茯苓多糖的結(jié)構(gòu)改性及抗氧化活性研究

陳小紅等

摘要：研究中藥茯苓（Poria cocos）多糖的羧甲基化和阿魏酸結(jié)構(gòu)改性，并對其進(jìn)行了體內(nèi)、體外的抗氧化性能測定。紅外吸收光譜圖結(jié)果顯示兩者改性獲得成功。在一定的濃度范圍內(nèi)，兩者均具有一定的還原能力和抗氧化能力，且其還原能力、清除能力均表現(xiàn)出與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，達(dá)到一定濃度后趨于穩(wěn)定。FP（阿魏酸茯苓多糖）的抗氧化性能要強(qiáng)于CMP（羧甲基茯苓多糖），但均弱于抗壞血酸，CMP、FP對·O2-清除作用均弱于對·OH的清除作用。

關(guān)鍵詞：茯苓（Poria cocos）；多糖；結(jié)構(gòu)改性；抗氧化

中圖分類號：S567.3+2；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4563-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.043

茯苓（Poria cocos）是中國傳統(tǒng)的名貴藥材，其具有安神、健脾、和胃、利尿、滲濕等功能[1]。茯苓多糖是茯苓的主要活性成分，主要結(jié)構(gòu)為β-（1→3）-D-葡聚糖[2]。經(jīng)研究，茯苓多糖本身生物活性較低，且不溶于水，難以進(jìn)行有效的利用，必須對其進(jìn)行化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)改性以提高活性[3]。目前國內(nèi)外報道研究較多的是茯苓多糖羧甲基化的結(jié)構(gòu)改性，而對其他的結(jié)構(gòu)改性特別是改性后的各種生物性能（如抗氧化等）研究較少[4]。因此，為了全面系統(tǒng)研究茯苓多糖各種結(jié)構(gòu)改性的抗氧化性能，試驗通過茯苓多糖的羧甲基化和阿魏酸結(jié)構(gòu)改性，并進(jìn)行兩者體內(nèi)、體外的抗氧化性能比較，揭示兩者之間抗氧化性能的差異性，以期為茯苓多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用，特別是在化妝品、保健品及中醫(yī)藥領(lǐng)域的產(chǎn)品研制與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

市場購買茯苓，粉碎，過 200目篩，經(jīng)稀堿提取、高碘酸鈉氧化、酸水解、干燥獲得茯苓多糖[5]；昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重（19±2） g，由龍巖市第二醫(yī)藥檢驗科提供，試驗前各小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d。

檢測試劑盒：SOD（超氧化物歧化酶）和MDA（脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

主要儀器：YF-103型便捷式高速中藥粉碎機(jī)、島津IR-400型紅外光譜儀、UV-2 000型紫外可見分光光度計、86-2型磁力加熱攪拌器。

1.2 方法

1.2.1 茯苓多糖的結(jié)構(gòu)改性 羧甲基茯苓多糖：采用二次堿化法，將茯苓多糖用 95%乙醇洗滌、攪拌 20～30 min，加入一定量的固體氫氧化鈉劇烈攪拌 30～45 min 為第一次堿化；然后在 50 ℃ 水浴中加入一定量的一氯乙酸反應(yīng) 2.5 h， 再加入少量的氫氧化鈉和去離子水繼續(xù)反應(yīng)為第二次堿化；最后再用乙酸中和至pH 5.0～6.0，依次再用80%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌3～4次，透析，冷凍干燥，得羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl pachymaran，CMP）。阿魏酸茯苓多糖：采用直接酯化法，將茯苓多糖用二甲基亞砜溶解，80 ℃劇烈攪拌 20～30 min 后加入與多糖等同質(zhì)量的阿魏酸試劑和一定量的甲苯溶液進(jìn)行反應(yīng)，時間 4 h，溫度90～95 ℃；反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻，再用氫氧化鈉中和至pH 7.0～8.0，抽濾，依次再用乙醇∶醋酸=70∶30溶液、80%乙醇、無水乙醇洗滌3～4次，透析，冷凍干燥，得阿魏酸茯苓多糖（Pachymaran ferulate，F(xiàn)P）。以原茯苓多糖為對照，在相同條件下測定CMP、FP的紅外吸收光譜圖[6]，分析其結(jié)構(gòu)變化，確定原茯苓多糖羧甲基化、阿魏酸化是否改性成功。

