樹莓葉果黃酮類化合物含量及抗氧化性分析

楊國慧等

摘要：以樹莓（Rubus idaeus L.）品種美國22、歐洲紅、金秋、黑樹莓為試材，于2013年5～8月采集結(jié)果枝和根蘗苗中部葉片、青果、熟果，利用超聲波法和 NaNO2-Al（NO3）3比色法測(cè)定黃酮類化合物含量。結(jié)果表明，4個(gè)品種葉片的黃酮類化合物含量均在6月末最高，歐洲紅和美國22結(jié)果枝葉片的高于根蘗苗葉片；青果高于熟果，品種間的含量高低為金秋、美國22、歐洲紅、黑樹莓，同一品種葉片的黃酮類化合物含量高于果實(shí)。葉片的黃酮類化合物對(duì)4種自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）的清除能力均在6月末最強(qiáng)，青果高于熟果和葉片，青果中金秋的清除能力最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：樹莓（Rubus idaeus L.）；葉片；果實(shí)；黃酮類化合物；抗氧化性

中圖分類號(hào)：S663.2；Q944.5；Q946.83 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4514-05

樹莓（Rubus idaeus L.）為適合在寒地栽培的一種特色小漿果類果樹，據(jù)報(bào)道，樹莓的葉片與果實(shí)中均富含黃酮類化合物[1]。目前關(guān)于樹莓黃酮類化合物的研究所采用的試驗(yàn)材料其果實(shí)主要以紅樹莓為主，而葉片則采用成熟葉片。樹莓果實(shí)除紅色果之外，還有紫、黃、黑色果等類型；而葉片顏色在一年的生長期里會(huì)呈現(xiàn)出季節(jié)性的動(dòng)態(tài)變化。樹莓不同顏色的果實(shí)、不同季節(jié)的葉片、葉片和果實(shí)之間黃酮類化合物的含量與抗氧化性是否存在著差異，目前尚未見研究報(bào)道。試驗(yàn)通過對(duì)樹莓不同品種、不同發(fā)育時(shí)期的葉片和果實(shí)中黃酮類化合物的含量與抗氧化性進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步豐富其生理活性物質(zhì)的研究?jī)?nèi)容，拓寬樹莓的開發(fā)利用渠道[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

以果實(shí)顏色紫色為的樹莓品種美國22（R. idaeus cv. American 22）、紅色的歐洲紅（R. idaeus cv. European Red）、黃色的金秋（R. idaeus cv. Fall Gold）、黑色的黑樹莓（R. idaeus cv. Black Raspberry）為試驗(yàn)材料，其中美國22、歐洲紅、金秋3個(gè)品種采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，黑樹莓采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏棱漿果所試驗(yàn)基地[3]。美國22和歐洲紅越冬埋土，金秋和黑樹莓于春季萌芽前進(jìn)行平茬處理。分別于2013年5～8月底采集4 個(gè)品種結(jié)果枝和根蘗苗中部位置的葉片，以及各自的青果和成熟的果實(shí)，采后冷藏于冰箱內(nèi)備用。

試劑主要有乙醇、乙酸乙酯、石油醚、NaNO2、AlNO3、FeSO4、水楊酸、H2O2、HCl、Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚、過硫酸鉀等，都為分析純，總抗氧化能力檢測(cè)試劑2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為化學(xué)純，蘆丁為參照標(biāo)準(zhǔn)品（大連博邁科技發(fā)展有限公司）。

儀器主要有T6新悅型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、KQ3200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）以及電子天平、微型真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.2 方法

1.2.1 樹莓黃酮類化合物的提取與測(cè)定 分別稱取葉片組織2 g、果實(shí)組織5 g，按1∶12和1∶10（g/mL）的比例加入95%乙醇，采用超聲波儀在100 W下各提取3 次，每次30 min，真空泵減壓過濾。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用乙酸乙酯萃取至下層水相無色透明，其中葉片再用石油醚萃取（去脂、去葉綠素）。取萃取液再次進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后用95%乙醇定容得到黃酮類化合物提取物。以蘆丁為參照標(biāo)準(zhǔn)品（大連博邁科技發(fā)展有限公司），采用 NaNO2-Al（NO3）3比色法來測(cè)定黃酮類化合物的含量，測(cè)定波長為510 nm[4]。

