• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

    2015-10-18 09:44:38王紅揚(yáng)唐云明
    食品科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:乙酸鈉硝基苯磷酸酶

    李 星,王 潔,王紅揚(yáng),唐云明*

    (西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶市甘薯工程研究中心,三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

    甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

    李 星,王 潔,王紅揚(yáng),唐云明*

    (西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶市甘薯工程研究中心,三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

    以新鮮甘薯老葉為材料,經(jīng)過勻漿、硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Superdex-200凝膠層析等步驟后,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定獲得了電泳純的酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP),純化后ACP比活力為251.49 U/mg,純化了169.07 倍,回收率為3.50%。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:ACP為單亞基酶,全酶分子質(zhì)量為42.3 kD,單亞基分子質(zhì)量為41.2 kD;最適反應(yīng)溫度65 ℃,最適pH 5.2;在40 ℃以下和pH 4.0~6.0范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定;以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物時(shí),測(cè)得其米氏常數(shù)Km值為0.258 mmol/L;Ca2+和Mg2+對(duì)ACP酶活性有明顯激活作用,K+和Li+對(duì)ACP酶活性無(wú)影響,甲醇、乙二胺四乙酸和草酸對(duì)ACP酶活性的抑制作用較大;Hg2+和Ag+對(duì)ACP酶活性的抑制作用非常明顯。

    甘薯葉;酸性磷酸酶;分離純化;性質(zhì)

    酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP,EC 3.1.3.2)是一種在酸性環(huán)境中催化磷酸單酯水解釋放出無(wú)機(jī)磷酸的水解酶[1],在動(dòng)植物和微生物中都廣泛存在[2-3]。該酶可作為食品添加劑,在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中有重要作用[4-5]。植物體內(nèi)存在3 種磷酸酶:酸性、中性和堿性磷酸酶,而ACP是植物體內(nèi)重要的一種酶,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[4]。在植物體內(nèi),ACP是一種誘導(dǎo)酶,在缺磷的條件下能顯著提高其活性[5]。但因種屬差異,目前關(guān)于ACP具體的生理生化機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。甘薯屬于旋花科甘薯屬甘薯種草本植物,若生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)為多年生植物,若生長(zhǎng)在溫帶地區(qū)則為一年生植物。甘薯作為一種糧食作物在我國(guó)廣泛種植,并且作為多種產(chǎn)品的原材料被大量加工使用[6]。本實(shí)驗(yàn)以甘薯老葉作為研究材料,分離純化酸性磷酸酶,并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,為從植物中分離純化酸性磷酸酶以及甘薯的綜合開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    甘薯葉采自重慶市甘薯工程研究中心研究基地。

    對(duì)硝基苯磷酸二鈉 美國(guó)A m r e s c o公司;DEAE-Sepharose層析柱、Superdex-200凝膠柱、凝膠層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE公司;考馬斯亮藍(lán)G-250 美國(guó)Bio-Rad公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2儀器與設(shè)備

    Seven Easy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;AKTA Prime plus純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司;Milli-Q Plus純水儀美國(guó)Millipore公司;MC4L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Uni-Equip公司;垂直電泳槽和電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.3方法

    1.3.1甘薯葉ACP粗酶液的提取

    新鮮甘薯葉,選擇老葉部分(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明老葉酶活力較幼葉更高)洗凈擦干,準(zhǔn)確稱取100 g,剪碎,以1:4(m/V)的提取比例加入預(yù)冷的50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0);放入組織搗碎機(jī)中攪碎,4 ℃提取2 h,用4 層紗布過濾2 次后在4 ℃條件下12 000 r/min離心60 min,收集上清液,即為粗酶液,測(cè)定粗酶液的酶活力和蛋白質(zhì)含量。

    1.3.2硫酸銨分級(jí)沉淀

    硫酸銨粉末經(jīng)烘箱干燥后,緩慢加入粗酶液中,使粗酶液中硫酸銨含量為10%(體積分?jǐn)?shù)),4 ℃靜置2 h后,4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min,棄去沉淀,收集上清液;然后繼續(xù)向粗酶液中加入硫酸銨至40%,4 ℃冰箱靜置2.5 h,4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min,棄去上清液,收集沉淀;50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解沉淀,測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量后裝入透析袋中,于5 mmol/L乙酸-乙酸鈉透析液(pH 5.0)中4 ℃透析24 h。

