菌絲球形態(tài)的黑曲霉發(fā)酵液浸出銅尾砂

李廣悅，刁寧寧，王永東，杜康，張振遠

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菌絲球形態(tài)的黑曲霉發(fā)酵液浸出銅尾砂

李廣悅1,2，刁寧寧1,2，王永東1,2，杜康1,2，張振遠1,2

(1南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，湖南衡陽 421001；2南華大學(xué)核資源工程學(xué)院，湖南衡陽 421001）

尾砂中含有大量的金屬，是一種潛在的可利用資源。旨在研發(fā)一種從銅尾砂中回收銅的生物浸出方法。利用正交設(shè)計，通過搖瓶試驗，研究培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間、接種量及培養(yǎng)基成分對黑曲霉菌絲球形態(tài)的影響，進而研究不同菌絲球形態(tài)的黑曲霉發(fā)酵液對尾砂中銅的浸出。研究表明，銅的浸出率隨著黑曲霉菌絲球直徑的減小而升高。在溫度30℃，接種量0.8%（OD600=0.1），馬鈴薯-蔗糖含量30%，發(fā)酵時間65 h的優(yōu)化發(fā)酵條件下，獲得大量表面光滑、直徑為0.96 mm的菌絲球；利用該條件下的發(fā)酵液，在30℃，180 r·min-1條件下浸出3 d，銅的浸出率達83.25%。

黑曲霉；菌絲球；發(fā)酵；浸出；銅尾砂；優(yōu)化

引 言

銅尾砂是一種潛在的二次資源。據(jù)統(tǒng)計，我國的銅尾砂數(shù)量巨大，總量超過2億噸。由于受礦物成分和技術(shù)條件限制，其中有1/4的銅尾砂的品位為0.5%左右[1]。大量銅尾砂的閑置和不合理處理，不僅造成資源浪費，而且還會給生態(tài)環(huán)境帶來嚴重壓力[2]。因此，研發(fā)銅尾砂中銅的高效回收技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。

與原礦相比，銅尾砂的礦物成分復(fù)雜、堿性物質(zhì)含量高、品位低，采用常規(guī)的硫酸浸出和氨法浸出難以經(jīng)濟回收利用[3]。而微生物浸出具有成本低、回收率高、環(huán)境友好等特點，是一種具有應(yīng)用潛力的浸出方法[4]。

目前，微生物浸礦技術(shù)使用的微生物主要為兩類，一類是嗜酸性的氧化亞鐵硫桿菌等化能自養(yǎng)菌[5-7]。但這些微生物需要在很低的pH條件下生長，而且浸出需在硫酸體系中進行，因而不適于含有大量高堿耗酸性成分的銅尾砂的浸出。另一類是真菌。真菌能產(chǎn)生有機酸，并可與礦物中的有價金屬形成可溶的金屬配合物，因而被認為可以作為一種很好的浸出劑[8-9]。與氧化亞鐵硫桿菌等化能自養(yǎng)菌相比，由于真菌可以在高pH條件下生長，所以更適合堿性礦石的浸出。近年來，利用黑曲霉等真菌及其發(fā)酵液從礦石、尾礦中浸出銅已得到眾多學(xué)者的關(guān)注，如Mehta 等[10]利用黑曲霉從印度洋錳結(jié)核中浸出銅、鈷和鎳等金屬，其中銅的浸出達97%；Mulligan 等[11]運用黑曲霉產(chǎn)生的有機酸從某低品位氧化礦浸出銅，浸出率達68%；Anjum等[9]和Nouren等[12]也分別利用靈芝和青霉等真菌從頁巖中浸出銅等金屬。

黑曲霉在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)時，因培養(yǎng)條件不同，會存在懸浮的菌絲、團塊狀和菌絲球3種不同形態(tài)[13]。當黑曲霉以菌絲球的形態(tài)生長時，可改善發(fā)酵液的流變特性，減小發(fā)酵液黏度，并能加快營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，減少能耗，易于發(fā)酵液的分離，尤其是利于產(chǎn)生有機酸[14-16]，這對浸出十分有利。

