脫脂羊腦蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產物體外抗氧化活性

常 飛，楊雪果，肖士成，段旭昌，*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌華興羊產業(yè)科技發(fā)展有限公司，陜西 楊凌 712100）

脫脂羊腦蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產物體外抗氧化活性

常 飛1，楊雪果1，肖士成2，段旭昌1，*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊凌華興羊產業(yè)科技發(fā)展有限公司，陜西 楊凌 712100）

以脫脂羊腦蛋白為原料，采用響應面（response surface method，RSM）法建立脫脂羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解回歸模型，優(yōu)化酶解工藝條件，在體外研究脫脂羊腦中性蛋白酶酶解產物的抗氧化性能。結果表明：脫脂羊腦蛋白底物質量濃度為3.03 g/100 mL，酶添加量為5 653.20 U/g，溫度為39.4 ℃時，脫脂羊腦蛋白水解度最高，達到（14.59±1.26）%。當脫脂羊腦蛋白水解度為（14.39±1.17）%時，酶解產物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基（?OH）清除能力最強；當脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時 ，酶解產物對超氧陰離子自由基（O2-?）清除能力和總還原能力最強；當脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時，酶解產物對DPPH自由基、?OH、O2-?、亞硝酸根陰離子的IC50分別為2.49、3.13、10.37、10.89 mg/mL，酶解產物對Fe2+螯合率的IC50為7.48 mg/mL，證明脫脂羊腦蛋白酶解產物具有一定抗氧化活性。

羊腦蛋白；酶解產物；響應面；抗氧化活性

羊腦，為?？苿游锷窖蚧蚓d羊的腦髓，富含抗壞血酸、核黃素、煙酸、硫胺素、卵磷脂、腦苷脂、蛋白質、脂肪、鈣、磷、鐵等營養(yǎng)成分及神經遞質、神經生長因子、神經肽、乙酰膽堿及黏多糖等多種特殊功能成分?！侗静菥V目》記載，羊腦味甘，性溫，微毒，歸心、肝、腎經，具有補虛健腦，潤膚作用，中醫(yī)用于主治體虛頭昏，皮膚皸裂，筋傷骨折等癥。羊腦中的腦啡肽能夠激活處于抑制沉睡狀態(tài)的腦細胞，對因腦損傷導致的后遺癥有很好的恢復作用；羊腦中的生長抑素（somatosatin）可以抑制生長激素活性；促腎上腺皮質激素（adreno-cortico-tropic-hormone）可以維持腎上腺正常形態(tài)和功能。

酶解食源性蛋白制備活性肽是目前關于食品蛋白功能性的研究熱點之一，近年來研究者從食源性蛋白制備了 多種能抑制自由基產生和清除自由基的抗氧化功能肽。Memarpoor-Yazdi等［1］利用超濾、反相液相色譜等分離技術從大棗蛋白酶解液中分離出兩種抗氧化肽，其分子質量分別為678.3、482.27 kD；張苗等［2］從甘薯蛋白酶解液中分離純化出了Thr-Tyr-Gln-Thr-Phe、Ser-Gly-Gln-Tyr-Phe-Leu、Tyr-Met-Val-Ser-Ala-Ile-Trp-Gly、Tyr-Tyr-Ile-Val-Ser和Tyr-Tyr-Asp-Pro-Leu抗氧化肽，這些抗氧化肽都表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性。抗氧化肽的研究一直是天然抗氧化劑研究中的熱點之一。

目前，關于羊腦蛋白的研究尚少，羊腦的利用價值也沒有得到深入的開發(fā)，市場所售羊腦的價格僅為10 元/kg，遠遠低于羊肉的價格。本研究通過響應面法優(yōu)化羊腦蛋白的酶解工藝條件，并研究羊腦蛋白酶解產物的體外抗氧化活性，旨在為羊腦深加工和功能產品開發(fā)，提高羊腦加工利用效益提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

羊腦由陜西楊凌華興羊產業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，羊品種為陜北絨山羊。

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、胃蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；木瓜 蛋白酶 西安沃爾森生物技術有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；菲洛嗪、阿拉丁試劑、抗壞血酸 成都市科龍化工試劑廠；石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、亞硝酸鈉、鄰苯三酚、茚三酮等均為國產分析純。