1.2.2 樹莓黃酮類化合物抗氧化性分析 ①羥自由基·OH清除能力的測(cè)定。在試管中加入1.00 mL黃酮類化合物提取液、2.00 mL FeSO4（0.2 mmol/mL）溶液、1.50 mL水楊酸-乙醇（0.2 mmol/mL），最后加0.10 mL H2O2（0.03%），振蕩混合，37 ℃水浴下保溫30 min，于510 nm波長下測(cè)定吸光度A1。加入黃酮類化合物提取液，不加H2O2，測(cè)定其對(duì)比吸光度A2。以蒸餾水1.00 mL代替黃酮類化合物提取液，測(cè)定空白吸光度A0[5]。②超氧自由基O2-·清除能力的測(cè)定。采用Marklund法。向2.8 mL、pH 8.2的 Tris-HCl（50 mmol/L）緩沖液中加入黃酮類化合物提取液0.1 mL，25 ℃下保溫10 min，然后加入0.1 mL 25 ℃下預(yù)溫的鄰苯三酚（60 mmol/L），搖勻，于420 nm處測(cè)吸光度 A1。以0.1 mL HCl（60 mmol/L）溶液代替鄰苯三酚（60 mmol/L），此吸光度記為A2，以蒸餾水為空白對(duì)照[6]，測(cè)定空白吸光度A0。③自由基ABTS·清除能力的測(cè)定。精密稱取 ABTS 40.00 mg，加入10 mL蒸餾水，加入1.0 mg/mL的過硫酸鉀8.00 mL，黑暗下放置16 h，之后將其轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加蒸餾水32 mL，用無水乙醇定容至250 mL，放置10 h測(cè)定[7]。加0.5 mL黃酮類化合物提取液，然后加入1.5 mL 95%乙醇補(bǔ)至2 mL，再加入2 mL的 ABTS溶液混合，靜置30 min，734 nm下測(cè)吸光度 A1。以2 mL水代替ABTS溶液，測(cè)吸光度A2。以95%乙醇代替黃酮類化合物提取液，測(cè)定空白吸光度值A(chǔ)0[8-10]。④自由基DPPH·清除能力的測(cè)定。加入黃酮類化合物提取液0.2 mL，加入DPPH·乙醇溶液（25 μg/mL）2.8 mL，于515 nm處測(cè)定吸光度A1，直到讀數(shù)穩(wěn)定[11]。以2.8 mL 95%乙醇溶液代替DPPH·乙醇溶液，測(cè)定吸光度A2。以0.2 mL95%乙醇代替黃酮類化合物提取液，測(cè)定空白吸光度A0[12]。

樹莓黃酮類化合物提取液對(duì)上述4種自由基的清除能力（SA）可表示為：

SA（%）=[1-（A1-A2）/A0）]×100%，

式中，A0為空白吸光度；A1為加入黃酮類化合物溶液反應(yīng)的吸光度；A2為加入黃酮類化合物溶液未反應(yīng)的本底吸光度。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0與Microsoft Office Excel 2003軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓葉片、果實(shí)中黃酮類化合物在不同生長期含量的比較

4個(gè)樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓結(jié)果枝葉片黃酮類化合物含量在不同生長期的測(cè)定結(jié)果見圖1。從圖1可見，4個(gè)樹莓品種結(jié)果枝葉片黃酮類化合物含量在不同生長時(shí)期均表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，即6月>7月>8月>5月（黑樹莓平茬后從6月末采摘）；而不同樹莓品種葉片在同一生長期內(nèi)的含量亦有差異，其中6月末是歐洲紅的含量最高，其結(jié)果枝葉片的黃酮類化合物含量達(dá)到3.7 mg/g。

2個(gè)夏果型樹莓品種（歐洲紅、美國22）根蘗苗葉片黃酮類化合物含量在不同生長期的測(cè)定結(jié)果見圖2。從圖2可見，歐洲紅和美國22的根蘗苗葉片黃酮類化合物含量亦是在6月末最高，但2個(gè)品種根蘗苗葉片的黃酮類化合物含量均低于其結(jié)果枝葉片的含量。

4個(gè)樹莓品種的青果和熟果果實(shí)中黃酮類化合物含量的測(cè)定結(jié)果見圖3。從圖3可見，4個(gè)樹莓品種的青果果實(shí)中黃酮類化合物含量均明顯大于熟果。且不論青果還是熟果，其黃酮類化合物含量均是金秋>美國22>歐洲紅>黑樹莓。

選取4個(gè)樹莓品種黃酮類化合物含量最高時(shí)期（6月末）的結(jié)果枝葉片、根蘗苗葉片、青果和熟果果實(shí)進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。從圖4可見，4個(gè)樹莓品種在6月末的葉片黃酮類化合物含量均大大高于果實(shí)的黃酮類化合物含量。

