檳榔仁對KM小鼠的急性毒性研究

劉書偉等

摘要：為研究口服檳榔（Areca catechu Linnaeus）仁汁液的毒性，進行了小鼠的經(jīng)口急性毒性試驗。根據(jù)預(yù)試驗確定正式試驗給藥劑量的范圍，選用KM小鼠經(jīng)口灌胃，一次給藥，給藥后連續(xù)觀察7 d，記錄小白鼠的中毒反應(yīng)及死亡情況，采用寇氏法計算 LD50及LD50的95%可信限。結(jié)果表明，高劑量給藥組小白鼠出現(xiàn)中毒反應(yīng)并死亡，解剖后檢查發(fā)現(xiàn)主要原因是胃腸和肺部的病變，測得檳榔仁汁液的LD50及LD50的 95%可信限分別為12.425 g/（kg.bw）、10.610～14.551 g/（kg.bw），表明檳榔仁汁液可以被認(rèn)為是實際無毒物質(zhì)。檳榔仁原液干物質(zhì)的LD50及LD50的95%可信限分別為1.349 g/（kg.bw）、1.152～1.580 g/（kg.bw），屬于低毒物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：檳榔（Areca catechu Linnaeus）仁；小鼠；急性毒性；半數(shù)致死量

中圖分類號：R992 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4532-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.035

檳榔（Areca catechu Linnaeus）又稱賓門、仁頻、洗瘴丹、國馬、大腹子、橄欖子、榔玉、青仔、海南子等，為棕櫚科檳榔屬的多年生常綠喬木植物。檳榔位居中國四大南藥（檳榔、砂仁、益智、巴戟）之首，它味苦、性辛、溫，歸胃、大腸經(jīng)，具有殺蟲消積、降氣、行水、截瘧的功效，入藥歷史悠久，療效確切，是中醫(yī)常用的驅(qū)蟲、消積藥物。檳榔全身都是寶，其未成熟的果實（檳榔）、雄花蕾（檳榔花）、果皮（大腹皮）、種子（檳榔仁）均可入藥[1，2]。檳榔咀嚼的習(xí)俗由來已久[3]，但長期大量嚼食檳榔，除可能罹患口腔疾病、口腔癌外，食用過量會產(chǎn)生中毒癥狀，如興奮、眼神呆滯、全身發(fā)抖、走路不穩(wěn)、行為怪異或粗暴、心律不齊和心肌梗死等。2003年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心認(rèn)定檳榔為一級致癌物[1，4，5]。目前，在中國檳榔作為嗜好食品的咀嚼方式有兩種，一種是以海南和臺灣為代表的檳榔鮮果咀嚼方式，該方式咀嚼的為全檳榔，包含檳榔仁和大腹皮。另一種是以湖南為代表的不含檳榔仁的檳榔干果咀嚼方式，以湖南湘潭為代表的檳榔加工地區(qū)把檳榔曬干或烘干后制成檳榔干果，為了防腐，剔除了檳榔仁和采用煙熏工藝的干果加工工藝。但是，嗜好檳榔的海南人和臺灣人認(rèn)為干果檳榔失去了新鮮檳榔的特有口感，所以，盡管湖南加工的檳榔干果比較方便和衛(wèi)生，但是海南和臺灣本土人還是更多地選擇咀嚼含有檳榔仁的檳榔鮮果。隨著檳榔的食用安全性越來越受到全社會的關(guān)注，國內(nèi)外眾多學(xué)者對檳榔毒理進行了大量的研究[6-9]。但是針對檳榔仁的毒性狀況尚未見報道，為了評價檳榔仁的安全性及更系統(tǒng)地研究其藥理作用，特進行了檳榔仁原液對小白鼠經(jīng)口急性毒性試驗，測定其半數(shù)致死量（LD50），從而確定該物質(zhì)的急性毒性強弱。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 試驗動物采用SPF級KM小白鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，小鼠生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘） 2013-0004。全部動物引入后，置于海南三亞市功能檳榔研究重點實驗室動物房養(yǎng)殖，飼養(yǎng)室的室溫為（22±3） ℃，相對濕度為60%～70%，12 h光照。以SPF級小鼠專用維持飼料雌雄分籠喂養(yǎng)，自由飲水采食，適應(yīng)7 d，在小鼠適應(yīng)的過程中，觀察小鼠的綜合狀況，選取表現(xiàn)正常和大小均勻一致的小鼠待用，體重（20±1） g，雌雄各半，雌性小鼠未產(chǎn)未孕。

