川紅工夫加工過(guò)程多酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶的變化規(guī)律

羅理勇，曾 亮，李洪軍*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)茶葉研究所，重慶 400715）

川紅工夫加工過(guò)程多酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶的變化規(guī)律

羅理勇1，2，曾 亮1，2，李洪軍1，*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)茶葉研究所，重慶 400715）

以四川小葉種群體品種的一芽二葉為原料，采用傳統(tǒng)工藝制備川紅工夫，檢測(cè)其茶多酚、黃酮、兒茶素、茶黃素、茶紅素的含量，以及多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性的變化，分析多酚類化合物含量與其形成相關(guān)酶活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明：茶多酚和兒茶素含量在加工過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；黃酮、茶黃素和茶紅素含量在揉捻階段顯著增加，黃酮和茶黃素含量在發(fā)酵過(guò)程中較揉捻時(shí)降低；多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性在揉捻階段呈較顯著下降趨勢(shì)。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：茶多酚含量與多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性之間存在極顯著正相關(guān)；茶黃素含量與POD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)；茶紅素含量與POD活性及PPO活性分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)。適當(dāng)延長(zhǎng)揉捻時(shí)間和減少發(fā)酵時(shí)間，或是在發(fā)酵過(guò)程中采用提高多酚形成相關(guān)酶活性的方法，可制備出高茶黃素含量的川紅工夫。

川紅工夫；多酚；多酚氧化酶；過(guò)氧化物酶；相關(guān)性分析

四川工夫紅茶（簡(jiǎn)稱川紅工夫）誕生于20世紀(jì)50年代，是四川、重慶地區(qū)采用當(dāng)?shù)仄贩N加工制成的一種獨(dú)特風(fēng)味紅茶，也是我國(guó)的傳統(tǒng)出口茶類之一。川紅工夫原產(chǎn)于四川省宜賓地區(qū)，在國(guó)際市場(chǎng)上有較高的聲譽(yù)，其品質(zhì)特點(diǎn)是條索緊細(xì)、毫峰顯露、色澤烏潤(rùn)、香氣鮮嫩、滋味鮮爽、湯色紅亮、葉底嫩勻［1］。制作川紅工夫常用的品種有早白尖和四川小葉種（群體品種），其中四川小葉種群體品種是最常用且最具特色的，常被選為制作高品質(zhì)川紅工夫的原材料。

紅茶的加工工序有萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥，其中萎凋和發(fā)酵對(duì)紅茶品質(zhì)的形成有至關(guān)重要的作用。茶鮮葉中的化學(xué)成分及部分酶活性決定了制成紅茶的品質(zhì)特征，其中對(duì)品質(zhì)影響最為重要的是多酚類物質(zhì)、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）。紅茶萎凋工序中的PPO活性高低，對(duì)紅茶后期的發(fā)酵程度有較大影響［2］。發(fā)酵工序中對(duì)多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶類主要為PPO和POD［3］。針對(duì)酶活性對(duì)紅茶品質(zhì)的影響，前人研究了紅茶發(fā)酵過(guò)程中添加外源多酚來(lái)提高發(fā)酵葉中的PPO活性，結(jié)果表明可提高茶黃素含量，改善紅茶湯色，并增加紅茶香氣［4］。紅茶發(fā)酵過(guò)程中，兒茶素發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，主要生成茶黃素和茶紅素［5］。自1957年Robert發(fā)現(xiàn)茶葉中的茶黃素以來(lái)，大量的科學(xué)研究證明其具有多種功效，如抗氧化、預(yù)防心血管疾病、降血糖等作用［6-7］，并作為一種天然色素廣泛使用。當(dāng)前研究表明茶黃素和茶紅素是紅茶重要的呈味物質(zhì)與色澤因子，且與紅茶品質(zhì)呈正相關(guān)［3］；影響茶黃素和茶紅素形成的重要工藝環(huán)節(jié)是萎凋和發(fā)酵工藝［8］。

