MicroRNA-21調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥及其作用機(jī)制

陳建萍　王萍　楊庚萍　歐陽少波　黃自坤

（1江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)人民醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337055；2江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)中醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337016；3南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科江西南昌330006；4南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科江西南昌330006）

MicroRNA-21調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥及其作用機(jī)制

陳建萍1王萍2楊庚萍2歐陽少波3黃自坤4

（1江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)人民醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337055；2江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)中醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337016；3南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科江西南昌330006；4南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科江西南昌330006）

目的：探討microRNA-21（miRNA-21）在人口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測(cè)miRNA-21在口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113及順鉑耐藥細(xì)胞株Tca8113/DDP的表達(dá)；采用體外轉(zhuǎn)染法將miRNA-21模擬物（mimics）或抑制物（inhibitor）分別轉(zhuǎn)染Tca8113和Tca8113/DDP細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)情況；采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化；并用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中PTEN的表達(dá)變化。采用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA-21是否作用于PTEN基因的3'-UTR區(qū)預(yù)測(cè)靶位。結(jié)果：miRNA-21在Tca8113/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平是Tca8113細(xì)胞的（8.26±1.37）倍（P＜0.01）。Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后，細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平是轉(zhuǎn)染前的（10.51±2.18）倍（P＜0.01），順鉑對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制率較轉(zhuǎn)染前明顯下降（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前明顯下降（P＜0.05）。Tca8113/DDP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor后，細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平是轉(zhuǎn)染前的（0.32±0.14）倍（P＜0.01），順鉑對(duì)Tca8113/DDP細(xì)胞增殖的抑制率與轉(zhuǎn)染前比較明顯增加（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前明顯增高（P＜0.05）。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證PTEN是miRNA-21的靶基因。結(jié)論：miRNA-21在口腔鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞Tca8113/DDP中異常高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性，miRNA-21可能通過作用于PTEN參與口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥的發(fā)生和發(fā)展。

口腔鱗癌；微小RNA-21；順鉑；耐藥；人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶

口腔鱗癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)［1］。盡管近年來新的抗腫瘤藥物不斷出現(xiàn)，多數(shù)患者仍不能夠獲得有效地控制，這其中一個(gè)重要原因是口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥［2］。因此研究口腔鱗癌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑是目前亟待解決的問題。

MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼的RNA序列，一般由21～23個(gè)核苷酸組成小RNA分子，廣泛存在于各種生物體中，可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)，miRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控等，對(duì)腫瘤的化療耐藥也具有重要作用［3～4］。而在業(yè)已發(fā)現(xiàn)的眾多miRNA中，miRNA-21被認(rèn)為是調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要基因之一，而且還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多重耐藥，下調(diào)miRNA-21可明顯增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［5～7］。但是miRNA-21是否參與了口腔鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥的調(diào)節(jié)及其調(diào)控機(jī)制如何，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以順鉑敏感口腔鱗癌親本細(xì)胞株Tca8113及順鉑耐藥細(xì)胞株Tca8113/DDP為細(xì)胞模型，探討miRNA-21是否參與調(diào)節(jié)口腔鱗癌順鉑耐藥及其可能的分子機(jī)制，為臨床口腔鱗癌化療藥物耐藥的防治提供新的治療策略。

1　材料與方法

1.1主要試劑口腔鱗癌親本細(xì)胞株Tca8113和耐順鉑細(xì)胞株Tca8113/DDP均購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI 1640及胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；順鉑購自美國(guó)Sigma公司；蛋白裂解液RIPA購自碧云天公司；β-actin抗體和兔抗人PTEN單抗購自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購于Sigma公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國(guó)Pierce公司。Lipofectamine2000 Transfection Reagent購自Life Technologies公司；Prime-scriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自南京凱基生物科技公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和pGL載體購于美國(guó)Promega公司。miRNA-21 mimics、miRNA-21 inhibitor及相應(yīng)對(duì)照均由上海GenePharma公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)親本細(xì)胞株Tca8113和耐順鉑細(xì)胞株Tca8113/DDP分別于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向Tca8113/DDP細(xì)胞培養(yǎng)液中將加入終濃度為5 μmol/L的順鉑以維持細(xì)胞耐藥性。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（僅含無義序列）和實(shí)驗(yàn)組（miRNA-21 mimics或miRNA-21 inhibitor）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectmine 2000試劑盒說明書操作，將10 nmol/L miRNA-21 mimics或miRNA-21 inhibitor分別轉(zhuǎn)染至Tca8113和Tca8113/DDP細(xì)胞中。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測(cè)miRNA-