    1.3.3DEAE-Sepharose層析

    DEAE-Sepharose層析柱用200 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡后,取經(jīng)過透析的10 mL酶液上樣,用0~1.0 mol/L NaCl、50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)進(jìn)行線性梯度洗脫(10 h NaCl濃度由0變?yōu)? mol/L),收集洗脫液5 mL/管,流速設(shè)定為0.5 mL/min,測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量,收集酶活力較高的幾管,透析12 h后冷凍干燥,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4Superdex-200柱層析

    Superdex-200層析柱經(jīng)50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡后,取濃縮后的酶液3 mL上樣,用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)進(jìn)行洗脫,每管收集3 mL,流速設(shè)定為0.3 mL/min,測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量,收集酶活力較高的1至2 管,用超純水透析12 h后冷凍干燥,得到的酶純品于-20 ℃保存?zhèn)溆?,酶純品粉末?0 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解,使酶液酶活力約為50 U/mL,用于做酶性質(zhì)研究。

    1.3.5ACP活力的測(cè)定

    [7]方法并改進(jìn):向試管中加入2.9 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)(含5 mmol/L的β-巰基乙醇 )和底物(1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉),于37 ℃水浴鍋保溫5 min后,再加入100 μL酶液,反應(yīng)10 min后加入2.5 mL的0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。以100 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉(pH 5.0)緩沖液代替酶液作為對(duì)照調(diào)零,在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度對(duì)應(yīng)對(duì)硝基苯酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)物生成量。酶活力單位(U)定義為:在37 ℃條件下,以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物,每分鐘每升溶液中底物水解后生成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。

    1.3.6蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

    采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定[8-9]。

    1.3.7ACP純度鑒定以及分子質(zhì)量的測(cè)定

    用SDS-PAGE對(duì)凝膠層析過后的樣品進(jìn)行純度鑒定以及單亞基分子質(zhì)量的測(cè)定[10],凝膠過濾法對(duì)全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定[11]。

    1.3.8ACP部分理化性質(zhì)的研究

    1.3.8.1ACP最適溫度和最適pH值測(cè)定

    分別在30~70 ℃和pH 3~8的條件下測(cè)定酶活力,分別以最適條件下測(cè)定的酶活力為100%,其余條件下的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

    1.3.8.2不同溫度和pH值條件下ACP的穩(wěn)定性

    分別在30~70 ℃和pH 3~8條件下,處理1~5 h,每隔1 h測(cè)定酶活力。分別以未處理時(shí)的溫度和pH值條件下的酶活力為100%,其余溫度和pH值條件下測(cè)得的酶活力分別與之相比為相對(duì)酶活力。

    1.3.8.3米氏常數(shù)Km的測(cè)定

    在根據(jù)1.3.8.1節(jié)所測(cè)得的最適溫度和最適pH值條件下,在不同底物濃度(對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L)條件下,測(cè)定ACP活力,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)求出其Km值。

    1.3.8.4不同有機(jī)溶劑對(duì)ACP活性的影響[12]

    分別將甲醇、乙醇和異丙醇與酶液混合,混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同有機(jī)溶劑影響下的酶活力,以不加有機(jī)溶劑時(shí)的酶活力為100%。

    1.3.8.5不同化合物對(duì)ACP活性的影響[12]

    分別將尿素、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid,EDTA)、抗壞血酸和草酸與酶液混合,混合后化合物的濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同化合物對(duì)酶活力的影響,以不加化合物時(shí)的酶活力為100%。

    1.3.8.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響[12]

    分別將各種不同金屬離子與酶液混合,混合后反應(yīng)液中金屬離子的濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后再加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶活力的影響,以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1甘薯葉ACP的分離純化結(jié)果

    圖1 甘薯葉ACP的DEAE-Sepharose離子交換柱層析色譜圖Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ACP from sweet potato leaves

    圖2 甘薯葉ACP的Superdex-200凝膠柱層析色譜圖Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from sweet potato leaves