由于川渝地區(qū)茶葉的內(nèi)含成分豐富，特別是多酚類物質(zhì)含量較東部茶區(qū)高，因此生產(chǎn)的工夫紅茶也具有其獨(dú)特的品質(zhì)?；诩t茶加工過(guò)程中多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化是形成紅茶主要滋味特征的關(guān)鍵，本研究依據(jù)傳統(tǒng)川紅工夫的加工工藝，從鮮葉到制成品系統(tǒng)研究加工過(guò)程中多酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶的變化規(guī)律，為加工高茶黃素含量川紅工夫提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茶樹(shù)鮮葉：2013年4月采集重慶市茶業(yè)集團(tuán)二圣茶廠的四川小葉種群體品種，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉。

硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、蘆丁、三氯化鋁、草酸、4-甲基-2-戊酮、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、30%過(guò)氧化氫等 重慶滴水實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；二苯基硼酸-2-氨基乙基酯 北京百靈威科技有限公司；表沒(méi)食子兒茶素（（-）-epigallocatechin，EGC）、兒茶素（catechin，C）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（（-）-epigallocatechingallate，EGCG）、表兒茶素（L-epicatechin，EC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（（-）-gallocatechingallate，GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（（-）-epicatechingallate，ECG）標(biāo)準(zhǔn)品 成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜、UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；SCIENTZ-30ND冷凍干燥設(shè)備寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1加工方法和取樣方法

川紅工夫加工工藝流程：鮮葉（10 kg）→ 萎凋（16 h）→ 揉捻（2 h）→發(fā)酵（4 h）→干燥（整個(gè)加工過(guò)程的環(huán)境溫度控制在（30±2）℃）

加工過(guò)程中取樣方法：萎凋階段，從鮮葉（萎凋0 h）開(kāi)始，每2 h取樣1 次，至萎凋16 h；揉捻階段，在揉捻1、2 h時(shí)各取樣1 次；發(fā)酵階段，在發(fā)酵2、4 h時(shí)各取樣1 次；干燥階段，分別取發(fā)酵2、4 h樣品烘至水分含量低于5%。取樣編號(hào)和名稱見(jiàn)表1。

表1　樣品編號(hào)和對(duì)應(yīng)名稱Table1 Numbers and names of the samples

加工過(guò)程樣品前處理方法：萎凋、揉捻和發(fā)酵階段樣品各取230 g，采用液氮速凍，其中200 g樣品真空冷凍干燥后，保存于-20 ℃冰箱用于生化成分測(cè)定；另30 g樣品保存于液氮中用于酶活性分析。干燥階段樣品分別取2、4 h發(fā)酵葉1 kg，于90 ℃下烘至水分含量低于5%，保存于-20 ℃冰箱用于檢測(cè)生化成分。

1.3.2茶樣干物質(zhì)（dry matter，DM）含量的測(cè)定

參照GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定》［9］。

1.3.3茶多酚（tea polyphenols，TP）含量的測(cè)定

采用酒石酸亞鐵比色法［10］。

1.3.4兒茶素（catechins）含量的測(cè)定

茶溶液制備［9］后用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液采用高效液相色譜檢測(cè)［11］。色譜條件：色譜柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A 2%冰乙酸，B 純甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2　兒茶素各組分檢測(cè)梯度洗脫程序Table2 Linear gradient elution for separation of catechins components

1.3.5黃酮化合物含量的測(cè)定

采用三氯化鋁比色法［12］。

1.3.6茶黃素（theafl avins，TF）和茶紅素（thearubigins，TR）含量的測(cè)定

茶黃素和茶紅素檢測(cè)分別采用Snell［13］和Roberts［5］等所使用的方法。準(zhǔn)確稱取9.00 g（精確至0.01 g）磨碎茶樣，加沸蒸餾水375 mL，在水浴中提取10 min，取出搖勻，趁熱用濾紙過(guò)濾于干燥的三角瓶中，作為檢測(cè)茶黃素和茶紅素的母液。

茶黃素含量測(cè)定：取10 mL母液于分液漏斗中，加入10 mL 4-甲基-2-戊酮（isobutylmethylketone，IBMK），振蕩10 min，靜置分層。取2 mL上層溶液，加入4 mL無(wú)水乙醇和2 mL二苯基硼酸-2-氨基乙基酯溶液，混勻，反應(yīng)15 min，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，以無(wú)水乙醇與IBMK體積比為1：1的溶液作為空白對(duì)照。按照式（1）計(jì)算茶黃素含量。