然而，黑曲霉在發(fā)酵液中的形態(tài)特征對浸出的影響還未得到關(guān)注。為此，本文提出了利用菌絲球形態(tài)的黑曲霉發(fā)酵液浸出銅尾砂，即通過控制培養(yǎng)條件，使黑曲霉在發(fā)酵液中以菌絲球的形態(tài)生長，然后利用其發(fā)酵液浸出尾砂中的銅。

1 材料與方法

1.1 銅尾砂樣品

所用的銅尾砂樣品取自湖南某銅尾礦庫中。對尾砂粒級進行篩分分析，結(jié)果見表1。由尾砂的粒級分布結(jié)果可知，-150mm以下的產(chǎn)率占85%左右，可直接采用該粒級進行浸出試驗。銅尾砂的X射線衍射分析（圖1）結(jié)果表明，銅尾砂的脈石礦物主要有石英、方解石和白云石。經(jīng)物相分析，尾砂中銅的相態(tài)為：自由氧化銅（65.78%）、結(jié)合氧化銅（3.95%）、硅孔雀石（13.16%）、原生硫化銅（1.32%）和次生硫化銅（15.79%），說明此尾砂中的銅礦物主要為氧化銅礦物。由表2化學(xué)分析結(jié)果可知，尾砂中鈣、鎂含量達30%以上，屬高堿性尾砂；銅品位為0.456%，品位較高。

表1 銅尾砂粒徑分布Table 1 Particle size distribution of copper tailings

表2 銅尾砂中的主要化學(xué)成分Table 2 Main chemical components of copper tailings/%

1.2 菌種和培養(yǎng)基

所用黑曲霉菌株由南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室提供。

孢子培養(yǎng)基：采用馬鈴薯-蔗糖（PSA）培養(yǎng)基，組分為馬鈴薯200 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，瓊脂粉15 g·L-1，自然pH，121℃高壓滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：采用PSA液體培養(yǎng)基，馬鈴薯-蔗糖含量分別按設(shè)計含量，為10%（馬鈴薯100 g·L-1，蔗糖10 g·L-1），20%（馬鈴薯200 g·L-1，蔗糖20 g·L-1），30%（馬鈴薯300 g·L-1，蔗糖30 g·L-1），自然pH，121℃高壓滅菌30 min。

1.3 孢子懸液的制備

將保藏的黑曲霉接種到孢子培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d得到成熟孢子，用滅菌的去離子水制備成孢子懸液，根據(jù)前期所開展的黑曲霉浸礦試驗，將其OD600值（600 nm波長處的菌液吸光值）調(diào)至0.1用于接種（約1×107孢子·ml-1)。所有操作均在無菌操作臺內(nèi)進行。

1.4 發(fā)酵正交試驗

為保證黑曲霉在所選取的發(fā)酵條件下均能形成菌絲球，在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取溫度（A）、接種量(B)、馬鈴薯-蔗糖含量(C)和發(fā)酵時間(D)4個因素，各取3個水平，設(shè)計四因素三水平正交試驗，以確定最佳發(fā)酵條件，正交表采用L9(34)[17]，設(shè)計見表3。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factors and levels in orthogonal array design

按正交表設(shè)計的條件，取100 ml滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基于250 ml錐形瓶內(nèi)，接種孢子懸液，置于轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)培養(yǎng)。每組試驗設(shè)置3組平行樣。

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液過濾，用PHS-3C精密pH計測定其pH。隨機選取10個菌絲球，用濾紙吸去菌絲球外表面水分，然后將其置于平板上，排成一條直線，用游標卡尺測量10個菌絲球的長度，取平均值為菌絲球的平均直徑。菌絲球數(shù)量采用直接計數(shù)法。有機酸采用高效液相色譜測定。

1.5 浸出試驗

分別稱取5 g銅尾砂至250 ml的錐形瓶內(nèi)，將其與不同發(fā)酵條件的過濾后的發(fā)酵液在121℃高壓滅菌30 min。然后將滅菌后的發(fā)酵液分別加入含尾砂的錐形瓶內(nèi)，置于30℃、180 r·min-1恒溫培養(yǎng)振蕩器中進行浸出試驗。浸出3 d后，過濾并于105℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，研磨至75mm左右。取0.1 g渣樣，用HCl和HNO3進行消解后，用熒光原子吸收光譜儀（PinAAcle 900F,美國PerkinElmer公司）（波長324.75 nm）測定渣樣中銅含量。試驗過程中所用的化學(xué)試劑均為分析純。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵條件對黑曲霉菌絲球形態(tài)的影響