21的表達(dá)用Trizol試劑提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA吸收值，并計(jì)算RNA濃度。按照TaKaRa公司的Prime-scriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：30℃8 min，40℃25 min，-80℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR按照SYBR Green說明書配制反應(yīng)體系（25 μl體系）。以U6作為miRNA-21內(nèi)參。取cDNA進(jìn)行RT-PCR，定量PCR條件如下：95℃預(yù)變性10 s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95℃8 s，65℃10 s，然后70℃延伸10 s，繪制擴(kuò)增曲線，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值（Ct），miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。1.5CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性變化按照CCK8試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染24 h后，取對(duì)數(shù)期Tca8113或Tca8113/DDP細(xì)胞進(jìn)行消化及收集，以5×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種體積為100 μl，并設(shè)僅含培養(yǎng)基的空白對(duì)照。細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的順鉑，每孔加入100 μl。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔CCK8與培養(yǎng)液以1∶10加入，繼續(xù)孵育2 h，在酶標(biāo)儀上采用450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔吸光度（Optical Density，OD）值。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線，并計(jì)算順鉑對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half Inhibition Concentration，IC50）。抑制率計(jì)算公式為：生長(zhǎng)抑制率=（1-OD用藥組/OD對(duì)照組）×100%，以最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，得到IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PTEN的含量收集轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞，PBS洗滌2次，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，加SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min離心，并用BCA法測(cè)定蛋白含量。按每孔20 μl上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜1 h至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔抗人PTEN抗體（1∶2 000）、鼠抗人β-actin抗體（1∶500），4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1 000）和羊抗鼠二抗（1∶4 000），室溫孵育1 h洗膜，加入ECL發(fā)光液顯影，用Image J圖像分析系統(tǒng)掃描圖像的光密度，以各組目的蛋白條帶光密度值與β-actin光密度值計(jì)算相對(duì)比值。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)化學(xué)合成包含有與相應(yīng)miRNA-21互補(bǔ)結(jié)合的靶基因PTEN 3' -UTR序列片段和突變的PTEN 3'-UTR序列片段，將包含預(yù)測(cè)miRNA-21結(jié)合位點(diǎn)的PTEN 3'-UTR和突變的PTEN 3'-UTR（mutant）的片段克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點(diǎn)中。正常培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞，以4×105個(gè)/ml均勻接種于6孔培養(yǎng)板，每孔體積1 ml。共轉(zhuǎn)染包含PTEN 3' -UTR或突變的PTEN 3'-UTR（mutant）的熒光素酶質(zhì)粒，以及miRNA-21 mimics或miRNA-21 mimics control。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照Promega提供的方法進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間分析用單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性經(jīng)不同濃度的順鉑作用48 h后，Tca8113/DDP及Tca8113兩株細(xì)胞的存活率不同；Tca8113/DDP及Tca8113對(duì)DDP的IC50分別為（22.37±3.55）μmol/L、（0.82±0.16）μmol/L（P＜0.01），前者是后者的27.28倍。

2.2耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株miRNA-21的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-21在耐藥細(xì)胞株Tca8113/DDP中的表達(dá)水平顯著升高，與口腔鱗癌親本細(xì)胞株Tca8113相比，表達(dá)升高（8.26±1.37）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或inhibitor后miRNA-21表達(dá)變化Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后，細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平明顯增高，是轉(zhuǎn)染前的（10.51±2.18）倍（P＜0.01）。而Tca8113/DDP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor后，細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平明顯下降，是轉(zhuǎn)染前的（0.32±0.14）倍（P＜0.01）。

2.4轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或inhibitor后口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性變化我們進(jìn)一步檢測(cè)了miRNA-21改變異常是否能夠影響口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性。在Tca8113細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-21mimics和mimicscontrol，在Tca8113/DDP細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor和inhibitor control。CCK8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后Tca8113細(xì)胞存活率隨順鉑濃度的增加明顯升高，順鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率較轉(zhuǎn)染前明顯下降，轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics前順鉑對(duì)Tca8113細(xì)胞的IC50為（0.78±0.11）μmol/L；轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics后順鉑對(duì)Tca8113細(xì)胞的IC50為（1.64±0.18）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1A。Tca8113/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor后，順鉑對(duì)其增殖的抑制率與轉(zhuǎn)染前比較明顯增加，轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor前順鉑對(duì)Tca8113/DDP細(xì)胞的IC50為（26.56±4.67）μmol/L；轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor后順鉑對(duì)Tca8113/DDP細(xì)胞的IC50為（8.17±2.05）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1B。