式中：A625nm為待測(cè)樣品溶液在625 nm波長(zhǎng)處的吸光度；47.9為茶黃素標(biāo)準(zhǔn)液在625 nm波長(zhǎng)處的轉(zhuǎn)換因子；DM表示茶葉干物質(zhì)百分含量/%。

茶紅素含量測(cè)定：取30 mL母液于分液漏斗中，加入30 mL IBMK，輕輕混勻（避免產(chǎn)生乳化層），靜置，待分層用。取4 mL的IBMK層溶液，用甲醇定容25 mL，為A液，待測(cè)；取2 mL的水層溶液，加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL去離子水，用甲醇定容25 mL，為B液，待測(cè)；取15 mL的IBMK層溶液，加入15 mL 2.5%的碳酸氫鈉溶液，在分液漏斗中迅速?gòu)?qiáng)烈振蕩30 s，立即去掉水層；取4 mL IBMK層溶液，用甲醇定容至25 mL，為C液，待測(cè)。以甲醇作為空白對(duì)照，在380 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。按照式（2）計(jì)算茶紅素含量。

式中：AA、AB、AC分別為A、B和C液在380 nm波長(zhǎng)處的吸光度；0.02、0.733為0.02%的茶紅素在380 nm波長(zhǎng)處的吸光度；375、9表示9 g茶樣采用375 mL蒸餾水浸提；6.25為A、B、C液的稀釋倍數(shù)；DM表示茶葉干物質(zhì)百分含量/%。

1.3.7酶活性的測(cè)定

粗酶液的提制：稱取茶葉（加工過(guò)程樣品）1.25 g，液氮研磨，加聚乙烯吡咯烷酮1.25 g，石英砂1.25 g，研磨充分后加入pH 5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液定容至25 mL，于4 ℃條件下、4 000 r/min離心5 min，取上清液再于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

多酚氧化酶活力測(cè)定［14］：取3 mL反應(yīng)混合液（0.1 mol/L pH 5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、0.1%脯氨酸、1%鄰苯二酚體積比10：2：3）于37 ℃水浴5 min，加0.5 mL上述粗酶液于37 ℃條件下反應(yīng)10 min，加入3 mL 1 mol/L偏磷酸終止反應(yīng)，以不含鄰苯二酚的反應(yīng)液為空白對(duì)照，420 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（A420nm）。以每克樣品每分鐘A420nm增加0.01為1個(gè)酶活力單位（U）。

過(guò)氧化物酶活力測(cè)定［15］：取上述粗酶液1 mL，加入1 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚，2 mL 0.1 mol/L pH 5.6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、1 mL 0.8%過(guò)氧化氫，混合均勻，立即放入紫外分光光度計(jì)中于435 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其5 min內(nèi)吸光度（A435nm）變化。以每克樣品每分鐘A435nm增加0.01為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1川紅工夫加工過(guò)程中主要酚類物質(zhì)的變化

茶葉中的多酚類物質(zhì)是形成紅茶品質(zhì)最重要的物質(zhì)之一，其在鮮葉中的含量以及加工過(guò)程中量與質(zhì)的變化是紅茶制造中品質(zhì)形成的關(guān)鍵。川紅工夫加工過(guò)程中茶多酚含量、兒茶素總量（total catechins，TC）和黃酮含量的變化見(jiàn)圖1。

圖1　川紅工夫紅茶加工過(guò)程中主要酚類物質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes in phenolic compound contents during the manufacturing process of Chuanhong Gongfu tea

如圖1所示，茶多酚在鮮葉萎凋階段變化比較平穩(wěn)，在萎凋10 h時(shí)達(dá)到最高水平；進(jìn)入揉捻階段以后含量急劇下降，可能是由于多酚類物質(zhì)在PPO和POD的作用下發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，生成茶黃素類和茶紅素類等物質(zhì)，并有部分與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性化合物；2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的茶多酚含量分別僅保留鮮葉的48.40%和45.38%。兒茶素作為多酚類物質(zhì)的主體，在鮮葉萎凋階段，隨著鮮葉的失水其含量有一個(gè)先增加后降低的趨勢(shì)，萎凋8 h時(shí)達(dá)到最高；在揉捻、發(fā)酵、干燥階段兒茶素氧化轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步加強(qiáng)，兒茶素發(fā)生氧化縮合作用生成茶黃素類和茶紅素類，導(dǎo)致其含量急劇減少；最后2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的兒茶素轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到86.69%和89.91%。黃酮化合物在制成品中的含量較鮮葉中顯著增加，主要表現(xiàn)為在鮮葉萎凋階段變化不明顯；進(jìn)入揉捻階段以后含量明顯增加；發(fā)酵2 h時(shí)達(dá)到最高，而后逐漸下降；2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的黃酮含量分別為72.21、62.18mg/g，對(duì)比鮮葉分別增加了179.25%和151.02%，制成的川紅工夫干燥茶樣中黃酮化合物含量顯著上升，可能與黃酮苷在紅茶加工過(guò)程中的轉(zhuǎn)化有關(guān)［16-17］。

