芽孢桿菌8—32對大豆根腐病的生防效果

高同國等

摘要：從實驗室保存的237株細菌中篩選得到一株對大豆根腐病病原菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）具有較強拮抗能力的菌株8-32，該菌株經(jīng)生理生化試驗、16S rRNA基因序列分析最終鑒定為Bacillus subtilis。以尖孢鐮刀菌為病原菌研究了菌株8-32在盆栽條件下對大豆根腐病的防治作用。結(jié)果表明，菌株8-32可以有效防治大豆根腐病的發(fā)生，其防治效果最高可達32.08%，并且8-32可以明顯促進大豆植株幼苗的生長，使株高增加7.7%～15.8%；使葉綠素含量提高7.8%～12.9%；大豆POD活性增加11.6%～63.8%；說明菌株8-32對由尖孢鐮刀菌引起的根腐病具有顯著的防治效果，具有進一步應(yīng)用的潛力。

關(guān)鍵詞： 大豆根腐?。?生物防治； Bacillus subtilis； 生防效果

中圖分類號：Q949.32；R151 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4489-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.025

大豆是重要的經(jīng)濟及油料作物，原產(chǎn)于中國，而2000年中國成為全球最大的大豆進口國，2013年進口量為6338萬t，占全球大豆貿(mào)易總量的60%，對進口大豆的依存度高達80%左右。中國大豆種植產(chǎn)業(yè)面臨來自國際市場的巨大壓力，中國大豆單位面積產(chǎn)量遠低于其他主要大豆生產(chǎn)國（美國、阿根廷、巴西等），而由大豆根腐病引起的連作障礙是引起大豆減產(chǎn)的重要原因之一[1]。大豆根腐病是一種分布廣、危害重、病原菌種類繁多和防治困難的世界性病害，其中尤其以美國、日本、加拿大和中國等地發(fā)病嚴重[2]。在中國該病主要集中在東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)，僅黑龍江省每年發(fā)病面積就達7×105 hm2左右，占大豆播種面積的1/3以上。根腐病造成的產(chǎn)量損失一般達10%～30%，嚴重的可達50%～60%，甚至絕產(chǎn)[3]，因此大豆根腐病每年給國家造成數(shù)億元的經(jīng)濟損失。

中國自80年代以來相繼開展了大豆根腐病的防治研究，直到現(xiàn)在還主要依靠化學(xué)藥劑防治。化學(xué)藥劑的大量使用不僅導(dǎo)致土壤水體污染，威脅食品安全，直接危害人類健康，并且還會引起根腐病病原菌出現(xiàn)抗性，甚至抑制大豆的結(jié)瘤和氮的固定[4]。生物防治技術(shù)避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來的一系列問題而成為植物病害防治的重要手段。目前用于生物防治的菌株涉及到放線菌、細菌和真菌，其中研究最多的是芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），芽孢桿菌可以產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，抗逆能力強，繁殖速度快，營養(yǎng)要求簡單，易定殖在植物表面，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢對于生防制劑生產(chǎn)和儲存都是十分有利的[5]，芽孢桿菌正逐漸成為世界上生防細菌研究的重點。

在前期工作中，以大豆根腐病病原菌即尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為指示菌，采用平板對峙法從實驗室保存的237株芽孢桿菌中篩選得到一株具有較強拮抗能力的菌株8-32，對菌落菌體形態(tài)、生理生化性質(zhì)及16S rRNA基因序列進行分析、鑒定。本試驗采用盆栽方法對其生防效果進行了驗證，以期為開發(fā)大豆根腐病生防菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

指示菌為尖孢鐮刀菌，由中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究院王光華教授提供。細菌為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分離保存的237株細菌。大豆為冀豆12，購買于種子市場。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖或蔗糖20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂15～18 g；NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2；每1 000 mL NB培養(yǎng)基中加入瓊脂15～18 g為NA培養(yǎng)基。

1.3 微生物活化

尖孢鐮刀菌的活化采用PDA培養(yǎng)基，用打孔器取直徑6 mm的指示菌（尖孢鐮刀菌）菌餅，置于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，待用。細菌的活化采用NA培養(yǎng)基，將4 ℃保存的細菌接種在NA培養(yǎng)基中進行活化，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出一環(huán)接種于NB培養(yǎng)基中，置于搖床中以37 ℃ 160 r/min培養(yǎng)48 h待用。

