降，至檢測(cè)不出。酵母菌和霉菌在泡菜發(fā)酵過程中表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律：發(fā)酵第1天數(shù)量逐步升高至最大值，并在此后持續(xù)降低。不同的是，霉菌在發(fā)酵2.5 d時(shí)未能檢出，酵母菌于發(fā)酵3 d后未能檢出。

發(fā)酵啟動(dòng)后，原先附著于圓白菜上的微生物游離于發(fā)酵液中，從而造成發(fā)酵初始階段鹵水中含有不同數(shù)量的微生物。由于泡菜發(fā)酵環(huán)境中碳源充足（投入的冰糖和圓白菜本身所含糖類的浸出），4 種監(jiān)測(cè)的微生物均在發(fā)酵第1天生長(zhǎng)迅速。從數(shù)量上看，乳酸菌是主導(dǎo)泡菜自然發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)微生物。乳酸菌具有良好的酸耐受性，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)其數(shù)量幾乎沒有降低。泡菜發(fā)酵前期，壇內(nèi)氧氣的消耗和異型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)生的二氧化碳制造了厭氧環(huán)境；而醋酸菌是嚴(yán)格好氧菌，推測(cè)厭氧環(huán)境的形成是其在發(fā)酵3 d后消失的主要原因。酵母菌和霉菌同樣在發(fā)酵進(jìn)行3 d后完全消失，主要原因則可能是pH值的降低，另外厭氧環(huán)境不利于霉菌的生存。在泡菜發(fā)酵中，醋酸菌產(chǎn)生的醋酸給予泡菜一定的香氣，同時(shí)醋酸與乙醇形成酯類也可以增加香氣。霉菌則會(huì)消耗體系中的糖分、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生臭味和亞硝酸等有害物質(zhì)，故其大量繁殖會(huì)影響泡菜的品質(zhì)［9-10］。

2.3發(fā)酵期內(nèi)主要代謝底物含量的變化

蔗糖、葡萄糖和果糖是泡菜發(fā)酵體系中的主要碳源，主要來源于加入的冰糖和蔬菜中本身含有的少量糖類。檸檬酸和蘋果酸是存在于蔬菜中的有機(jī)酸類，其中檸檬酸對(duì)泡菜中香氣的產(chǎn)生很重要，且有文獻(xiàn)報(bào)道檸檬酸和葡萄糖在乳酸菌的代謝中存在協(xié)同代謝作用［11］；蘋果酸的代謝對(duì)泡菜質(zhì)量的穩(wěn)定也有重要的意義［12］。

圖3 發(fā)酵過程中主要代謝底物濃度的變化Fig.3 Changes in substrate concentrations during the fermentation

圖3為上述5 種底物在泡菜發(fā)酵過程中的代謝變化趨勢(shì)。在初始發(fā)酵過程中，蔗糖被顯著代謝，呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)；此后，其下降趨勢(shì)較發(fā)酵前期顯得較為緩慢。蔗糖作為發(fā)酵體系中含量最多的糖，可以被多種微生物代謝利用。異型乳酸發(fā)酵的腸膜明串珠菌可能具有一種特殊的水解酶［13-14］，對(duì)蔗糖有良好的代謝能力且主導(dǎo)著自然發(fā)酵泡菜的前期發(fā)酵過程；酵母菌和霉菌對(duì)蔗糖也有較好的代謝能力，它們?cè)谇捌诘难杆僭鲩L(zhǎng)需要大量碳源，從而導(dǎo)致蔗糖的急劇下降。隨著發(fā)酵過程中pH值的不斷下降，腸膜明串珠菌、酵母菌和霉菌由于較弱的耐酸性而消亡，而耐酸性較強(qiáng)的同型乳酸發(fā)酵菌株主導(dǎo)了泡菜的中后期發(fā)酵過程，其中植物乳桿菌［8］是主導(dǎo)中后期發(fā)酵的主要菌株。植物乳桿菌較腸膜明串珠菌對(duì)蔗糖的利用能力差，但因發(fā)酵后期其活菌數(shù)仍較高，故在發(fā)酵后期蔗糖的利用較前期下降速率稍緩。