2.2川紅工夫加工過(guò)程中兒茶素含量的變化

表3　川紅工夫加工過(guò)程中兒茶素組分含量變化Table3 Changes in contents of catechins components during the manufacturing process of Chuanhong Gongfu tea

兒茶素是茶葉中主要的多酚類物質(zhì)，其含量約占茶多酚總量的70%～80%；研究較多的兒茶素主要包括6 種：EGCG、C、EGC、EC、GCG和ECG。川紅工夫加工過(guò)程中兒茶素含量變化見(jiàn)表3。EGCG在萎凋階段，萎凋8 h含量達(dá)到最高，為10.70%，可能是在酶的作用下，促進(jìn)了前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，同時(shí)由于含水量的下降導(dǎo)致EGCG占干質(zhì)量的比例增加，進(jìn)而導(dǎo)致其含量有上升過(guò)程［3］；隨著萎凋的繼續(xù)，茶葉進(jìn)一步失水，兒茶素開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)化，在萎凋16 h含量下降至8.78%；進(jìn)入到揉捻階段，EGCG轉(zhuǎn)化速率迅速，在揉捻2 h時(shí)，其含量?jī)H為1.50%；發(fā)酵和干燥后EGCG的含量進(jìn)一步減少，最終含量下降至0.35%；2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的EGCG含量分別為最初鮮葉中的0.07%和0.04%。EGC、ECG和EC的變化規(guī)律類似EGCG，在萎凋階段出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，EGC含量在萎凋8 h時(shí)達(dá)到最高，ECG和EC含量在萎凋10 h時(shí)達(dá)到最高，且這3 種兒茶素在進(jìn)入揉捻后轉(zhuǎn)化非常迅速，2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的EGC、ECG和EC含量分別為 0.56%、0.23%、0.19%和0.47%、0.11%、0.18%，且分別為最初鮮葉中含量的20.36%、10.70%、19.59%和17.09%、5.12%、18.56%，主要是因?yàn)樵赑PO的催化下，EC和ECG被氧化成鄰醌，EGC和EGCG被氧化成聯(lián)苯鄰醌，鄰醌類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中可氧化其他物質(zhì)而還原，其中部分還原形成雙黃烷醇，另外部分經(jīng)氧化縮合形成茶黃素類物質(zhì)和茶紅素類物質(zhì)［17-18］。C和GCG在整個(gè)加工過(guò)程中變化較小，C略有增加，可能是兒茶素或是茶多酚的轉(zhuǎn)化形成C［19］。非酯型兒茶素的含量從揉捻過(guò)程開(kāi)始呈現(xiàn)較明顯下降，揉捻1 h和2 h分別降低為鮮葉中含量的51.02%和42.86%；之后的發(fā)酵和干燥過(guò)程繼續(xù)下降，發(fā)酵2 h和發(fā)酵4 h干燥樣的非酯型兒茶素含量分別為鮮葉含量的27.04%和24.49%。在整個(gè)川紅工夫加工過(guò)程取樣中，酯型兒茶素含量的變化趨勢(shì)類似非酯型兒茶素，但是從發(fā)酵開(kāi)始其下降程度較非酯型兒茶素更強(qiáng)，發(fā)酵2 h和發(fā)酵4 h的茶樣其酯型兒茶素含量分別降至鮮葉中含量的10.92%和6.72%。

2.3川紅工夫加工過(guò)程中茶黃素和茶紅素含量的變化

圖2　川紅工夫加工過(guò)程中茶黃素（A）和茶紅素（B）含量的變化Fig.2 Changes in contents of theaflavins （A） and thearubigins （B）during the manufacturing process of Chuanhong Gongfu