    硫酸銨分級(jí)沉淀透析后的酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析后的結(jié)果見圖1,酶活力最高管為第46管。收集酶活力較高的組分,經(jīng)透析冷凍干燥濃縮后,Superdex-200凝膠柱層析結(jié)果見圖2,酶活力最高管為第36管,收集酶活力最高的組分,冷凍干燥后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。整個(gè)分離純化過程的結(jié)果如表1所示。

    表1 甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化結(jié)果Table1 Purification of ACP from sweet potato leaves

    2.2甘薯葉ACP的純度鑒定和分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

    圖3 甘薯葉ACP的SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified ACP from sweet potato leaves

    如圖3所示,甘薯葉ACP純化后,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為單一條帶,說(shuō)明該酶樣品已達(dá)到電泳純,通過遷移率計(jì)算出單亞基分子質(zhì)量約為41.2 kD;而凝膠過濾層析法測(cè)定的全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD(圖4),由此推斷甘薯葉ACP是為單亞基酶,這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)ACP為單亞基酶的結(jié)論一致[12-15]。

    圖4 Superdex-200層析法測(cè)得甘薯葉ACP的全酶分子質(zhì)量Fig.4 Estimation of the molecular weight of ACP from sweet potato leaves by Superdex-200 chromatography

    2.3甘薯葉ACP部分性質(zhì)研究

    2.3.1甘薯葉ACP反應(yīng)最適溫度和最適pH值

    在不同溫度和pH值條件下測(cè)定ACP活力,結(jié)果表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃(圖5),最適反應(yīng)pH值為5.2(圖6)。

    圖5 溫度對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of ACP from sweet potato leaves

    圖6 pH值對(duì)甘薯葉酸性ACP活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of ACP from sweet potato leaves

    2.3.2甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

    圖7 甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of ACP from sweet potato leaves

    圖8 甘薯葉ACP的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of ACP from sweet potato leaves

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ACP在40 ℃以下較穩(wěn)定,60~70 ℃溫度范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性較低,在70 ℃保溫1 h以后,酶活力幾乎完全喪失(圖7)。在pH 4~6條件下,穩(wěn)定性較好,酶活力變化趨勢(shì)比較緩慢,pH 5條件下放置5 h后,相對(duì)酶活力還高達(dá)90%以上; pH值<4或者≥7時(shí),酶蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,酶活力下降很快,5 h后相對(duì)酶活力只剩下不到10%(圖8)。

    2.3.3甘薯葉ACP的米氏常數(shù)Km

    在最適溫度和pH值條件下,將不同濃度底物(對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L)加入酶反應(yīng)體系中,測(cè)定不同濃度底物下的ACP酶活力,利用雙倒數(shù)作圖法得Km為0.258 mmol/L(圖9)。

    圖9 雙倒數(shù)法測(cè)得甘薯葉ACP的米氏常數(shù)KmFig.9 KmDetermination of ACP from sweet potato leaves by Lineweaver-Burk plot

    2.3.4不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    圖10 不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from sweet potato leaves

    如圖10所示,ACP在甲醇、乙醇作用下,酶活力均受到強(qiáng)烈抑制,隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大,抑制作用增強(qiáng),當(dāng)有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí),甲醇幾乎抑制了該酶40%的酶活力,而異丙醇體積分?jǐn)?shù)在低于20%時(shí),對(duì)酶有少許的激活作用,體積分?jǐn)?shù)高于20%后,則表現(xiàn)出對(duì)酶有抑制作用。

    2.3.5不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    如圖11所示,隨著濃度的增大,多數(shù)化合物對(duì)甘薯葉ACP的酶活力表現(xiàn)出了抑制作用,其中,草酸對(duì)該酶的抑制作用非常明顯,當(dāng)草酸濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí),ACP基本上檢測(cè)不到酶活力,尿素對(duì)該酶影響作用不明顯,而EDTA在高濃度下也對(duì)酶活性表現(xiàn)出抑制作用,抗壞血酸在低于40 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出對(duì)酶活力少許的激活作用,而在高于40 mmol/L后又體現(xiàn)出對(duì)ACP活力有抑制作用。

    圖11 不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ACP from sweet potato leaves

    2.3.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    圖12 不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.12 Effect of various metal ions on the activity of ACP from sweet potato leaves