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，利用正交試驗研究了溫度、接種量、馬鈴薯-蔗糖含量和發(fā)酵時間等發(fā)酵條件對黑曲霉菌絲球形態(tài)影響。選取菌絲球直徑為指標進行極差和方差分析，結(jié)果見表4和表5。

表4 正交試驗極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experiments

①K—Level underof average of sum of test indicators.—Range，=max{K}-min{K}.

② Results were average value of three parallel samples.

表5 正交試驗方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments

Note: If>0.01(2,18), which represents factor has a significant influence, denoted with **.

在設(shè)置的9組正交試驗中黑曲霉均能以菌絲球的形態(tài)生長，說明試驗條件選擇合理。發(fā)酵條件不同，形成的菌絲球形態(tài)也不相同。菌絲球直徑越小，其數(shù)量越多。當培養(yǎng)條件為溫度30℃，接種量0.8%，馬鈴薯-蔗糖含量10%和培養(yǎng)65 h時，形成的菌絲球表面光滑無菌絲，球體致密[圖2(a)]，直徑最小（1.5 mm)、數(shù)量最多。而當培養(yǎng)條件為溫度35℃，接種量0.8%，馬鈴薯-蔗糖含量20%和培養(yǎng)50 h時，形成的菌絲球表面有菌絲，球體松散[圖2(b)]，直徑最大（8.5 mm)，數(shù)量最少。

根據(jù)極差分析結(jié)果（表4），本試驗選取的4個因素的極差（）分別為：發(fā)酵時間（D）為4.20，溫度（A）為2.50，接種量（B）為1.43，馬鈴薯-蔗糖含量（C）為0.73。由此，確定4個因素對黑曲霉菌絲球直徑影響的主次順序依次為：發(fā)酵時間、溫度、接種量和馬鈴薯-蔗糖含量。發(fā)酵條件的最佳水平組合為D2A2B3C3, 即發(fā)酵時間65 h，溫度30℃，接種量0.8%，馬鈴薯-蔗糖含量30%。

由表5正交試驗方差分析也表明，4個因素對菌絲球直徑的影響程度為：發(fā)酵時間影響最為顯著，其次為溫度，再次為接種量，最后為馬鈴薯-蔗糖含量，這與極差分析結(jié)果相一致。同時4個因素對試驗結(jié)果均有顯著影響[>0.01(2,18)=6.01]。由方差分析中的離差平方和（sum of square of deviation）可知，4個因素的離差平方和均大于誤差離差平方和，這說明試驗結(jié)果的不同并非來源于試驗誤差而是來自于試驗因素水平的改變。

發(fā)酵時間對菌絲球直徑影響最大。這是因為菌絲球在發(fā)酵期間要經(jīng)歷成球、生長和自溶等階段，由于發(fā)酵液的營養(yǎng)成分和溶解氧隨著發(fā)酵時間而變化，因而菌絲球的生長也會隨著變化，同時也會影響黑曲霉代謝產(chǎn)物的種類及含量。其次是溫度，一方面溫度會影響微生物活性，適宜的溫度可促進黑曲霉生長和代謝；另一方面溫度還影響氧的溶解和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，進而影響菌絲球的形成及其形態(tài)特征。Zhou等[18]研究表明，當溫度<30℃時，菌絲球直徑較小，而溫度>30℃時菌絲球直徑較大。接種量決定了黑曲霉孢子凝集形成晶核的數(shù)量以及單體細胞營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)量。接種量小時，黑曲霉孢子凝聚形成晶核數(shù)量少，營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣供應(yīng)充足，利于黑曲霉孢子的生長，形成的菌絲球個數(shù)較少，粒徑較大；接種量大時，晶核數(shù)量大，真菌生長緩慢，形成的菌絲球數(shù)量多，直徑小[19]。營養(yǎng)物質(zhì)是微生物生長所必需的，黑曲霉的生長需要水分、分子氧、有機碳源、能量等。本試驗使用的PSA培養(yǎng)中，馬鈴薯和蔗糖是提供黑曲霉生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，因而其含量會影響菌絲球的生長和代謝。