由圖2A可知，茶黃素含量在萎凋過(guò)程中隨著鮮葉失水量的增加以及萎凋的進(jìn)行呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，萎凋16 h茶黃素含量增加至5.20 μmol/g，是鮮葉中含量的6.67 倍；進(jìn)入揉捻階段后增加趨勢(shì)更明顯，揉捻2 h時(shí)達(dá)到最高水平為15.91 μmol/g，是鮮葉中含量的20.39 倍；但是隨著后期的發(fā)酵和干燥，茶黃素的量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的茶黃素含量分別為12.52、11.33 μmol/g，分別為鮮葉中含量的16.05 倍和14.53 倍，可能是因?yàn)椴椟S素本身的自動(dòng)氧化和偶聯(lián)氧化作用，形成了茶紅素類等物質(zhì)［3，19］。

由圖2B可知，差紅素含量在萎凋2～16 h的變化都比較平緩；在進(jìn)入揉捻過(guò)程中，隨著兒茶素發(fā)生酶促反應(yīng)，茶紅素類物質(zhì)開(kāi)始大量形成，含量急劇增加［3］，揉捻2 h時(shí)茶紅素的含量為12.61%，是鮮葉中含量的2.79 倍；在后期發(fā)酵和干燥過(guò)程中，部分茶黃素和茶黃素形成過(guò)程中的中間產(chǎn)物發(fā)生氧化作用，茶紅素類物質(zhì)的含量仍在穩(wěn)定增加，2 h和4 h發(fā)酵葉制成的川紅工夫干燥茶樣中的茶紅素含量分別為17.43%和18.90%，分別為鮮葉中含量的的3.86 倍和4.19 倍。

2.4川紅工夫加工過(guò)程中多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性的變化

圖3　川紅工夫加工過(guò)程中多酚氧化酶（A）和過(guò)氧化物酶（B）活性變化Fig.3 Changes in PPO （A） and POD （B） activities in the manufacturing process of Chuanhong Gongfu tea

PPO和POD是茶葉中的兩種主要氧化酶，也是茶葉中多酚類物質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶類，它們?cè)诩t茶萎凋和發(fā)酵過(guò)程中起著非常重要的作用［17，20］。由圖3可知，隨著萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮葉中PPO和POD活性均在萎凋12 h出現(xiàn)了一個(gè)高峰。由圖3A可知，鮮葉萎凋過(guò)程前期時(shí)呈下降趨勢(shì)，在萎凋2 h和4 h時(shí)，PPO的活力分別為64.53、74.27 U/g，下降為鮮葉中酶活力的84.32%和97.04%，之后的萎凋過(guò)程中PPO活性逐漸上升，并在萎凋12 h的時(shí)候達(dá)到最高值，此時(shí)PPO活力為142.67 U/g，為鮮葉中酶活力的191.07%，這可能因?yàn)槭俏虬殡S著一系列的物理化學(xué)變化，使pH向酸性方向偏移，有利于保持萎凋葉PPO的較高活性［17，21-23］；至萎凋16 h時(shí)PPO活力為97.20 U/g，為鮮葉中酶活力的127.00%，其原因可能是繼續(xù)萎凋，樣品將失水過(guò)多，從而導(dǎo)致酶蛋白分解，故PPO活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在揉捻階段，酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從揉捻1 h的酶活力95.07 U/g降至揉捻2 h酶活力66.93 U/g，相比鮮葉中的酶活力從124.22%降至87.46%，可能是萎凋葉經(jīng)揉捻，破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，膜透性增加，使細(xì)胞質(zhì)的PPO酶蛋白和液泡中的多酚類物質(zhì)充分接觸并結(jié)合形成不溶性復(fù)合物，同時(shí)機(jī)械摩擦產(chǎn)熱和有機(jī)物質(zhì)的氧化放熱，更加快了這種不溶性復(fù)合物的形成，導(dǎo)致PPO活性下降速度的加快［21，23］。在發(fā)酵階段，由于多酚類物質(zhì)和酶結(jié)合形成不溶性的復(fù)合物，而且酶促氧化產(chǎn)物的劇增對(duì)PPO活性產(chǎn)生了反饋抑制，所以酶的活性持續(xù)下降，PPO活性繼續(xù)降低［22，24］，在發(fā)酵2 h時(shí)PPO酶活力為20.00 U/g，降至鮮葉中酶活力的26.13%，而在發(fā)酵4 h時(shí)，PPO活性又有所上升，相比鮮葉中的酶活力上升至53.66%。