    如圖12所示,不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性有不同的影響。隨著離子濃度的增加,Ca2+、Ba2+和Mg2+對(duì)酶活力稍有激活作用,Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+則對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用,其中Hg2+、Ag+對(duì)該酶抑制作用最明顯,當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到0.2 mmol/L時(shí),ACP活力完全喪失。

    3 討 論

    酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提,本實(shí)驗(yàn)從甘薯的老葉中得到了電泳純的ACP。但是與其他材料中分離純化的ACP相比較,回收率偏低,可能原因有:ACP在甘薯中的同工酶較多[12],純化過程中可能丟失了部分同工酶;另外,在上柱過程中溫度不同和洗脫液條件對(duì)酶穩(wěn)定性的影響使酶活力降低,從而也可能致使回收率降低;在透析過程以及上離子柱之前的離心過程中可能損失了部分酶活力,這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    甘薯葉ACP全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD,一般低于其他材料的ACP分子質(zhì)量,如韭菜(59.58 kD)[12]、斑玉蕈(65 kD)[13]、長(zhǎng)毛對(duì)蝦(73 kD)[14],遠(yuǎn)低于意蜂工蜂(135 kD)[15]和海參(147.9 kD)[16],但比綠豆(34.6 kD)[17]高,說(shuō)明了不同種類材料的ACP分子質(zhì)量之間存在著較大的差異,推測(cè)可能是由于生物體為了適應(yīng)環(huán)境形成的。

    甘薯葉ACP的最適溫度為65 ℃,與其他材料的ACP最適溫度相比較高,與韭菜(65 ℃)[12]相同,高于綠豆(40 ℃)[17]、背角無(wú)齒蚌(50 ℃)[18]、草魚(45 ℃)[7]、刺參(45 ℃)[19]。該酶在40 ℃以下活力較穩(wěn)定,這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符。最適pH值為5.2,與綠豆(pH 5.2)[17]相同,與背角無(wú)齒蚌(pH 4.8)[18]和麥芽(pH 5.4)[20]相近,略高于草魚(pH 4.4)[7],遠(yuǎn)高于真菌類樹狀多節(jié)孢(pH 3.0)[21]和海洋藻類三角褐指藻、塔胞藻、海鏈藻(pH 3.0)[22],甘薯葉ACP在pH 4.0~6.0條件下較為穩(wěn)定,并且在pH 5.0時(shí)放置5 h后酶活力幾乎不發(fā)生變化,說(shuō)明甘薯葉ACP在其最適pH值附近穩(wěn)定性較好。

    甘薯葉ACP的Km約為0.258 mmol/L,與來(lái)自草魚的ACP(Km值為0.232 mmol/L)[7]較為相近,比綠豆酸性磷酸酶(Km值為4.28 mmol/L)[17]低很多,和其他植物材料相比都要低很多,說(shuō)明甘薯葉ACP對(duì)底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉的親和力較大。

    Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+對(duì)甘薯葉ACP活力都有較強(qiáng)的抑制作用,尤其是Hg2+、Ag+,在較低濃度下即能對(duì)甘薯葉ACP的酶活力產(chǎn)生抑制作用,這與Pb2+及Ag+對(duì)斑玉蕈[13]和刺參[19]中ACP的強(qiáng)烈抑制作用相似,Zn2+與重金屬離子均為該酶的抑制劑,這些離子直接作用于ACP活性中心的巰基從而導(dǎo)致酶活性喪失。Ca2+和Mg2+對(duì)甘薯葉ACP酶活力有明顯的激活作用,推測(cè)可能是金屬離子與酶的活性中心結(jié)合促進(jìn)了酶的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合,從而促進(jìn)酶的催化反應(yīng),這與多數(shù)文獻(xiàn)一致[19-22],只在洋蔥[23]中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)ACP活力反而有抑制作用,說(shuō)明了同一種金屬離子對(duì)不同材料來(lái)源的ACP活性有不同的影響作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1] MACDONALD K. The hydrolysis of phenyl phosphate by mouseliver acid phosphatase[J]. Biochemical Journal, 1961, 80(1): 154-161.

    [2] DEXTER R. Acid phosphatases of Escherichia coli[J]. Archives Biochemistry and Biophysics, 1960, 89: 97-104.