1.1.2 檳榔果實標(biāo)準(zhǔn)及檳榔仁原液制備 試驗所使用的檳榔采摘于海南省三亞市吉陽區(qū)農(nóng)民的檳榔種植園。采收標(biāo)準(zhǔn)為：外形為長橢圓形或橢圓形，果實勻稱，莖部帶宿萼，剖開果皮內(nèi)有未成熟瘦長形種子，光澤較好、顏色純正的適于嚼食的檳榔青果，橫向直徑3～4 cm，縱向直徑5～6 cm。采摘后用保鮮膜包裹，及時運到實驗室，放冰箱冷藏待用。

取待用新鮮優(yōu)質(zhì)檳榔，剖開果皮取檳榔仁，壓榨取汁液，放入經(jīng)消毒后的離心管，以5 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm除菌過濾膜過濾，濾液即為供試檳榔仁原液，無團聚現(xiàn)象，純度100%，現(xiàn)用現(xiàn)榨。

1.2 試驗方法

1.2.1 經(jīng)口急性毒性試驗預(yù)試驗 按照GB15193.2-2014《食品毒理學(xué)實驗室操作規(guī)范》進行試驗，選取健康小白鼠60只，雌雄各半，隨機分為6個組，每組10只，禁食6 h后按體重比例灌胃給藥，給藥后禁食1 h。給藥方法：將檳榔仁原液用蒸餾水稀釋后，按等差數(shù)列從小到大配成不同濃度的稀釋液，分6個劑量組，每組每個劑量按照劑量大小分為一次性灌胃給藥和二次給藥，單次灌胃劑量標(biāo)準(zhǔn)為25 g/（kg·bw），控制每次最高給藥0.5 g，超過0.5 g的部分采用間隔2 h后二次給藥。給藥后觀察7 d，觀察小鼠中毒癥狀并記錄死亡數(shù)。經(jīng)反復(fù)預(yù)試驗，最后得出預(yù)試驗中最理想的給藥量，由于采用灌胃量標(biāo)準(zhǔn)為檳榔仁稀釋液25 g/（kg·bw），6個組折算成檳榔仁原液的給藥量分別為1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 g/（kg·bw）。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定能使小鼠全部死亡的最小劑量（LD100）為24.0 g/（kg·bw），能使小鼠全部存活的最大劑量（LD0）為6.0 g/（kg·bw）。

1.2.2 正式試驗 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果設(shè)計正式試驗。將60只小鼠隨機分成6組（5個試驗組+1個對照組），每組各10只，雌、雄各半并編號。試驗前禁食6 h，自由飲水，試驗組根據(jù)預(yù)試驗計算給藥量（表1），對照組按25 g/（kg·bw）灌胃蒸餾水。對6組小鼠一次性灌胃，給藥后單籠飼養(yǎng)，繼續(xù)禁食1 h。給藥后的前3 h每隔30 min觀察1次小鼠的采食、飲水、被毛、活動、精神、癥狀起始時間和持續(xù)時間、死亡情況；之后每隔2 h觀察1次；2 d后，每天觀察3次。對死亡小鼠及時解剖記錄病變情況，在第八天將所有存活的小鼠采用脊椎脫臼法處死并解剖，觀察腹腔內(nèi)的液體狀況和實質(zhì)性器官的病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗結(jié)果

根據(jù)反復(fù)預(yù)試驗確定檳榔仁原液的LD0和LD100分別為6.0 g/（kg·bw）和24.0 g/（kg·bw），根據(jù)公式r= ■[r為相鄰兩組劑量的比值；a為最大劑量24.0 g/（kg·bw）；b為最小劑量6.0 g/（kg·bw）；n為預(yù)分組數(shù)]，計算得r=1.414 2。

2.2 正式試驗結(jié)果

根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，由r=1.414 2確定5個試驗組的給藥劑量分別為6.000、8.485、12.000、16.971、24.000 g/（kg·bw），按照GB15193.2-2014中的寇氏法要求計算LD50及其95%可信限。LD50計算公式為：

lgLD50=XK-d（∑p-0.5）

式中，XK為最大劑量組劑量的對數(shù)值；d為劑量間比值的對數(shù)值；∑p為各組死亡率之和，以小數(shù)表示。然后可算出LD50的95%可信限X，計算公式為：X=lg-1[lgLD50±1.96SlgLD50]。

計算得LD50=12.425 g/（kg·bw），LD50的95%可信限是10.610～14.551 g/（kg·bw）。根據(jù)化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[10]，檳榔仁汁液屬于2級毒性，即實際無毒物質(zhì)，大約相當(dāng)于體重70 kg人的致死劑量為350～1 050 g。

在本試驗中，為了進一步確定檳榔仁的食用安全情況，剖開新鮮檳榔取仁壓榨獲取檳榔仁原液，取17.942 g檳榔仁原液在60 ℃恒溫烘箱烘干后得干物質(zhì)1.948 g，得出檳榔仁原液干物質(zhì)占原液的10.86%，根據(jù)上述寇氏半數(shù)致死量計算方法，檳榔仁原液干物質(zhì)半數(shù)致死量為：LD50=1.349 g/（kg·bw），LD50的95%可信限為1.152～1.580 g/（kg·bw）。根據(jù)化合物經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[10]，檳榔仁原液干物質(zhì)屬于3級毒性，即低毒，大約相當(dāng)于體重70 kg人的致死劑量為35～350 g。