圖1　Tca8113細(xì)胞和Tca8113/DDP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics和miRNA-21 inhibitor后順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制率變化

2.5口腔鱗癌細(xì)胞中PTEN是miRNA-21調(diào)節(jié)的下游靶基因?yàn)榱舜_定miRNA-21在口腔鱗癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)的下游靶基因，我們利用在線生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN的mRNA的3'-UTR含有能和miRNA-21成熟序列結(jié)合的位點(diǎn)，提示PTEN可能是miRNA-21的靶基因。為了進(jìn)一步證實(shí)miRNA-21對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞PTEN表達(dá)的調(diào)節(jié)，我們檢測(cè)了口腔鱗癌細(xì)胞中miRNA-21和PTEN表達(dá)水平之間的關(guān)系。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在Tca8113細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics增加miRNA-21的表達(dá)水平后，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平明顯下降，與mimics陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在Tca8113/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitor降低miRNA-21的表達(dá)水平后，細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)水平明顯升高，與inhibitor陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。這一結(jié)果表明miRNA-21抑制了口腔鱗癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。

為了進(jìn)一步明確miRNA-21通過與3'-UTR結(jié)合調(diào)節(jié)PTEN表達(dá)，我們構(gòu)建了含有PTEN的3' -UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體WT-PTEN，同時(shí)構(gòu)建了PTEN 3'-UTR區(qū)miRNA-21結(jié)合種子序列突變的載體Mut-PTEN。見圖2B。Tca8113細(xì)胞中，表達(dá)野生型PTEN的3' -UTR序列的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics上調(diào)miRNA-21的水平與轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)照組相比熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01），說明miRNA-21抑制了熒光素酶的表達(dá)。轉(zhuǎn)染突變型PTEN的3'-UTR序列的細(xì)胞中，miRNA-21 mimics上調(diào)miRNA-21的水平與對(duì)照組相比熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05），說明與miRNA-21是通過打靶并結(jié)合PTEN的3'-UTR來調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的。見圖2C。

圖2　PTEN為miRNA-21靶基因

3　討論

miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的小型非編碼RNA，可特異性識(shí)別靶mRNA的3'-UTR并與之結(jié)合，促進(jìn)靶mRNA的降解和（或）翻譯抑制而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用。近年來，大量研究表明miRNA可以調(diào)控腫瘤增殖、凋亡及耐藥相關(guān)靶基因的表達(dá)，在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)節(jié)。如，在乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌的腫瘤組織中，miRNA-21表達(dá)明顯上調(diào)［9］。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在腫瘤的耐藥形成中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和耐順鉑細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)水平明顯高于親本細(xì)胞，且下調(diào)耐藥細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)水平可明顯逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［6］。在食管癌EC9706細(xì)胞中，miRNA-21可降低EC9706/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性［10］。但是miRNA-21是否參與及通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞的耐藥，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在順鉑耐藥口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113/DDP中表達(dá)水平明顯高于其親本細(xì)胞Tca8113；通過上調(diào)Tca8113細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)可促進(jìn)其對(duì)順鉑的耐藥，下調(diào)Tca8113/DDP細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)可逆轉(zhuǎn)其對(duì)順鉑的耐藥。由此可證實(shí)，miRNA-21參與了口腔鱗癌細(xì)胞耐藥的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步明確miRNA-21通過何種機(jī)制調(diào)控Tca8113/DDP細(xì)胞的耐藥，我們應(yīng)用在線生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda對(duì)miRNA-21的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果提示PTEN可能為miRNA-21的靶基因之一。PTEN基因全長(zhǎng)200 kb，包含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，編碼是一個(gè)由403個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，是最早發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，能夠維持正常的物質(zhì)代謝和內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)。PTEN是已經(jīng)公認(rèn)的在人類腫瘤中最容易突變的腫瘤抑制基因之一，細(xì)胞突變后可導(dǎo)致易患腫瘤綜合征，能夠抑制磷脂酰肌醇3-激酶蛋白家族的活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［11］。研究人員在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)PTEN低表達(dá)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，在該腫瘤中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用［12］。口腔鱗狀細(xì)胞癌中亦發(fā)現(xiàn)PTEN低表達(dá)，PTEN蛋白的表達(dá)水平與臨床分期及分化程度有關(guān)，較低PTEN水平伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)升高［13～14］。以上研究結(jié)果提示PTEN低表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