    [3] YOKOTA Y, NAKANO E. Two acid phosphatases in sea urchin eggs and embryos[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1984, 79(1): 17-22.

    [4] 李傳保, 龔守富. 植物體內(nèi)酸性磷酸酶研究進(jìn)展[J]. 信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等??茖W(xué)校學(xué)報(bào), 2005,15(3): 88-89.

    [5] 黃宇, 張海偉, 徐芳森. 植物酸性磷酸酶的研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(1): 148-154.

    [6] 胡立明, 高蔭榆, 陳才水, 等. 甘薯葉研究進(jìn)展[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 23(1): 79-84.

    [7] 楊立紅, 肖波, 王曉潔, 等. 草魚酸性磷酸酯酶的性質(zhì)及金屬離子對(duì)其活性 的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(5): 969-976.

    [8] 李建武, 余瑞元. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1994: 171-176.

    [9] LAYNE E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins[J]. Methods in Enzymology, 1957, 3: 447-454.

    [10] 朱廣廉, 楊中漢. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量[J].植物生理學(xué)通訊, 1992(2): 43-47.

    [11] 楊安鋼. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2001: 248-252.

    [12] 孫芳, 任美鳳, 胡瑞斌, 等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 187-191.

    [13] 楊立紅, 高興喜, 繆靜, 等. 斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(5): 744-752.

    [14] 陳素麗, 陳清西, 胡天惠, 等. 長(zhǎng)毛對(duì)蝦酸性磷酸酶功能基團(tuán)的研究[J].臺(tái)灣海峽, 1997, 16(1): 81-84.

    [15] 江琰, 劉克武, 雷遠(yuǎn)成. 意蜂工蜂酸性磷酸酶的純化及其酶學(xué)特性[J].昆蟲學(xué)報(bào), 2004, 47(3): 310-315.

    [16] ZHU Beiwei, YU Jianwei, ZHANG Zongshen, et al. Purification and partial characterization of an acid phosphatase from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus[J]. Process Biochemistry, 2009,44(8): 875-879.

    [17] 高亞朋, 蘇茉, 梁建榮, 等. 綠豆酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2011, 26(5): 92-96.

    [18] 魏煒, 張洪淵, 石安靜. 背角無(wú)齒蚌酸性磷酸酶的分離、純化及部分性質(zhì)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1999, 36(3): 570-572.

    [19] 楊立紅, 孫振興, 王曉潔, 等. 刺參酸性磷酸酯酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 441-442.

    [20] 楊彩蘭, 陳巍, 茍春寶, 等. 一種麥芽酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 48(1): 207-212.

    [21] 張國(guó)慶, 王有志, 王守現(xiàn), 等. 樹狀多節(jié)孢酸性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(5): 753-759.

    [22] 王洪斌, 繆雨溪, 李信書, 等. 4種海洋微藻酸性磷酸酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(3): 153-156.

    [23] GUO Jie, PESACRETA T C. Purification and characterization of an acid phosphatase from the bulb of Allium cepa L. var. Sweet Spanish[J]. Journal of Plant Physiology, 1997, 151(5): 520-527.

    Isolation, Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Sweet Potato Leaves

    LI Xing, WANG Jie, WANG Hongyang, TANG Yunming*
    (Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

    Electrophoresis-pure acid phosphatase (ACP) was obtained from sweet potato old leaves via a series of consecutive procedures, including homogenization, extraction, ammonium sulfate fractional precipitation, DEAE-sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration and then identified with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this process, the purification fold was 169.07 and the recovery of ACP activity was 3.50%. The specific activity of the purified enzyme was 251.49 U/mg. The result showed that the enzyme was a single subunit protease with a relative molecular weight of 42.3 kD, and the subunit molecular weight was 41.2 kD. The optimum temperature and pH of the ACP enzyme were 65 ℃ and 5.2, respectively. This ACP was stable below 40 ℃ and in the pH range from 4.0 to 6.0. Its Michaelis-Menten Kinetics (Km) towards p-nitrophenyl phosphate was 0.258 mmol/L. The enzyme activity could be obviously inhibited by methanol, EDTA and oxalic acid and also strongly inhibited by Hg2+and Ag+.

    sweet potato leaves; acid phosphatase; isolation and purification; characterization