1.2儀器與設備

LGJ-100型冷凍干燥機 北京四環(huán)儀器公司；索氏提取器 上海洪紀儀器設備有限公司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司；JYL-CO12九陽料理機九陽股份有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1脫脂羊腦蛋白粉的制備

將取回的新鮮羊腦用自來水清洗去除表面雜質和鮮血，于-60 ℃條件下冷凍24 h，之后于9.5 Pa，-40 ℃條件下冷凍干燥48 h，凍干后的羊腦經九陽料理機粉碎30 s過100 目篩，用濾紙包裹后放入索氏提取器中用石油醚脫脂12 h，脫脂后的羊腦分散于玻璃紙上于通風櫥放置24 h充分揮發(fā)殘留的石油醚。然后再用九陽料理機粉碎30 s過100 目篩，用自封袋包裝后于-60 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2脫脂羊腦蛋白酶解工藝流程

脫脂羊腦粉→按比例加蒸餾水混勻→調節(jié)pH值→保溫酶解→沸水滅酶10 min→5 400 r/min離心10 min→取上清液得到酶解液。

1.3.3脫脂羊腦蛋白水解蛋白酶的選擇

稱取0.5 g脫脂羊腦蛋白粉于100 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水攪拌均勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調節(jié)至各水解蛋白酶的最適pH值，按照加酶量為4 000 U/g脫脂羊腦蛋白粉的比例分別加入枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，分別置于各自最適水解溫度下水解2 h，各蛋白酶的水解條件見表1。酶解結束后，沸水浴滅酶10 min，5 400 r/min離心10 min后，取上清液測定各酶解液的水解度，根據水解度高低選擇水解效果較好的蛋白酶作為最適的脫脂羊腦蛋白水解酶。

表1　不同蛋白酶水解實驗條件Table1 Experimental conditions for different proteases

1.3.4枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白的單因素試驗

1.3.4.1底物質量濃度對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋 白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在水解時間為2 h，加酶量為4 000 U/g，酶解溫度為40 ℃，pH 7.0的條件下，選取脫脂羊腦蛋白底物質量濃度分別為1、2、3、4、5 g/100 mL，研究底物質量濃度對中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者做為最適酶解脫脂羊腦蛋白的底物質量濃度。

1.3.4.2酶解溫度對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在底物質量濃度3 g/100 mL，加酶量4 000 U/g，pH 7.0條件下，分別選取酶解溫度為30、35、40、45、50 ℃，水解2 h，研究酶解溫度對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者優(yōu)選出最適酶解溫度。

1. 3.4.3 酶添加量對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響

以優(yōu)選的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶為水解酶，在底物質量濃度為3 g/100 mL，酶解溫度為40 ℃，pH 7.0條件下，選取酶添加量分別為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，水解2 h，研究酶添加量對枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解羊腦蛋白水解度的影響，以水解度最大者優(yōu)選出最適酶用量。

由于枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解pH值已經由試劑公司給出，故未將pH值作為工藝優(yōu)化的因素進行試驗。

1.3.5響應面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白條件

在單因素試驗基礎上，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理。 以 酶解溫度、底物質量濃度、酶添加量為自變量，蛋白質水解度為響應值，進行三因素三水平的響應面試驗設計，試驗設計和分析采用Desigh-Expert 7.0 Trial軟件。

1.3.6脫脂羊腦蛋白水解度與酶解產物抗氧化活性關系研究

在優(yōu)化的條件下，取0.5 g脫脂羊腦粉，加蒸餾水混勻，調節(jié)pH 7.0，加適量枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，分別酶解1、2、3、4、5、6、7 h，利用酶解時間控制羊腦蛋白水解度，之后離心，取上清液，對所得的酶解液進行水解度測定和抗氧化能力測定實驗，以不酶解羊腦蛋白上清液做對照實驗，研究羊腦不同水解度與抗氧化活性之間的關系，選擇出抗氧化性最強的酶水解度。

1.3.7脫脂羊腦蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

采用茚三酮法測定酶解液的水解度［3-4］。

1.3.8脫脂羊腦蛋白酶解產物抗氧化活性的測定

1.3.8.1脫脂羊腦蛋白酶解產物對DPPH自 由基清除率的測定［5］

用95%乙醇將DPPH配制成0.1 mmol/L的溶液，取2 mL DPPH乙醇溶液置于不同試管中，分別加入2 mL脫脂羊腦蛋白酶解液和不同濃度的VC溶液試樣，振蕩混勻，于室溫下暗反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度，分別以蒸餾水代替試樣和DPPH乙醇溶液做空白實驗，DPPH自由基清除率按公式（1）計算，比較脫脂羊腦蛋白酶解液與VC對DPPH自由基清除效果。