由圖3B可知，鮮葉中POD酶活力為85.80 U/g，在萎凋0～12 h酶活性呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)，12 h時(shí)酶活力達(dá)到最高［23］，為149.73 U/g，增加為鮮葉酶活力的174.51%，12～16 h的萎凋過(guò)程中酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至萎凋16 h，POD酶活力為88.60 U/g，為鮮葉酶活力的103.27%。之后的揉捻和發(fā)酵過(guò)程中POD的酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，揉捻2 h酶活力為62.87 U/g，降至為鮮葉中酶活力的73.27%；發(fā)酵4 h酶活力為12.87 U/g，降至為鮮葉中酶活力的15.00%。

2.5多酚類物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析

表4　多酚類物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析Table4 Correlation analyses of polyphenols contents and the activities of enzymes responsible for their formation

對(duì)多酚類物質(zhì)含量及相關(guān)酶活性進(jìn)行Pearson分析，結(jié)果見(jiàn)表4。除茶黃素含量和PPO活性之間沒(méi)有顯著相關(guān)性外，其他的多酚類物質(zhì)含量與其相關(guān)酶活性之間都存在著顯著或極顯著相關(guān)性。其中茶多酚含量與茶黃素、茶紅素、兒茶素總量、酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量，以及PPO和POD活性之間都存在極顯著相關(guān)性；茶黃素含量與茶紅素、兒茶素總量、酯型兒茶素、非酯型兒茶素含量，以及POD活性之間也都存在極顯著相關(guān)性；茶紅素含量與兒茶素總量、酯型兒茶素、非酯型兒茶素含量和POD活性之間存在極顯著相關(guān)性，與PPO活性之間存在顯著相關(guān)性；PPO活性與兒茶素總量、酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量，以及POD活性之間都存在極顯著相關(guān)性；POD活性與兒茶素總量、酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量之間都存在極顯著相關(guān)性；兒茶素總量與酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量之間都存在極顯著相關(guān)性；酯型兒茶素含量與非酯型兒茶素含量之間存在極顯著相關(guān)性。

以制作高茶黃素紅茶為主要研究目的，對(duì)茶黃素含量與其他的多酚類物質(zhì)含量和相關(guān)酶活性之間的相關(guān)性作進(jìn)一步的了解；且對(duì)茶黃素與兒茶素總量和PPO和POD活性（EPPO、EPOD）做線性回歸分析，結(jié)果如下。

茶黃素含量與兒茶素總量相關(guān)系數(shù)為-0.932，呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，即茶黃素含量越高，兒茶素總量則會(huì)越低；茶黃素含量與POD和PPO活性之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.701和-0.524，說(shuō)明茶黃素的生成與POD和PPO有負(fù)相關(guān)，即茶黃素生成量的增多，伴隨著POD和PPO活性的下降；茶黃素含量與酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.935和-0.917，說(shuō)明茶黃素的生成伴隨著酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量的降低。

3　討 論

川紅工夫中的茶多酚、兒茶素和黃酮總量在萎凋過(guò)程中的變化趨勢(shì)不大，基本趨于平衡；茶多酚和兒茶素總量在揉捻、發(fā)酵和干燥過(guò)程中呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)；黃酮物質(zhì)在揉捻過(guò)程和發(fā)酵2 h時(shí)呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)，之后的干燥過(guò)程呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［22］。兒茶素的6 種主要組成成分中EGC、EGCG、ECG和EC含量的變化趨勢(shì)是萎凋過(guò)程中變化不大趨于平穩(wěn)，進(jìn)入揉捻后，直至后期的干燥一直都是較明顯的下降；而C和GCG的變化都不大，C在整個(gè)加工過(guò)程中有一定的增加趨勢(shì)，GCG則是在萎凋后期有一定的增加，但是在揉捻、發(fā)酵和干燥過(guò)程中又表現(xiàn)為較平緩的增加趨勢(shì)。茶黃素和茶紅素含量隨著萎凋的延長(zhǎng)呈現(xiàn)較平緩的增加；茶黃素含量在揉捻過(guò)程中的增加最為明顯，在揉捻2 h時(shí)達(dá)到最高水平，到后期的發(fā)酵和干燥過(guò)程中茶黃素含量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；茶紅素含量在揉捻、發(fā)酵和干燥過(guò)程中均呈現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)［19，23］。