1.2.2 CMP、FP還原能力的測定 還原能力的高低在一定程度上反映了藥物抗氧化性能，還原能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)[7]。分別將CMP、FP配置成0.1～5 g/L的多糖溶液，各取1 mL按照Oyaizu[8]的方法測定其還原能力，試驗同時以抗壞血酸為對照，比較三者之間還原能力。試驗均重復(fù)3次取均值。

1.2.3 CMP、FP總抗氧化活性的測定 采用三價鐵還原/抗氧化能力分析（FRAP）法。分別將 CMP、FP 配置成5 g/L的多糖溶液，37 ℃水浴反應(yīng)10 min，測定OD593 nm，以 1.0 mmol/L FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品總抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的 FeSO4·7H2O的毫摩爾數(shù)表示，試驗同時以抗壞血酸（VC）為對照，比較三者之間的總抗氧化活性。

1.2.4 CMP、FP羥自由基清除率的測定 按照 Fenton反應(yīng)原理，具有抗氧化作用的物質(zhì)能與水楊酸競爭反應(yīng)。分別將CMP、FP配置成0.5～5 g/L的多糖溶液，在反應(yīng)體系中依次加入硫酸亞鐵、水楊酸、1 mL 各樣品溶液、H2O2，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，測OD510，以不同濃度的樣品溶液對·OH的清除率作圖。試驗同時以抗壞血酸為對照，比較三者之間·OH 的清除能力。清除率=[A無樣品溶液-（A樣品溶液-A樣品本底顏色）]/A無樣品溶液×100%。

1.2.5 CMP、FP超氧自由基（·O2-）清除率的測定 按照鄰苯三酚自氧化反應(yīng)原理，具有抗氧化作用的物質(zhì)能對·O2- 產(chǎn)生抑制作用。分別將CMP、FP配置成1～5 g/L的多糖溶液，在 Tris-鹽酸 pH 8.2 反應(yīng)體系中依次加入0.5 mL各樣品溶液、鄰苯三酚，在37 ℃水浴中反應(yīng)5 min，濃鹽酸終止反應(yīng)，測OD320，以不同濃度的樣品溶液對·OH的清除率作圖。試驗同時以抗壞血酸為對照，比較三者之間·O2-的清除能力。清除率=[A無樣品溶液-（A樣品溶液-A樣品本底顏色）]/A無樣品溶液×100%。

1.2.6 CMP、FP動物體內(nèi)抗氧化活性測定 將240只適應(yīng)性喂養(yǎng)后的小鼠隨機(jī)分8組，3次重復(fù)，每組10只，陰性對照組（生理鹽水）、CMP的低中高劑量組（100、200、400 mg/kg）、FP低中高劑量組（100、200、400 mg/kg）、陽性對照組（VC，200 mg/kg），每組均以5 mL/（kg/d）的劑量每天定時灌胃一次，連續(xù)30 d，試驗結(jié)束后，小鼠空腹過夜，摘眼球取血，常規(guī)方法離心獲得血清，備用。小鼠頸椎脫臼處死后，取肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗滌后，稱重，剪碎，加生理鹽水組織勻漿，離心，取上清液，備用。所得的小鼠血清、肝組織勻漿的SOD和MDA均按照試劑盒說明書方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP、FP的紅外吸收光譜

CMP、FP和原茯苓多糖的紅外吸收光譜見圖1。由圖1可知，3種多糖均有糖類的特征吸收峰2 900 cm-1，且其他結(jié)構(gòu)特征吸收峰基本相似，僅CMP 在1 500 cm-1左右存在羧甲基的特征吸收峰，僅FP在1 726 cm-1處存在酯的特征吸收峰，說明CMP、FP的羧甲基化、阿魏酸的結(jié)構(gòu)改性成功。

2.2 CMP、FP的還原能力比較

CMP、FP和VC的還原能力比較見圖2。由圖2可知，CMP、FP具有一定的還原能力，隨著濃度的增加，其抗氧化性能均逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到3.0 g/L左右趨于穩(wěn)定。FP的還原能力強(qiáng)于CMP，但均小于VC。

2.3 CMP、FP的總抗氧化活性比較

CMP、FP和VC的總抗氧化活性比較見圖3。由圖3可知，CMP、FP具有一定的抗氧化性能，F(xiàn)P的抗氧化性能明顯強(qiáng)于CMP，但均低于VC。

2.4 CMP、FP對·OH清除作用比較

CMP、FP和VC對·OH的清除作用比較見圖4。由圖4可知，CMP和FP對·OH具有一定地清除作用，隨著濃度的增加，清除作用依次增強(qiáng)，表明CMP、FP對·OH的清除能力與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，但到達(dá)一定濃度后趨于穩(wěn)定，其最大清除能力分別達(dá)到52.3%、65.6%，F(xiàn)P的清除能力明顯強(qiáng)于CMP。但CMP、FP對·OH的清除能力要弱于VC，CMP、FP和VC的EC50分別為3.7、2.6、0.25 g/L。