式中：As為試樣與DPPH乙醇溶液反應吸光度；A0為9 5%乙醇代替DPPH乙醇溶液的對照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。

1.3.8.2脫脂羊腦蛋白酶解產物總還原能力的測定［6］

分別取1 mL脫脂羊腦蛋白水解液或不同濃度VC溶液于試管中，分別加入2.5 mL、0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液，充分混勻，于50 ℃水浴中反應20 min，冷卻至室溫，再分別加入2.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸溶液，振蕩后，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，依次分別加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液，充分振蕩，室溫靜置10 min，在700 nm波長處測其吸光度，用吸光度大小表示檢測試樣的總還原力大小。比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC的總還原能力。

1.3.8.3脫脂羊腦蛋白酶解產物對·OH清除率測定［7］

先在不同試管中加入1 mL 0.15 mol/L的硫酸亞鐵溶液和1 mL 2 mmol/L水楊酸鈉溶液，然后分別加入1 mL脫脂羊腦蛋白酶解液或不同濃度VC溶液試樣，再分別 加入1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液啟動反應，于37 ℃反應1 h后，在510 nm波長處測定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和過氧化氫溶液做空白對照，·OH清除率按公式（2）計算，比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC對·OH清除效果。

式中：As為試樣的吸光度；A0為蒸餾水替代過氧化氫的對 照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的對照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣的空白吸光度。1.3.8.5 脫脂羊腦蛋白酶解產物對亞硝酸根陰離子清除能力測定［9-10］

取1 mL酶解液或不同濃度VC溶液于不同試管中，分別加入l mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，于37 ℃條件下反應30 min，再分別加入l mL 質量分數(shù)為0.4%對氨基苯磺酸，搖勻靜置5 min；再分別加入0.5 mL質量分數(shù)為0.2%鹽酸萘乙二胺顯色劑，搖勻，靜置反應15 min，于540 nm波長處測定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和亞硝酸鈉溶液做空白實驗，亞硝酸根陰離子清除率按公式（4）計算，比較脫脂羊腦蛋白水解液與VC對亞硝酸根陰離子清除效果。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代亞硝酸鈉溶液對照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

1.3.8.6脫脂羊腦蛋白酶解產物對亞鐵離子螯合能力測定［11］

取3 mL脫脂羊腦蛋白酶解液或不同濃度乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）溶液試樣于不同試管中，分別加入0.1 mL 0.2 mmol/L氯化亞鐵溶液，混合均勻，反應3 min，分別加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液啟動反應，劇烈振蕩于室溫放置10 min，在562 nm波長處測定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和氯化亞鐵溶液做空白實驗，亞鐵離子螯合率按公式（5）計算，比較脫脂羊腦蛋白 水解液與EDTA-2Na對亞鐵離子的螯合效果。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代氯化亞鐵溶液的對照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

以上抗氧化能力測定實驗中，除了亞鐵離子螯合能力測定用EDTA-2Na做陽性對照外，其余抗氧化實驗以VC做陽性對照，用以考察酶解液的抗氧化活性強弱。

2　結果與分析

2.1脫脂羊腦蛋白水解酶選擇

圖1　蛋白 酶種類對脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of enz yme type on the deg ree of hydrolysis （DH） of goat brain protein

由圖1可知，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對脫脂羊腦蛋白的水解效果最好，水解度為（12.39±0.72）%，其次是胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶水解效果最差。說明枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對脫脂羊腦蛋白水解較為徹底，能得到大量羊腦蛋白水解的小分子肽。Chalamaiah等［12］對魚卵蛋白水解制備抗氧化肽的研究結果表明，大分子質量蛋白經水解后所得的小分子質量多肽具有更強的抗氧化性，所以選擇枯草芽孢桿菌中性蛋白酶作為脫脂羊腦蛋白水解的蛋白酶。