1.4 盆栽試驗

采集農(nóng)田土，風(fēng)干后過10目篩，每盆（直徑13 cm×高12 cm）裝土1 000 g。澆透水晾2 d后，每盆放5塊直徑為6 mm的尖孢鐮刀菌菌餅。將表面消毒后的大豆播種于盆中，每盆保苗3株，每個處理60盆。同時，在每粒種子上加入1 mL濃度為1×106 CFU/mL（處理1）或1×108 CFU/mL（處理2）的Bacillus subtilis 8-32菌液。待大豆生長到第7天、第14天和第21天對大豆根腐病病情指數(shù)進行調(diào)查，并測定其株高、植株干重、葉片中葉綠素含量和根部過氧化酶系（CAT、POD）活性的變化。

1.5 病情指數(shù)

每個處理取20盆，對盆中60株大豆幼苗發(fā)病程度進行分析，根據(jù)根腐病分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）對大豆幼苗根部進行分級。

分級后對病情指數(shù)進行計算：

病情指數(shù)=100×∑（級數(shù)×該級株數(shù)）/（發(fā)病最高級數(shù)×總株數(shù)）

1.6 葉綠素含量測定

葉綠素的測定參照文獻[6]。選取生長發(fā)育正常、無病蟲害、無干葉的大豆葉片，暗處保存。在避光室內(nèi)，取出待測樣品，剪碎，混勻。精確稱取2.0 g樣品于研缽中，加少量碳酸鈣及80%丙酮溶液3 mL研磨勻漿，再加丙酮10 mL繼續(xù)研磨至葉片組織變白。將研磨后的樣品濾入100 mL棕色容量瓶中，并用80%丙酮定容至100 mL，測定葉綠素含量。

80%丙酮作參比液，分別在645 nm和665 nm處測定樣品液的吸光值，并且按下列公式計算葉綠素含量，重復(fù)3次。

葉綠素含量=（20.29A645 nm+8.04A665 nm）×V/1000×W

其中A645 nm、A665 nm分別為645 nm和665 nm時的吸光度，V為提取液總體積（mL），W為葉片鮮重（g）。

1.7 POD活性測定

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]，以1 min內(nèi)OD470 nm變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）。取大豆病根1 g放入研缽中，加5 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿后以4 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶提取液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL試管4支，3支測定，1支對照。每支試管加2.9 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液，1 mL 0.05 moL/L愈創(chuàng)木酚和0.1 mL粗酶液，對照組用1 mL 0.05 moL/L磷酸緩沖液代替粗酶液。反應(yīng)體系加入粗酶液后，立即于37 ℃水浴中保溫15 min，加入1 mL質(zhì)量百分數(shù)為2%的H2O2后立即測定，470 nm波長下測定吸光度。

根據(jù)公式計算出酶活性，計算公式為：POD活性[U/（g Fw·min）]=（Vt×ΔOD）/0.01Fw×V2×Δt

式中，每分鐘內(nèi)變化0.01為1個活性單位（U），過氧化物酶活性單位[U/（g Fw·min）]；其中ΔOD為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，比色波長為470 nm；Δt為ΔOD對應(yīng)的時間（min）；Vt為酶液總體積（mL）；V2為測定時取用的提取酶液體積（mL）；Fw為樣品鮮重（g）。

1.8 CAT活性測定

CAT活性測定采用紫外吸收法[8]， 以1 min內(nèi)ΔA240 nm減少0.1的酶量為1個過氧化氫酶活性單位（U）。稱取大豆根部樣品0.5 g放置于遇冷研缽中，加2～3 mL pH 7.0的磷酸緩沖液（4 ℃預(yù)冷），冰浴研磨勻漿移至25 mL容量瓶中。用磷酸緩沖液沖洗研缽數(shù)次，定容。將容量瓶置于5 ℃冰箱中靜置10 min。取上清液于離心管中離心（4 ℃，4 000 r/min，15 min），上清液即為粗酶提取液，取上清液并在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL試管4支，3支測定，1支對照。每支試管加2 mL去離子水，3 mL pH 7.8的磷酸緩沖液，0.4 mL粗酶液，對照加等量的磷酸緩沖液。試管于25 ℃水浴中預(yù)熱3 min后，各加0.1 moL/L的過氧化氫溶液0.6 mL，每加1管立即測A240 nm，分別于60、120、180 s記錄每支試管的測量值。