葡萄糖和果糖含量在發(fā)酵過程中始終表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。該現(xiàn)象與純菌種發(fā)酵中兩種單糖含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)截然不同［15］，其原因一方面可能是由于酵母菌的存在，其具有蔗糖水解酶，從而使乳酸菌對(duì)蔗糖的利用顯得較容易，另一方面由于發(fā)酵過程中蔬菜組織不斷軟化也會(huì)導(dǎo)致泡菜組織的糖滲出到發(fā)酵液中而使得葡萄糖與果糖含量呈上升趨勢(shì)。

檸檬酸和蘋果酸在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出了相似的變化趨勢(shì)，均在發(fā)酵前期小幅度上升，然后緩慢下降，最終趨于平穩(wěn)。檸檬酸作為風(fēng)味物質(zhì)的前體，其代謝產(chǎn)物對(duì)泡菜的風(fēng)味存在重要的意義；另外，其與糖存在協(xié)同代謝作用，這樣就避免了酵母［16］的二次發(fā)酵。蘋果酸被代謝產(chǎn)生乳酸，增加了泡菜發(fā)酵初期的酸度，對(duì)泡菜的質(zhì)量有一定的意義。

2.4主要代謝產(chǎn)物含量的變化

乳酸是泡菜發(fā)酵的主要有機(jī)酸，其含量直接影響泡菜中菌系的穩(wěn)定性。乙酸作為異型乳酸發(fā)酵菌株的代謝產(chǎn)物之一，適量的乙酸［17］可以有效提高泡菜的感官性質(zhì)。乙醇主要來源于酵母菌的代謝，乙醇的變化可以有效地反映酵母在泡菜發(fā)酵過程中的活動(dòng)。

圖4 發(fā)酵過程中主要代謝產(chǎn)物濃度的變化Fig.4 Changes in metabolic products during the fermentation

圖4描述了3 種主要代謝產(chǎn)物在泡菜發(fā)酵過程中的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵初期，乳酸的含量緩慢升高，隨后其含量迅速增加，直至后期緩慢上升。而乙酸的含量在整個(gè)發(fā)酵過程中都表現(xiàn)出較緩慢地增加，且發(fā)酵前期的變化要較中后期明顯。乙醇的增加主要出現(xiàn)在前4 d，其后趨于平穩(wěn)。

在發(fā)酵前期雖然有大量的蔗糖被利用，但乳酸的含量卻緩慢增加，一方面，由于有真菌的存在，相當(dāng)一部分的蔗糖被利用但是不產(chǎn)乳酸，另一方面，前期主導(dǎo)發(fā)酵的是異型乳酸發(fā)酵的乳酸菌，與同型乳酸發(fā)酵菌相比，其消耗等量蔗糖卻只能產(chǎn)生更少量的乳酸［15］。發(fā)酵中期，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的同型乳酸發(fā)酵菌大量生長(zhǎng)繁殖并主導(dǎo)泡菜的發(fā)酵，使得泡菜液中乳酸含量在發(fā)酵中期迅速增加。在發(fā)酵后期，雖然蔗糖被穩(wěn)定地利用，但此時(shí)泡菜中的一些環(huán)境因素（如高濃度酸，低pH值）已經(jīng)在一定程度上對(duì)乳酸菌有了抑制作用，乳酸菌需要消耗更多的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）來維持細(xì)胞內(nèi)的pH值穩(wěn)定，同時(shí)也調(diào)節(jié)自身的代謝活動(dòng)產(chǎn)生更少的乳酸。乙酸是異型乳酸發(fā)酵菌株通過異型乳酸發(fā)酵途徑的產(chǎn)物之一［18］，其變化主要源于乳酸菌的產(chǎn)生和泡菜組織的滲出，前期異型乳酸菌的迅速增長(zhǎng)使乙酸含量有了明顯增加，隨著酸度的升高，異型乳酸菌由于較弱的耐酸性而死亡，乙酸的變化主要由泡菜組織滲出而顯得變化不大。在發(fā)酵前期，pH值較適宜酵母的生長(zhǎng)時(shí)，酵母菌和異型乳酸發(fā)酵菌株利用蔗糖產(chǎn)生較多的乙醇，發(fā)酵3 d后，由于pH值較低，酵母菌和異型乳酸發(fā)酵菌株逐漸死亡，導(dǎo)致乙醇的量也趨于穩(wěn)定。