2.2枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解脫脂羊腦蛋白的單因素試驗

由圖2可知，脫脂羊腦蛋白水解度呈先升高后降低的趨勢，當脫脂羊腦蛋白質量濃度為3 g/100 mL時，水解度達到最大。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因為在水解酶濃度一定條件下，當脫脂羊腦蛋白質量濃度小于3 g/100 mL時，隨著其質量濃度的增加，蛋白酶與脫脂羊腦蛋白的接觸幾率增加，水解蛋白較為徹底，因而導致水解度升高；當?shù)孜镔|量濃度大于3 g/100 mL時，酶濃度成為影響酶解效果的主要因素，隨著脫脂羊腦蛋白質量濃度繼續(xù)增加時，酶濃度逐漸不足而導致蛋白水解不徹底。因此在其他水解條件一定時，脫脂羊腦蛋白質量濃度為3 g/100 mL時，水解效果最好，因此底物質量濃度選為2～4 g/100 mL。

圖2　底物質量濃度對脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis （DH）of goat brain protein

圖3　酶解溫度對脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis （DH）of goat brain protein

由圖3可知，在一定溫度范圍內，隨著酶解溫度的升高，脫脂羊腦蛋白水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當酶解溫度為40 ℃時，水解度達到最大。枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的最適酶解溫度是40 ℃，當溫度偏離最適工作溫度越遠，酶解效果越差。因此最優(yōu)水解溫度選為35～45 ℃。

圖4　酶添加量對脫脂羊腦蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis （DH） of goat brain protein

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，脫脂羊腦蛋白水解度也不斷升高，當酶添加量達到5 000 U/g時，水解度升高不再明顯，因此酶添加量選為4 000～6 000 U/g。

2.3響應面法優(yōu)化脫脂羊腦蛋白枯草芽孢桿菌中性蛋白酶水解條件

表2　Box-Behnken試驗設計方案與結果Table2 Box-Behnken design and results

表3　響應面二次模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

響應面法優(yōu)化脫脂羊腦蛋白中性蛋白酶水解試驗結果見表3，通過Design-Expert 7.0軟件對表3數(shù)據進行統(tǒng)計分析，結果見表4。回歸方程R2=0.979 4，說明該模型方程有很好的精密度，回歸效果較好，可信度高。回歸方程模型達到極顯著水平（P＜ 0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型有較好的擬合效果。回歸系數(shù)顯著性檢驗表明，因素X1、對蛋白水解度的影響達到極顯著水平；因素X2、X1X2、對蛋白水解度的影響達到顯著水平。由主效應P值可知，在試驗范圍內各因素對脫脂羊腦蛋白酶解水解度影響程度大小依次為酶添加量X3＞酶解溫度X1＞底物質量濃度X2。以酶解溫度（X1）、底物質量濃度（X2）、酶添加量（X3）為自變量 ，脫脂羊 腦蛋白水解度Y為響應值， 經回歸擬合后，得到回歸方程：

圖5　酶解溫度、底物質量濃度和酶添加量交互作用影響水解度的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the effects of three hydrolysis parameters on degree of hydroly sis （DH）

由圖5可知，當酶添加量為4 000 U/g時，水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當?shù)孜镔|量濃度 處于低水平時，水 解度隨著溫度升高變化較大，而當?shù)孜镔|量濃度處于高水平時，水解度隨著溫度升高變化較小； 水解度隨底物質量濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當酶解溫度處于低水 平時，水解度隨著底物質量濃度升高變化較小， 而當酶解溫度處于高水平時，水解度隨著底物質量濃度升高變化較大。當酶解溫度為40 ℃、酶添加量處于低水平時，水解度隨著底物質量濃度升高而增大，當酶添加量處于高水平時，水解度隨著底物質量濃度升高先增大后減小。

通過Design-Expert 7.0軟件分析確定出脫脂羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶最佳酶水解工藝條件為：酶解溫度39.4 ℃，底物質量濃度3.03 g/100 mL，酶添加量5 653.20 U/g，此時得到的水解度預測值為14.79%。根據所得的分析數(shù)據進行3 組驗證實驗，得到最佳水解度實際值為（14.59±1.26）%，與模型預測結果偏差不大，證明該回歸模型具有良好的預測意義。

2.4脫脂羊腦蛋白水解度與酶解產物抗氧化活性關系

蛋白質經蛋白酶水解后可形成具有一定功能特性的小分子肽段，但并不是水解度越高，多肽的功能性越強，當水解過度時，多肽的功能性會降低或消失［13］。因此，本實驗在酶水解優(yōu)化試驗基礎上，通過水解時間來控制羊腦蛋白水解度，研究羊腦蛋白水解度與酶解產物的抗氧化能力之間的關系。