川紅工夫的品質(zhì)是隨著茶葉發(fā)酵作用的進(jìn)展，慢慢形成的，多酚氧化酶等酶促氧化作用是形成其品質(zhì)的根本。但研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中PPO酶活性并不是一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在萎凋期間PPO活性波動(dòng)較大，主要是由于隨著萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)，葉中失水，pH值酸化等內(nèi)部環(huán)境的影響，PPO同工酶活性及組分變化較大［20］。萎凋期間總的PPO活性最高點(diǎn)出現(xiàn)在12～16 h內(nèi)，而在進(jìn)入揉捻和發(fā)酵后酶活性是呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［23］。

根據(jù)川紅工夫的多酚物質(zhì)含量變化結(jié)果可推斷，適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)揉捻時(shí)間和減少發(fā)酵時(shí)間，可提高茶黃素含量。通過(guò)多酚含量和形成相關(guān)酶酶活性變化規(guī)律可知，發(fā)酵期間茶多酚和黃酮類物質(zhì)的含量較高，但此過(guò)程中的多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶酶活性都處于較低水平，這樣就限制了茶多酚和黃酮類物質(zhì)的繼續(xù)氧化生成茶黃素；通過(guò)多酚形成相關(guān)酶活性與多酚類物質(zhì)相關(guān)性分析可知，PPO和POD活性與茶多酚含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，與茶黃素含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，POD活性與茶紅素含量呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)［17，19，22］；所以可考慮在發(fā)酵過(guò)程中提高酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)制備出更高茶黃素含量且高品質(zhì)的川紅工夫。

［1］ 蔡紅兵. 川紅精制工藝［J］. 茶業(yè)通報(bào)， 1989（3）： 20-22.

［2］ 劉仲華， 施兆鵬. 紅茶制造中多酚氧化酶同工酶譜與活性的變化［J］.茶葉科學(xué)， 1989， 9（2）： 141-150.

［3］ 宛曉春. 茶葉生物化學(xué)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2003.

［4］ 陳東生， 王坤波， 黃建安， 等. 茶樹(shù)多酚氧化酶研究進(jìn)展［J］. 茶葉通訊， 2012， 39（2）： 17-21.

［5］ ROBERTS E A H， SMITH R F. Spectrophotometric measurements of theafl avins and thearubigins in black tea liquors in assessments of quality in teas［J］. Analyst， 1961， 86： 94-98.

［6］ PAN M H， LAI C S， WANG H， et al. Black tea in chemo-prevention of cancer and other human diseases［J］. Food Science and Human Wellness， 2013， 2（1）： 12-21.

［7］ 李彩蓉， 蔡飛， 趙辛元， 等. 茶黃素對(duì)糖尿病大鼠腎小球系膜細(xì)胞p38絲裂原活化蛋白激酶及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響［J］. 茶葉科學(xué)，2009， 29（6）： 470-474.

［8］ 黃建琴. 不同加工方式祁紅與肯尼亞、斯里蘭卡紅茶品質(zhì)成分比較研究［J］. 中國(guó)茶葉加工， 2003（1）： 16-18.

［9］ 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 8303—2013 茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2013.

［10］ LIANG Yuerong， LU Jianliang， ZHANG Lingyun， et al. Estimation of black tea quality by analysis of chemical composition and colour difference of tea infusions［J］. Food Chemistry， 2003， 80（2）： 283-290.

［11］ 馬夢(mèng)君， 胡文卿， 傅麗亞， 等. 溫度和質(zhì)量濃度對(duì)茶多酚水溶液穩(wěn)定性的影響［J］. 食品科學(xué)， 2014， 35（11）： 11-16.

［12］ 何書(shū)美， 劉敬蘭. 茶葉中總黃酮含量測(cè)定方法的研究［J］. 分析化學(xué)，2007， 35（9）： 1365-1368.