為了證明在口腔鱗癌中miRNA-21和PTEN基因之間的調(diào)控關(guān)系，我們對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞株進(jìn)行miRNA-21 mimics和inhibitor的轉(zhuǎn)染分別促進(jìn)和抑制miRNA-21的表達(dá)，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過上調(diào)或下調(diào)miRNA-21的表達(dá)，相應(yīng)細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平也下調(diào)或上調(diào)。然后我們應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證兩者之間的靶向調(diào)控關(guān)系，證明了miRNA-21可以直接調(diào)控PTEN基因，與Yang等［7］研究結(jié)果一致。在后續(xù)研究中，我們將對(duì)PTEN在口腔鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物功能進(jìn)行深入研究。并將進(jìn)一步研究在口腔鱗癌細(xì)胞中PTEN作為miRNA-21的靶基因是否介導(dǎo)了miRNA-21對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞耐藥的調(diào)節(jié)。

綜上所述，miRNA-21在口腔鱗癌耐順鉑細(xì)胞Tca8113/DDP中異常高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)Tca8113/DDP對(duì)順鉑的耐藥性，這可能為臨床上治療口腔鱗癌耐藥提供新的靶點(diǎn)。miRNA-21可能通過作用于PTEN，參與調(diào)控口腔鱗癌順鉑耐藥的發(fā)生發(fā)展，具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Expressions of MicroRNA-21 in Oral Squamous Cell Carcinoma and Its Correlation with Drug Resistance by Targeting PTEN

CHEN Jian-ping1，WANG Ping2，YANG Gen-ping2，OUYANG Shao-bo3，HUANG Zi-kun4
（1Department of Stomatology，the People's Hospital of Xiangdong District of Pingxiang City，Jiangxi337055；2Department of Stomatology，the TCM Hospital of Xiangdong District of Pingxiang City，Jiangxi337016；3Affiliated Oral Hospital of Nanchang University，Jiangxi330006；4Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Jiangxi330006）

Objective:To investi gate the expression of microRNA-21（miRNA-21）in cisplatin-resistant oral squamous cell carcinoma cells and its mechanism.Methods:Real-time PCR（RT-PCR）was used to detect the expression of miRNA-21 in cisplatin-resistant oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113/DDP and its parent cell line Tca8113.miRNA-21 mimics and miRNA-21 inhibitor in vitro was transiently transferred into Tca8113 and Tca8113/DDP cells respectively.The expression level of miRNA-21 was detected by RT-PCR.Cell viability was analyzed by CCK8 assay.Expression of epithelial membrane protein-1（PTEN）protein was detected by Western blot.Bioinformatics software predicted the potential target genes of miRNA-21 and dual luciferase reporter gene was used to analyze the binding between miRNA-21 and 3'-UTR of PTEN.Results:The expression level of miRNA-21 was up-regulated in Tca8113/DDP cells as compared with Tca8113 cells（P＜0.01）.The relative expression level of miRNA-21 in miRNA-21 mimics-transfected Tca8113 was significantly increased.Over-expression of miRNA-21 inhibited cisplatin chemosensitivity（P＜0.05），and the up-regulation of miRNA-21 led to a significant decrease in the PTEN protein levels（P＜0.05）.The relative expression 1evel of miRNA-21 in miRNA-21 inhibitor-transfected Tca8113/DDP was significantly decreased.Low-expression of miRNA-21 promoted cisplatin chemosensitivity（P＜0.05），and the down-regulation of miRNA-21 led to a significant increase in the PTEN protein levels（P＜0.05）.Dual luciferase reporter gene assay indicated that miRNA-21 regulated PTEN expression by binding to the 3'-UTR of PTEN mRNA.Conclusions:The expression of miRNA-21 was up-regulated in Tca8113/DDP cells.Down-regulation the expression of miRNA-21 could partially reverse the cisplatin-resistance.miRNA-21 may play a vital role in oral squamous cell carcinoma drug resistance by targeting PTEN.

Oral squamous cell carcinoma；MicroRNA-21；Cisplatin；Drug resistance；PTEN

R739.8

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.12.006

2015-08-26）