2.2 樹莓葉片、果實(shí)中黃酮類化合物的抗氧化性比較

4個(gè)樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓葉片中黃酮類化合物對(duì)·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4種自由基的清除情況分別見圖5-a、圖5-b、圖5-c、圖5-d。從圖5中可見，4個(gè)樹莓品種葉片中黃酮類化合物對(duì)·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表現(xiàn)為6月末最強(qiáng)；品種中以歐洲紅最高，其對(duì)4種自由基：·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除率分別為74.31%、53.17%、82.88%和91.84%。

4個(gè)樹莓品種果實(shí)中黃酮類化合物對(duì)·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4種自由基的清除情況分別見圖6-a、圖6-b、圖6-c、圖6-d。從圖6中可見，4個(gè)樹莓品種果實(shí)中黃酮類化合物對(duì)·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表現(xiàn)為青果遠(yuǎn)大于熟果；品種中以金秋最高，其對(duì)4種自由基的清除能力最強(qiáng)，金秋對(duì)上述4種自由基的清除率分別為68.88%、63.88%、92.45%、96.39%。

選取4個(gè)樹莓品種在6月末采集的葉片（此階段黃酮類化合物含量最高），與其青果對(duì)4種自由基的清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果見圖7。從圖7可見，除了歐洲紅對(duì)·OH的清除能力表現(xiàn)為葉片大于青果（圖7-a）外，其余3個(gè)品種對(duì)4種自由基（圖7-b、圖7-c、圖7-d）、歐洲紅對(duì)其他3種自由基的清除能力（圖7-a）均表現(xiàn)為青果強(qiáng)于葉片。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)測(cè)定了4個(gè)果實(shí)顏色不同的樹莓品種歐洲紅、美國22、金秋、黑樹莓的結(jié)果枝、根蘗枝葉片和青果、熟果中黃酮類化合物在不同生長期含量的變化，結(jié)果表明，4個(gè)品種葉片黃酮類化合物含量均在6月末出現(xiàn)最大值，此階段和5月相比，葉片發(fā)育成熟，顏色較深，為具有旺盛光合作用的功能葉片[13]。而在7月末，夏果型樹莓歐洲紅和美國22已進(jìn)入果實(shí)成熟期，結(jié)果枝生長開始衰弱（夏果型樹莓的生長特點(diǎn)），葉片中的黃酮類化合物含量也表現(xiàn)為降低；但美國22一直到8月末降低的幅度都不大，可能是由于美國22是一個(gè)生長勢(shì)極強(qiáng)的品種，其結(jié)果枝上的葉片綠色期保持時(shí)間很長的緣故[14]。歐洲紅和美國22結(jié)果枝葉片的黃酮類化合物含量均高于根蘗苗，這可能是由于2個(gè)品種的結(jié)果枝為二年生枝條，含有較多的貯藏營養(yǎng)，因而葉片發(fā)育的成熟度更高一些。金秋和黑樹莓在萌芽前進(jìn)行了平茬處理，因此其結(jié)果枝皆為一年生枝條，其黃酮類化合物含量低于歐洲紅和美國22結(jié)果枝的含量，而和歐洲紅和美國22根蘗苗的含量相當(dāng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，樹莓葉片中的黃酮類化合物含量及抗氧化性與品種、植株的生長特性、枝條類型和葉片的發(fā)育時(shí)期有著很大的關(guān)系，因此在實(shí)際應(yīng)用中，若想獲得高含量黃酮類化合物的樹莓材料，則應(yīng)選擇黃酮類化合物含量高的品種，并在含量高的枝條上于適宜的生長期采摘。

樹莓葉片、果實(shí)中黃酮類化合物提取物對(duì)4種自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）均表現(xiàn)出一定的清除能力，且其清除能力和黃酮類化合物的含量有關(guān)，黃酮類化合物含量越高，清除能力則越強(qiáng)[15]。在4種自由基中，樹莓材料對(duì)DPPH·清除能力最強(qiáng)，如歐洲紅在6月份采集的葉片對(duì)DPPH·的清除能力可達(dá)到91.84%，說明樹莓中的黃酮類化合物具有極強(qiáng)的抗氧化能力。而對(duì)葉片、果實(shí)中的黃酮類化合物清除自由基能力的分析結(jié)果表明，雖然果實(shí)中的黃酮類化合物含量低于葉片中的含量[16]，但其抗氧化能力卻強(qiáng)于葉片，這可能是由于葉片與果實(shí)中的黃酮類化合物種類不同，因此表現(xiàn)出的生理活性也不同造成的。

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