［13］ SNELL F D， ETTRE L S， HILTON P J， et al. Encyclopedia of industrial chemical analysis［M］. New York: John Wiley and Sons Inc.， 1973: 455-516.

［14］ 李忠光， 龔明. 植物多酚氧化酶活性測(cè)定方法的改進(jìn)［J］. 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2005， 25（1）： 44-45； 49.

［15］ 王偉玲， 王展， 王晶英. 植物過(guò)氧化物酶活性測(cè)定方法優(yōu)化［J］. 實(shí)驗(yàn)室研究與探索， 2010， 29（4）： 21-23.

［16］ PRICE K R， RHODES M J， BARNES K A. Flavonol glycoside content and composition of tea infusions made from commercially available teas and tea products［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（7）： 2517-2522.

［17］ FINGER A. in vitro studies on the effect of polyphenol oxidase and peroxidase on the formation of polyphenolic black tea constituents［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1994， 66（3）： 293-305.

［18］ OBANDA M， OKINDA OWUOR P， MANG’OKA R. Changes in the chemical and sensory quality parameters of black tea due to variations of fermentation time and temperature［J］. Food Chemistry，2001， 75（4）： 395-404.

［19］ BALENTINE D A， WISEMAN S A， BOUWENS L C. The chemistry of tea fl avonoids［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1997， 37（8）： 693-704.

［20］ SUBRAMANIAN N， VENKATESH P， GANGULI S， et al. Role of polyphenol oxidase and peroxidase in the generation of black tea theaflavins［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999，47（7）： 2571-2578.

［21］ 吳小崇. 萎凋中可溶性多酚氧化酶活性的變化［J］. 茶葉科學(xué)， 1990，10（1）： 44.

［22］ RAVICHANDRAN R， PARTHIBAN R. Changes in enzyme activities（polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase） with type of tea leaf and during black tea manufacture and the effect of enzyme supplementation of dhool on black tea quality［J］. Food Chemistry， 1998， 62（3）： 277-281.

［23］ BARUAH A M， MAHANTA P K. Fermentation characteristics of some assamica clones and process optimization of black tea manufacturing［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003，51（22）： 6578-6588.

［24］ 李遠(yuǎn)志. 茶葉中多酚氧化酶的性質(zhì)及其在茶葉加工中的作用［J］. 食品科學(xué)， 1988， 9（11）： 5-8.

Changes in Polyphenols and Enzymes Responsible for Their Formation during Processing of Chuanhong Gongfu Tea

LUO Liyong1，2， ZENG Liang1，2， LI Hongjun1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Tea Research Institute， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Chuanhong Gongfu tea was made by the traditional process from one bud with two leaves from a small-leaf variety in Sichuan. The contents of tea polyphenols， flavonols， catechins， theaflavins， thearubigins， and the activities of polyphenoloxidase and peroxidase in Chuanhong Gongfu tea were investigated to study the correlation between the contents of tea polyphenols and the activities of the enzymes responsible for their formation. The results showed that the contents of tea polyphenols and catechins displayed a downward trend whereas the contents of fl avonols， theafl avins and thearubigins at the rolling stage increased significantly， and the activities of polyphenoloxidase and peroxidase decreased. However，the contents of fl avonols and theafl avins during the subsequent fermentation process declined. There were signifi cant or extremely signifi cant correlations between the contents of tea polyphenols and the activities of the enzymes responsible for their formation during the manufacturing process of Chuanhong Gongfu tea. High contents of theafl avins in Chuanhong Gongfu tea can be achieved by prolonging the rolling time and reducing the fermentation time， as well as by improving the activities of the enzymes related to polyphenols formation.

Chuanhong Gongfu tea； polyphenols； polyphenoloxidase； peroxidase； correlation analysis

TS272

A

1002-6630（2015）03-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201503011

2014-07-24

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（兔）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-44-D-1）；肉雞特色產(chǎn)品精深加工及現(xiàn)代物流配送關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目（12ZC2439）

羅理勇（1979—），男，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生，研究方向?yàn)椴枞~加工與深加工。E-mail：liyongluo1979@126.com

李洪軍（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩凸δ苁称费芯块_(kāi)發(fā)。E-mail：983362225@qq.com