    Q946.5

    A

    1002-6630(2015)03-0152-06

    10.7506/spkx1002-6630-201503029

    2014-03-24

    重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC2011AB1027)

    李星(1988—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail:848322361@qq.com

    唐云明(1960—),男,教授,博士,研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail:tbright@swu.edu.cn

    猜你喜歡
    乙酸鈉硝基苯磷酸酶
    TB-COP 對(duì)I2和硝基苯酚的吸附性能及機(jī)理研究
    添加脫氫乙酸鈉導(dǎo)致面包有毒?
    分光光度法測(cè)定污水處理用乙酸鈉含量的研究
    乙酸鈉結(jié)構(gòu)研究
    煤炭與化工(2021年1期)2021-02-26 05:26:48
    堿性磷酸酶鈣-鈷法染色的不同包埋方法比較
    馬尾松果糖-1,6-二磷酸酶基因克隆及表達(dá)模式分析
    磷酸酶基因PTEN對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
    硝基苯催化加氫Pt-MoS2/C催化劑的制備及使用壽命的研究
    不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇、乙酸鈉溶液對(duì)雙乙酸鈉結(jié)晶過程影響
    混二氯硝基苯氯化制備1,2,4-/1,2,3-三氯苯
    a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美最新免费一区二区三区| 简卡轻食公司| 日韩视频在线欧美| 少妇 在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产av不卡久久| 亚洲美女视频黄频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 成人无遮挡网站| 亚洲综合色惰| 婷婷色综合大香蕉| 国产乱人视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 麻豆成人av视频| 久久久欧美国产精品| 一级爰片在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 美女内射精品一级片tv| 日韩成人av中文字幕在线观看| av一本久久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 99热6这里只有精品| 天天躁日日操中文字幕| 欧美一区二区亚洲| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产日韩欧美在线精品| 久久久久久久国产电影| 久久精品夜色国产| 成年人午夜在线观看视频| av卡一久久| 赤兔流量卡办理| 91精品国产九色| 国产中年淑女户外野战色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久精品国产亚洲网站| 最近2019中文字幕mv第一页| 99久久精品国产国产毛片| 91久久精品国产一区二区成人| 18禁在线播放成人免费| 九色成人免费人妻av| av一本久久久久| 精品一区在线观看国产| 欧美另类一区| 久久久久久伊人网av| 日韩大片免费观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 高清毛片免费看| 成年av动漫网址| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久精品国产亚洲av天美| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 高清在线视频一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品国产a三级三级三级| 男女那种视频在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲美女搞黄在线观看| 成年免费大片在线观看| 秋霞在线观看毛片| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久精品欧美日韩精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲性久久影院| 91狼人影院| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 美女被艹到高潮喷水动态| 老女人水多毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久精品夜色国产| 国产精品国产三级国产专区5o| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩av不卡免费在线播放| 两个人的视频大全免费| 永久网站在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产黄片美女视频| 搞女人的毛片| 亚洲无线观看免费| 国产探花极品一区二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| av专区在线播放| 久久久精品免费免费高清| 亚洲人成网站高清观看| av在线app专区| 亚洲图色成人| 国产91av在线免费观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久九九精品影院| 一级毛片我不卡| 久久韩国三级中文字幕| videossex国产| 日本一二三区视频观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 老司机影院成人| 久久久久性生活片| 高清毛片免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久久久久久成人| 麻豆成人av视频| 看十八女毛片水多多多| 大陆偷拍与自拍| 91久久精品电影网| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲美女视频黄频| xxx大片免费视频| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品久久午夜乱码| av在线播放精品| 亚洲综合精品二区| 国产美女午夜福利| 成年免费大片在线观看| 日韩一本色道免费dvd| av线在线观看网站| 18禁动态无遮挡网站| 涩涩av久久男人的天堂| 成人一区二区视频在线观看| 日韩成人伦理影院| 免费av不卡在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 深夜a级毛片| 免费av毛片视频| 日韩av免费高清视频| 欧美激情在线99| 色婷婷久久久亚洲欧美| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲av在线观看美女高潮| 成年女人在线观看亚洲视频 | 国国产精品蜜臀av免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品一二三区在线看| 高清毛片免费看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久6这里有精品| 国内精品宾馆在线| 免费在线观看成人毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av在线观看视频网站免费| 一级毛片 在线播放| 男女国产视频网站| 国产成人a∨麻豆精品| 国产美女午夜福利| 高清在线视频一区二区三区| 黄色配什么色好看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 在线观看一区二区三区| 国产成人福利小说| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久久久国产电影| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久99热这里只有精品18| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜福利视频精品| 99久久精品国产国产毛片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 在线观看人妻少妇| av在线亚洲专区| 在线天堂最新版资源| 