2.5 CMP、FP對·O2-清除作用比較

CMP、FP和VC對·O2-的清除作用比較見圖5。由圖5可知，CMP和FP對·O2-具有一定得清除作用，隨著濃度地增加，清除作用依次增強(qiáng)，表明 CMP、FP對·O2-的清除能力與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，但到達(dá)一定濃度后也趨于穩(wěn)定，其最大清除能力分別為17.2%、32.3%，F(xiàn)P的清除能力要明顯強(qiáng)于CMP。VC的EC50為0.16 g/L，CMP、FP對·O2-的清除能力要弱于VC，且均低于50%，表明CMP、FP對·O2-清除作用要弱于對·OH清除作用。

2.6 CMP、FP動物體內(nèi)抗氧化作用比較

SOD能減少體內(nèi)過多的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的傷害，SOD活力越高，越有利于清除體內(nèi)的氧自由基。MDA是氧自由基損傷組織的代謝產(chǎn)物，濃度越高表明機(jī)體受自由基攻擊程度越嚴(yán)重。CMP、FP和VC動物體內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響比較見表1和表2。與陰性對照相比，CMP、FP均能提高小鼠SOD的活性，且在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增高，SOD活性增加，表現(xiàn)出良好的正相關(guān)性，同劑量灌胃CMP組、FP組，CMP組在血清和肝臟中的SOD活力均小于FP組，但兩組均小于VC陽性對照組。與陰性對照相比，CMP、FP均能降低小鼠MDA的含量，且在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增高，MDA含量降低，表現(xiàn)出良好的負(fù)相關(guān)性，同劑量灌胃CMP組、FP組，CMP組在血清和肝臟中的MDA含量均高于FP組，但兩組MDA含量均高于VC陽性對照組。試驗結(jié)果表明，CMP、FP體內(nèi)抗氧化效果要弱于VC，但與陰性對照相比，還是表現(xiàn)出了一定的體內(nèi)抗氧化活性，且其抗氧化活性與其濃度高低呈正相關(guān)。與陰性對照相比，CMP、FP中劑量組（200 mg/mL）的血清、肝臟中的SOD活力、MDA含量均達(dá)到了顯著差異（P<0.05），CMP、FP高劑量組（400 mg/mL）的血清、肝臟中的SOD活力、MDA含量均達(dá)到了極顯著差異（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

為了提高茯苓多糖的生物活性，本試驗將茯苓多糖進(jìn)行了羧甲基化和阿魏酸的結(jié)構(gòu)改性，紅外吸收的光譜圖試驗結(jié)果表明，兩者的改性獲得成功。經(jīng)改性后，測定了羧甲基茯苓多糖CMP和阿魏酸茯苓多糖FP的體外和體內(nèi)抗氧化性能，在一定的有效濃度范圍內(nèi)，兩者均具有一定的還原能力和抗氧化能力，且其還原能力、清除能力均表現(xiàn)出與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，且達(dá)到一定濃度后趨于穩(wěn)定。FP的抗氧化性能要稍強(qiáng)于CMP，但均弱于VC，且CMP、FP對·O2-清除作用均要弱于對·OH清除作用。體內(nèi)抗氧化試驗表明，CMP、FP均能在一定程度上提高小鼠血清和肝臟中SOD的活性和降低MDA含量，這對保護(hù)動物機(jī)體細(xì)胞受免疫損傷、組織受脂質(zhì)過氧化損傷均有一定得益處，CMP、FP起到了一定的抗氧化作用。

多糖是自然界中發(fā)現(xiàn)的又一種具有抗氧化活性的成分，其機(jī)理可能是多糖分子上的半縮醛羥基具有一定的還原性能，可以與活性氧自由基發(fā)生相互作用[9]。多糖的抗氧化性能與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，但達(dá)一定濃度后趨于穩(wěn)定，原因可能是多糖溶液濃度飽和后，各多糖分子之間產(chǎn)生互相排斥，與活性氧自由基作用能力下降，使其還原能力、對·OH、·O2-的清除能力下降[10]。阿魏酸能淬滅活性氧自由基，本身具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因此阿魏酸茯苓多糖的結(jié)構(gòu)修飾的抗氧化性能要強(qiáng)于羧甲基茯苓多糖[11，12]。

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