圖6　酶解產物水解度與抗氧化活性的關系Fig.6 Relationship between DH and antioxidant activities of hydrolysates

由圖6可知，枯草芽孢桿菌中性蛋白酶對脫脂羊腦蛋白的水解度隨水解時間延長不斷升高。由圖6a可知，隨著脫脂羊腦蛋白水解度的增大，酶解產物對DPPH自由基清除率先增加，當脫脂羊腦蛋白用中性蛋白酶水解4 h，水解度達到（14.39±1.17）%時，酶解產物對DPPH自由基清除率達到最 大值，而后酶解產物的DPPH自由基清除率隨水解度升高而降低。由圖6b可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物對O2-?清除率隨蛋白水解度增加先增加后降低，當脫脂羊腦蛋白水解3 h，水解度為（12.48±0.71）%時，對O2-?清除率達到最大值。由圖6c可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物對?OH清除率隨蛋白水解度增加先增加后降低，當脫脂羊腦蛋白水解4 h，水解度為（14.39±1.17）%時，對?OH清除率達到最大值。由圖6d可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物的總還原力隨蛋白水解度增加先增加后降低，當脫脂羊腦蛋白水解3 h，水解度為（12.48±0.71）%時，酶解產物的總還原力達到最大值。

由于酶解3 h與酶解4 h所得酶解液的抗氧化能力差別不大，在考慮到節(jié)約時間的情況下，酶解時間確定為3 h。由圖6可知，酶解4 h以上，酶解液的抗氧化能力逐漸減弱，原因是原 有的功能性肽段在繼續(xù)水解過程中因過度水解為分子質量更小的片段而失去了原有的活性，這與Klompong等［14］得到的過度水解會減弱多肽的抗氧化活性和其他功能特性的結論是一致的。

另外，當脫脂羊腦蛋白未經水解時，其產物的抗氧化活性明顯低于酶解之后酶解液的抗氧化性，原因是酶解過程中，蛋白酶將一些大分子的羊腦蛋白水解為具有抗氧化活性的小分子多肽。由此可知，經過酶解后的脫脂羊腦蛋白酶解液比未經酶解的脫脂羊腦蛋白具有更強的抗氧化性。

2.5脫脂羊腦蛋白酶解產物的抗氧化活性

圖7　不同質量濃度酶解產物與對照的抗氧化活性Fig.7 Comparisons of antioxidant activities between hydrolysates and contr ol at different concentrations

不同質量濃度酶解產物及其對照的抗氧化能力如圖7所示。由圖7a、7b可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物表現(xiàn)出了一定的DPPH自由基清除能力，當酶解產物質量濃度小于3 mg/mL時，清除率與酶解產物質量濃度呈線性關系，酶解產物質量濃度大于3 mg/mL時，隨著其質量濃度 的增大，清除率的變化率降低。通過方程計算可得，VC和酶解產物 對DPP H自由基的IC50分別為0.049 mg/mL和2.49 mg/mL，酶解產物IC50值為VC的50.82 倍，說明脫脂羊腦蛋白酶解產物對DPPH自由基的清除能力遠遠低于VC，但高于Klomklao等［15］制得的鯰魚蛋白酶解產物（酶解產物質量濃度為10 mg/mL時，清除率 小于20%）、Naqash等［16］制得的金線魚蛋白 酶解產物（酶解產物質量濃度為3 mg/mL時，清除率為48%）和Venuste等［17］制得的南瓜蛋白酶解產物（當酶解產物質量濃度為3 mg/mL時，清除率小于50%），由此說明，相 對于其他抗氧化肽而言，脫脂羊腦蛋白酶解產物有較強的DPPH自由基清除能力。

由圖7c、7d可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物對?OH的清除率隨著其質量濃度的升高而增強，并且呈現(xiàn)出良好的線性關系，由圖中的回歸方程計算可知，VC和酶解產物對?OH的IC50分 別為0.15 mg/mL和3.13 mg/mL。羊腦 蛋白酶解產物對?OH的清除能力低于VC，但高于Zhuang Hong等［5］制得的玉米蛋白酶解產物（酶解產物質量濃度為5 mg/mL時，清除率為50.76%）和楊露等［18］制備的馬面魚骨膠原多肽（多肽質量濃度為10 mg/mL時，清除率小于50%），由此說明，相對于其他酶解產物而言，脫脂羊腦蛋白酶解產物具有較強的清除?OH的能力。