国产黄频视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产男女内射视频| 国产精品精品国产色婷婷| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久精品夜色国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 欧美+日韩+精品| 国产免费福利视频在线观看| 男人舔奶头视频| 久久久成人免费电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久韩国三级中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 成人美女网站在线观看视频| 岛国毛片在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一本一本综合久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产黄色免费在线视频| 成人国产av品久久久| 亚洲精品影视一区二区三区av| 老司机影院成人| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 免费观看在线日韩| 日韩制服骚丝袜av| 日韩强制内射视频| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区精品91| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 男人添女人高潮全过程视频| 麻豆乱淫一区二区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲,欧美,日韩| 国产乱人视频| 亚洲av免费在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久亚洲中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美另类一区| 禁无遮挡网站| 亚洲不卡免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲第一区二区三区不卡| 黄片wwwwww| 色哟哟·www| 97热精品久久久久久| 干丝袜人妻中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产有黄有色有爽视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 国国产精品蜜臀av免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲经典国产精华液单| 中文欧美无线码| 欧美另类一区| 久久午夜福利片| 嘟嘟电影网在线观看| 18+在线观看网站| 永久网站在线| www.色视频.com| 国精品久久久久久国模美| 国产中年淑女户外野战色| 精品久久久噜噜| 国产老妇女一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲av一区综合| 国产精品伦人一区二区| 人妻 亚洲 视频| 国产精品久久久久久久电影| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品三级大全| 精品一区二区三区视频在线| videos熟女内射| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产男人的电影天堂91| 国精品久久久久久国模美| 国产精品久久久久久久久免| 中文资源天堂在线| av在线蜜桃| 日韩大片免费观看网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精品456在线播放app| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 交换朋友夫妻互换小说| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久久精品免费免费高清| 国产av码专区亚洲av| 男女下面进入的视频免费午夜| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产日韩欧美在线精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 免费看日本二区| 国产淫语在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| xxx大片免费视频| 亚洲综合精品二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 我要看日韩黄色一级片| 日韩一区二区三区影片| 免费看不卡的av| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品人妻久久久影院| 高清欧美精品videossex| 亚洲图色成人| 三级经典国产精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本av手机在线免费观看| 性色av一级| 国产精品人妻久久久久久| 国产黄色免费在线视频| 国产视频首页在线观看| 免费黄色在线免费观看| 99久久精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日本欧美国产在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 大陆偷拍与自拍| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 日本欧美国产在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费av不卡在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 久久影院123| 色视频www国产| 久久亚洲国产成人精品v| av播播在线观看一区| 午夜亚洲福利在线播放| 久热久热在线精品观看| 亚洲在久久综合| 精品久久久久久久久亚洲| 久久97久久精品| 婷婷色av中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲欧美日韩无卡精品| 黄色怎么调成土黄色| 免费看日本二区| 黄色一级大片看看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲怡红院男人天堂| 69av精品久久久久久| 欧美高清性xxxxhd video| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲av免费高清在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 午夜日本视频在线| av在线播放精品| 99热这里只有精品一区| 国产黄片美女视频| 亚洲欧洲国产日韩| 好男人视频免费观看在线| 免费少妇av软件| 亚洲精品视频女| 超碰av人人做人人爽久久| 91精品国产九色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品日本国产第一区| 18+在线观看网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 69人妻影院| 99热这里只有精品一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 在线观看三级黄色| 午夜激情福利司机影院| av在线亚洲专区| 国产一区二区在线观看日韩| 男男h啪啪无遮挡| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 丝袜喷水一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久国产一区二区| 三级国产精品片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产视频内射| 波野结衣二区三区在线| 国产男女内射视频| 欧美丝袜亚洲另类| 五月开心婷婷网| 亚州av有码| 少妇 在线观看| 精品酒店卫生间| 大片电影免费在线观看免费| a级毛色黄片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 视频中文字幕在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| .