3　結(jié) 論

通過對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前2 d，乳酸菌活菌數(shù)迅速升高，之后趨于穩(wěn)定；酵母菌、霉菌和醋酸菌在發(fā)酵前期都有較明顯的生長(zhǎng)，但中期后逐漸消亡；泡菜液pH值在發(fā)酵的初始為5.7，隨著發(fā)酵進(jìn)行急劇下降，發(fā)酵末期達(dá)到3.2；蔗糖作為主要的碳源在整個(gè)發(fā)酵過程中都明顯地被代謝，然而作為碳源的葡萄糖和果糖含量沒有明顯變化；檸檬酸和蘋果酸在發(fā)酵過程中也可被代謝利用；乳酸是乳酸菌在泡菜發(fā)酵中的主要產(chǎn)物，其含量在發(fā)酵過程中穩(wěn)定地上升；乙醇和乙酸的生成主要在泡菜發(fā)酵的前期。在自然發(fā)酵泡菜中微生物的變化及其代謝特性的研究基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步研究單菌種發(fā)酵泡菜及多菌種發(fā)酵泡菜的控制機(jī)理，進(jìn)而提升對(duì)我國(guó)泡菜的理論研究及工業(yè)生產(chǎn)水平。

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Changes and Metabolic Characteristics of Main Microorganisms during Chinese Sauerkraut Fermentation

XIONG Tao， PENG Fei， LI Xiao， LI Junbo， GUAN Qianqian
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， College of Life Science and Food Engineering， Nanchang University，Nanchang 330047， China）

Laboratory scale fermentations of Chinese sauerkraut were performed to investigate the changes in microorganisms， the pH of the brine， the substrates and the metabolic products. The main microorganisms were monitored using selective agar medium. The substrates and the metabolic products were analyzed by high performance liquid chromatography. The results evidenced that the main microorganisms included lactic acid bacteria， acetic bacteria，saccharomycetes and mycete. The pH was reduced from 5.7 to 3.2 after 7 days of fermentation. The utilization of sucrose during the fermentation was strong， as indicated by a reduction from 74.4 to 18.4 mmol/L. However， glucose and fructose were hardly metabolized by the cells and their final concentration were 28.1 mmol/L and 23.2 mmol/L， respectively. Critic acid and malic acid were easily metabolized during the fermentation and their maximum concentrations， （3.4 and 8.9 mmol/L，respectively） were observed after 24 and 12 h of fermentation followed by a decline until reaching a plateau. As the major metabolic product， lactic acid was steadily increased from 5.6 to 149.6 mmol/L during the fermentation； moreover， the levels of ethanol and acetic acid increased in the early stage of the fermentation process.

Chinese sauerkraut； lactic acid bacteria； fermentation； metabolism

TS201.3

A

1002-6630（2015）03-0158-04

10.7506/spkx1002-6630-201503030

2014-04-09

“贛鄱英才555工程”領(lǐng)軍人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（18000063）；江西省教育廳高?？萍悸涞赜?jì)劃項(xiàng)目（贛財(cái)教［2011］243號(hào)）；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題（SKLF-ZZB-201309）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100904）

熊濤（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橐嫔按笞诠吒咧祷?。E-mail：xiongtao0907@163.com