由圖7g、7h可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物具有清除亞硝酸鹽的能力，對亞硝酸鹽的清除率隨著其質量濃度的升高而增強，并且呈現(xiàn)出較好的線性關系，由回歸方程計算可 知，VC和酶解產物對亞硝酸鹽的IC50分別為0.03 mg/mL 和10.89 mg/mL。雖 然脫脂羊腦蛋白酶解產物具有一定清除亞硝酸鹽的能力，但遠遠低于VC。

由圖7i、7j可知，脫脂羊腦蛋白酶解產物有一定螯合亞鐵離子的能力，對亞鐵離子的螯合率隨其質量濃度的升高而增強，由回歸方程計算可知，EDTA-2Na和酶解產物對亞鐵離子的IC50分別為16.35 ?g/mL和7.48 mg/mL。脫脂羊腦蛋白酶解物對亞鐵離子的清除能力不僅遠遠低于EDTA-2Na，且與Naqash等［16］制得的金線魚蛋白酶解產物（酶解產物質量濃度為3 mg/mL時，清除率大于60%）、Chalamaiah等［12］制得的南亞野陵卵蛋白酶解產物（酶解產物質量濃度為2.5 mg/mL時，清除率為56.80%）、Memarpoor-Yazdi等［1］制得的棗蛋白酶解產物（酶解產物質量濃度為1 mg/mL時，清除率為21.60%）相比，脫脂羊腦蛋白酶解產物的亞鐵離子螯合能力也較弱。

3　結 論

脫脂羊腦蛋白最適水解酶為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。在底物質量濃度為3.03 g/100 mL，酶添加量為5 653. 20 U/g底物，水解溫度為39.4 ℃，pH 7.0時，脫脂羊腦蛋白的水解度最高，可達（14.59±1.26）%。

當脫脂羊腦蛋白水解度為（14.39±1.17）%時，酶解產物對DPPH自由基和?OH清除能力最強；當脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時 ，酶解產物對清除能力最強且總還原能力最強；當脫脂羊腦蛋白水解度為（12.48±0.71）%時，酶解產物對DPPH自由基、?OH、、亞硝酸根陰離子的半數(shù)抑制率IC50分別為2.49、3.13、10.37、10.89 mg/mL，對Fe2+螯合率的IC50為7.48 mg/mL。

脫脂羊腦蛋白酶解產物的抗氧化能力遠低于VC或EDTA-2Na，與其他酶解制備抗氧化肽相比，脫脂羊腦蛋白酶解產物具有較強清除DPPH自由基、?OH和O2-?能力，但螯合亞鐵離子能力上低于其他酶解制備的抗氧化肽。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Goat Brain Protein and Antioxidant Activity of the Resultant Hydrolysates

CHANG Fei1， YANG Xueguo1， XIAO Shicheng2， DUAN Xuchang1，*
（1. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China；2. Shaanxi Huaxing Goat Industry Science and Technology Development Co. Ltd.， Yangling 712100， China）

The enzymatic hydrolysis parameters of defatted goat brain protein with Bacillus subtilis neutral protease were optimized by response surface methodology. The optimized parameters were determined as fol lows: substrate concentration，3.03 g/100 mL； enzyme/substrate ratio， 5 653. 20 U/g； and hydrolysis temperature， 39.4 ℃. The maximum degree of protein hydrolysis was （14.59±1.26） % with the optimized parameters. The antioxidant activity of the resultant hydrolysates was investigated in vitro. The antioxidant activity presented its maximum value when the hydrolysis degree was （12.48±0.71）%. The IC50of the protein hydrolysates for scavenging 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH）， hydroxyl， superoxide anion， and nitrite radicals were 2.49， 3.13， 10.37 and 10.89 mg/mL， respectively， and the IC50for chelating Fe2+ions was 7.48 mg/mL. These results suggest that the protein hydrolysates possess excellent antioxidant activity.

goat brain protein； enzymatic hydrolysate； response surface methodology； antioxidant activity

TS209

A

1002-6630（2015）03-0114-08

10.7506/spkx1002-6630-201503022

2014-04-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD28B05-3）

常飛（ 1987—），男，碩士研究生，主要從事食品加工新技術研究。E-mail：changfeibest@126.com

段旭昌（1965—），男，副教授，博士，主要從事天然產物及食品加工新技術研究。E-mail：duanxc1965@tom.com