2.3 給藥后小鼠臨床癥狀及解剖病理變化

灌胃后，高劑量組小鼠表現(xiàn)拱背，全身顫抖，翹尾，呼吸急促，躁動不安，之后閉眼，眼球渾濁、黯淡，精神沉郁，呼吸短促，體溫偏低，流涎，懶動，腹脹，協(xié)調(diào)性差等現(xiàn)象。隨著時間的推移，癥狀加重，尾巴青紫，被毛凌亂，給藥30 min后開始出現(xiàn)死亡。但臨床表現(xiàn)出現(xiàn)時間不同，劑量越高出現(xiàn)癥狀的時間越短，耐過的受試小鼠逐漸恢復(fù)正常；低劑量組小鼠無顯著變化，活動量減少；對照組小鼠活躍，在籠中來回走動，似覓食狀。各劑量組動物的毒性反應(yīng)強度與劑量呈正相關(guān)。

死亡的小鼠被毛凌亂、無光澤，尾巴、四肢青紫，眼球塌陷。對死亡小鼠進行解剖，可見胸腔有出血現(xiàn)象，胃部和腸道充氣膨大，有氣泡，腸壁變薄、半透明，尾靜脈發(fā)黑，部分小鼠肺臟蒼白，其他器官未見明顯可眼觀的病變。但急促死亡的小鼠內(nèi)臟除胃部和腸道充斥大量氣泡外，無可眼觀病變。

2.4 給藥后不同時間小鼠的死亡率

小鼠死亡時間為給藥后0.5～28.0 h，死亡集中時間在給藥后0.5～4.0 h。正式試驗受試的60只小鼠共死亡24只，給藥后0.5～4.0 h內(nèi)死亡21 只，4.0～8.0 h內(nèi)死亡2只，8.0～28.0 h死亡1只，分別占87.5%、8.3%和4.2% ，給藥28.0 h后不再出現(xiàn)死亡，耐過的受試小鼠逐漸恢復(fù)正常。同時給藥3.0 h后開始逐漸恢復(fù)飲食欲的小鼠，飲食后被毛及活動亦逐漸恢復(fù)正常，之后沒有死亡；若不恢復(fù)飲食欲的小鼠，將會在3.0～28.0 h內(nèi)逐漸死去。

3 小結(jié)與討論

經(jīng)口急性毒性試驗是藥物毒理學(xué)安全性評價的第一步，具有了解受試物急性毒性強弱的作用。LD50是檢測物質(zhì)急性毒性的經(jīng)典指標(biāo)，穩(wěn)定性好，敏感度高。LD50數(shù)值越大，則表明受試物急性毒性越弱、越??；反之，急性毒性就越強、越大[11]。本試驗結(jié)果表明， 檳榔仁原液對小鼠經(jīng)口LD50為12.425 g/（kg·bw），LD50的95%可信限為10.610～14.551 g/（kg·bw），按毒性分級標(biāo)準(zhǔn)屬于實際無毒的藥物。檳榔仁原液干物質(zhì)半數(shù)致死量為1.349 g/（kg·bw），LD50的95%可信限是1.152～1.580 g/（kg·bw），按毒性分級標(biāo)準(zhǔn)屬于低毒物質(zhì)。

在海南省，嗜好咀嚼新鮮檳榔者，1 d中咀嚼檳榔數(shù)約3～30顆不等，從中獲取的檳榔仁的汁液量約10～100 g，此外在嚼食檳榔時最初幾口的汁液吐掉不吞服，因檳榔仁較嫩咀嚼易出汁液，所以吐出的主要是檳榔仁汁液，就檳榔仁1 d的食用量來說是安全的。該試驗還表明，試驗動物死亡時間集中在給藥后0.5～8.0 h內(nèi)，未死亡的動物在給藥后3.0 h出現(xiàn)飲食欲，癥狀也逐漸緩解，說明檳榔仁汁液起效快，代謝快，但其在體內(nèi)的吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化和排泄的藥代動力學(xué)的機理需進一步研究。同時在此次急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)，給予高劑量的檳榔仁汁液時，小鼠出現(xiàn)明顯的全身震顫、眼球渾濁、躁動不安、協(xié)調(diào)性差等現(xiàn)象，這與人食用過量檳榔后的表現(xiàn)一致，所以可能是檳榔仁的作用導(dǎo)致嚼食檳榔產(chǎn)生毒副作用的根源，但具體的成分還需進一步探究。

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