2.2 菌絲球直徑與銅浸出率的關(guān)系

不同直徑的菌絲球發(fā)酵液對銅尾砂的浸出影響見圖3。從菌絲球直徑與銅的浸出率關(guān)系曲線可以看出，銅的浸出率隨著發(fā)酵液中菌絲球直徑的增加而降低。當菌絲球直徑為1.5 mm時，銅的浸出率最高（79.90%）；而當菌絲球直徑為8.5 mm時，銅的浸出率最低（55.65%）。這是由于菌絲球的形態(tài)特征直接影響發(fā)酵液的流變學(xué)特性和發(fā)酵過程的傳質(zhì)效率，進而影響底物的利用和有機酸的生成[20]。菌絲球直徑越小，營養(yǎng)物質(zhì)和氧等在菌絲球表面和發(fā)酵液間的傳質(zhì)也越容易，營養(yǎng)物質(zhì)利用效率越高，越利于有機酸的產(chǎn)生[13,18]。

圖3中菌絲球直徑與發(fā)酵液pH關(guān)系曲線也證實了菌絲球直徑對黑曲霉產(chǎn)酸能力的影響。隨著菌絲球直徑的增大，發(fā)酵液pH也逐漸升高。當菌絲球直徑從1.5 mm增大到4.2 mm時，發(fā)酵液的pH緩慢升高；而當菌絲球直徑從4.2 mm增大到6.5 mm時，發(fā)酵液pH迅速升高；當菌絲球直徑增大到8.5 mm時，發(fā)酵液pH達到最大（3.26）。

黑曲霉在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種有機酸。有機酸的產(chǎn)生降低了發(fā)酵液的pH，進而影響銅的浸出[20]。由6號試驗的發(fā)酵液中有機酸檢測結(jié)果表明（表6），發(fā)酵液中含有檸檬酸、草酸、-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸和琥珀酸等多種有機酸。研究表明，有機酸對氧化銅礦物和硫化銅礦物均有較好的浸出能力。Shabani等[21]開展了檸檬酸浸出孔雀石（氧化銅礦物）研究，在最優(yōu)條件下，銅的浸出率達91.6%。Rao等[22]用不同有機酸浸出黃銅礦（硫化銅礦物），結(jié)果表明，檸檬酸、蘋果酸、草酸的浸出率分別為83.3%、80.4%和39.7%。

表6 黑曲霉發(fā)酵液中有機酸的種類和含量Table 6 Type and content of organic acids in fermentation broths of A. niger/g·L-1

黑曲霉發(fā)酵液是多種有機酸共存的體系，但不同種類的有機酸與銅離子的絡(luò)合能力不同。菌絲球形態(tài)的改變會引起黑曲霉發(fā)酵液中有機酸種類及其含量的變化，因而影響銅的浸出[23]。這從圖3可以看出，菌絲球直徑在1.5～4.2 mm和4.2～6.5 mm的兩個區(qū)間，發(fā)酵液pH的上升幅度有明顯改變。而銅的浸出率的下降幅度卻基本保持一致。這說明隨著菌絲球直徑的增大，可能導(dǎo)致了與銅離子有較強絡(luò)合能力的有機酸含量的減少。因而，在菌絲球直徑為1.5～4.2 mm的區(qū)間，盡管發(fā)酵液的pH以較小的幅度上升，但銅的浸出率仍以較快的幅度下降。

不同直徑的菌絲球發(fā)酵液對銅尾砂的浸出影響結(jié)果表明，菌絲球的形態(tài)會影響黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸性能，進而影響銅的浸出，因而通過調(diào)控黑曲霉發(fā)酵液中菌絲球的形態(tài)，可提高銅尾砂中銅的浸出率。