国产精品久久| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产男女内射视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 日本欧美国产在线视频| 国产 精品1| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲av一区综合| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线天堂最新版资源| 成人漫画全彩无遮挡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99热这里只有是精品在线观看| 黄色配什么色好看| 国产成人精品婷婷| 青春草国产在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 夫妻午夜视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久久久网色| 人妻一区二区av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 伦精品一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲成人一二三区av| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲精品国产成人久久av| 99热这里只有精品一区| 亚洲av日韩在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 日韩电影二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 51国产日韩欧美| 三级经典国产精品| 一级a做视频免费观看| 免费看av在线观看网站| 日韩国内少妇激情av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 少妇高潮的动态图| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天堂俺去俺来也www色官网| 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇的逼好多水| 亚洲成人一二三区av| 国产爱豆传媒在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 在线观看人妻少妇| 久久99精品国语久久久| 禁无遮挡网站| 精品酒店卫生间| 欧美另类一区| av在线app专区| 国产精品成人在线| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99久久精品国产国产毛片| 国产毛片在线视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 永久网站在线| 免费观看性生交大片5| 精品视频人人做人人爽| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 乱系列少妇在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说 | av女优亚洲男人天堂| 国产毛片a区久久久久| 久久ye,这里只有精品| av在线老鸭窝| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲最大成人中文| 久久精品综合一区二区三区| videos熟女内射| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 五月开心婷婷网| 久久久久久久午夜电影| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜日本视频在线| 在现免费观看毛片| 女人久久www免费人成看片| 国产精品爽爽va在线观看网站| av在线老鸭窝| 草草在线视频免费看| 少妇 在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 69人妻影院| 97超碰精品成人国产| 亚洲国产欧美在线一区| 成人鲁丝片一二三区免费| 两个人的视频大全免费| 一级毛片我不卡| 精品酒店卫生间| 国产高清国产精品国产三级 | 男女那种视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩一区二区三区影片| 永久免费av网站大全| 久久久久九九精品影院| 国产成人freesex在线| 夫妻午夜视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩伦理黄色片| 免费看日本二区| 日日啪夜夜撸| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲第一区二区三区不卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久鲁丝午夜福利片| av一本久久久久| 联通29元200g的流量卡| 亚州av有码| 又爽又黄a免费视频| 在线观看一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲自拍偷在线| 久久精品夜色国产| 日韩人妻高清精品专区| 成年人午夜在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| av卡一久久| 黄色一级大片看看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美激情久久久久久爽电影| 一级毛片久久久久久久久女| 在线播放无遮挡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 赤兔流量卡办理| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女主播在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 身体一侧抽搐| 国产老妇伦熟女老妇高清| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲在久久综合| 在线观看美女被高潮喷水网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产高清国产精品国产三级 | 国产午夜精品一二区理论片| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人综合一区亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产淫语在线视频| 高清av免费在线| 国产色婷婷99| 啦啦啦在线观看免费高清www| 最近最新中文字幕大全电影3| 美女国产视频在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 中国三级夫妇交换| 国产成人精品一,二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 欧美精品国产亚洲| 一级爰片在线观看| 少妇的逼好多水| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一级片'在线观看视频| 欧美潮喷喷水| 久久久精品94久久精品| 看黄色毛片网站| 深爱激情五月婷婷| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲色图av天堂| 丰满少妇做爰视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久国产av精品国产电影| 中文天堂在线官网| 亚洲精品第二区| 久久99精品国语久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 91aial.com中文字幕在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美激情久久久久久爽电影| av在线播放精品| 黄色日韩在线| 国产在视频线精品| 国产精品一区二区性色av| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 51国产日韩欧美| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲av不卡在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 国产91av在线免费观看| 一区二区av电影网| 伊人久久国产一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 成人综合一区亚洲| 国国产精品蜜臀av免费| av在线亚洲专区| 丝袜美腿在线中文| 天天一区二区日本电影三级| 欧美zozozo另类| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲欧美日韩东京热| 色播亚洲综合网| 色网站视频免费|