2.3 浸出前后銅尾砂的紅外光譜分析

浸出前后的銅尾砂樣品紅外光譜分析結(jié)果如圖4所示。浸出前后相比較，紅外光譜的吸收峰變化主要集中在3700、2519、1450、1100～1000、877和470 cm-16個峰帶。其中原尾砂在3700 cm-1處出現(xiàn)羥基吸收峰，可能是樣品中含有游離水。2519 cm-1處吸收峰屬OH伸縮振動，浸出后峰強度增大；1450 cm-1處吸收峰是由OH向面內(nèi)彎曲所致，浸出后峰形變鈍、強度減弱，這都說明羧酸增多，可能是浸出后形成了草酸鈣等沉淀。1100～1000 cm-1范圍內(nèi)的1089、1033和1008 cm-13個相關(guān)鈍峰帶以及470 cm-1處吸收峰同屬于Si—O的伸縮振動，浸出后峰形變鈍，峰強減弱，表明Si—O結(jié)構(gòu)受到了一定的破壞，這可能由發(fā)酵液中有機酸對銅尾砂的侵蝕破壞所致。

2.4 最優(yōu)條件的驗證試驗

根據(jù)菌絲球直徑與銅的浸出率關(guān)系可知，菌絲球直徑越小，銅的浸出率越高。選取菌絲球直徑為指標確定的發(fā)酵條件的最佳組合為D2A2B3C3，即發(fā)酵時間65 h，溫度30℃，接種量0.8 %，馬鈴薯-蔗糖含量30%。以正交試驗所得的優(yōu)化條件進行驗證試驗，發(fā)酵液中形成的菌絲球直徑為0.96 mm[圖5(b)]，發(fā)酵液的pH為2.20。用該發(fā)酵液在30℃，180 r·min-1條件下浸出3 d，銅的浸出率達到83.25%。而正交試驗中6號試驗銅的浸出率最高為79.90 %，菌絲球直徑1.5 mm[圖5(a)]，發(fā)酵液的pH為2.28。優(yōu)化條件試驗中，菌絲球直徑更小，而銅浸出率比正交試驗中的最大浸出率高出3.35%。

3 結(jié) 論

（1）發(fā)酵液中黑曲霉的菌絲球形態(tài)與銅的浸出率密切相關(guān)。菌絲球直徑越小、數(shù)量越多的發(fā)酵液，銅的浸出率越高。

（2）形成直徑較小、數(shù)量較多的菌絲球時的最佳條件為：溫度30℃，接種量0.8%，馬鈴薯-蔗糖含量30%，發(fā)酵時間65 h。在此條件下，尾砂中銅的浸出率可達到83.25%。

（3）研究表明，通過控制黑曲霉發(fā)酵液中菌絲球的形態(tài)，可提高銅尾砂中銅的浸出率。

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Bioleaching of copper from tailings by fermentation broths ofin pellet form

LI Guangyue1,2, DIAO Ningning1,2, WANG Yongdong1,2, DU Kang1,2, ZHANG Zhenyuan1,2

(1Key Discipline Laboratory for National Defense of Biotechnology in Uranium Mining and Hydrometallurgy, University of South China,Hengyang 421001, Hunan, China；2School of Nuclear Resources Engineering, University of South China,Hengyang421001, Hunan, China)

Owing to the substantial amounts of metals embodied in tailings, they are potential viable sources of metals.This work aims at developing a technique to microbially recover copper present in tailings.Based on orthogonal design, the effects of different variables, such as temperature, fermentation time, inoculum size and medium components, on pellet morphology ofwere investigated in shake flasks. Leaching of copper from its tailings was conducted using fermentation broths ofwith different pellet morphology. Copper extraction gradually increased with reduction in pellet diameter of. A large amount of compactsmooth pellets with a diameter of 0.96 mm were obtained under the optimum fermentation conditions of 30℃, 0.8% inoculum size(OD600=0.1), 30% potato-sucrose contents, 65 h fermentation time. After 3 days of leaching,copper extraction reached 83.25% with the fermentation broths aforementioned at 30℃, 180 r·min-1.

; mycelium pellets; fermentation; leaching; copper mill tailings; optimization

2014-07-14.

Prof. LI Guangyue, lgy673@163.com

10. 11949/j.issn.0438-1157.20141047

TF 18

A

0438—1157（2015）02—0717—06

湖南省教育廳資助重點科研項目(13A083)。

2014-07-14收到初稿，2014-11-04收到修改稿。

聯(lián)系人及第一作者：李廣悅(1970—)，男，博士，教授。

supported by the Key Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department(13A083).