CK組測得的吸光值記為A0，處理1記為A1，處理2記為A2。

ΔA240 nm=A0-（A1+A2）/2

過氧化氫酶活性[U/（g FW·min）]=ΔA240×Vt/（0.1V1×t×Fw）

Vt為酶液總體積（mL）；V1為測定時取用的提取酶液體積（mL）；Fw為樣品鮮重（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌8-32對大豆的促生作用

研究了生防菌8-32對大豆幼苗的促生作用，結(jié)果見表2。表明8-32有效促進了大豆的生長，當(dāng)每粒種子加入1×106 CFU/mL菌液后，其第1周、第2周、第3周株高分別增加12.5%、9.3%和7.7%，而當(dāng)加入量為1×108 CFU/mL時，第1周至第3周株高分別增加15.8%、11.6%和13.1%，并且干物質(zhì)重量都有明顯的增加。進一步采用Sackowskis比色法測定，以LB為培養(yǎng)基，30 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，測得發(fā)酵上清液中吲哚乙酸（IAA）的質(zhì)量濃度為45.29 mg/L。

在植物病害生物防治領(lǐng)域中，枯草芽孢桿菌已經(jīng)成為主要的生防細菌之一，它具有較強的防病作用。IAA是一種重要的植物激素，可以促進植物根系生長發(fā)育[9]，研究表明，8-32具有較強的IAA產(chǎn)生能力，具有促進大豆生長的能力。

2.2 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病的防治效果

通過大豆盆栽試驗研究了枯草芽孢桿菌對大豆根腐病的防治效果，結(jié)果見表3、表4。表明8-32對大豆幼苗根腐病具有明顯的防治作用，其生防效果為13.22%～32.08%，并且處理1生防效果優(yōu)于處理2，處理1在大豆栽培第2周時防治效果達到最高，為32.08%。試驗中分別采用2種濃度的8-32進行盆栽試驗，其中處理1（1×108 CFU/mL）菌含量明顯低于處理2（1×108 CFU/mL），但防治效果卻較處理2更明顯，其原因還需進一步分析。

2.3 枯草芽孢桿菌8-32對大豆葉綠素含量的影響

葉綠素含量的多少是檢測植物光合作用強弱和有機物合成能力的重要指標(biāo)，并且與氮素營養(yǎng)有密切關(guān)系。試驗中進一步研究了枯草芽孢桿菌8-32對大豆植株中葉綠素含量的影響，結(jié)果見圖1。與對照組相比，8-32增加了葉片中葉綠素的含量。在第1周，處理1和處理2分別較CK高9.2%和12.4%，在第2周時處理1、處理2較CK分別增加了12.3%和12.9%，第3周處理1和處理2較CK高7.8%和8.8%。枯草芽孢桿菌8-32可以提高大豆幼苗葉片中葉綠素的含量。

2.4 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病根系過氧化物酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)可以減小活性氧對細胞產(chǎn)生的危害，與植物抗逆具有密切聯(lián)系[10，11]。本試驗研究了大豆幼苗POD及CAT酶的活性變化。其中POD活性見圖2，結(jié)果表明，8-32有效增加了大豆幼苗根部POD的活性，處理2優(yōu)于處理1。第1周時處理1和處理2分別比對照組提高了19.7%和32.8%，第2周時處理1和處理2的POD活性分別比對照增加11.6%和41.8%，第3周分別增加22.4%和63.8%，上述結(jié)果與溫廣月[12]研究18BR2-2對大豆根腐病的生防效果一致。

2.5 枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病根系過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶同樣是抗氧化酶系的主要組成之一。由圖3可以看出，接種8-32后第1周及第2周CAT活性有明顯的提高，在第3周不明顯。其中以第2周處理1提高幅度最大，達50%，說明8-32可以提高大豆根部過氧化氫酶的活性。

3 小結(jié)

由試驗結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌8-32對大豆根腐病具有一定的防治效果，當(dāng)接種濃度為1×106 CFU/（mL·株）時，可以有效防治大豆根腐病的發(fā)生，其防治效果達到32.08%。并且使用8-32可以有效提高大豆葉片中葉綠素含量，增加植株根系過氧化物酶及過氧化氫酶等抗氧化酶系的活力。8-32具有較強的大豆根腐病的防治能力，可進一步開發(fā)應(yīng)用于實際生產(chǎn)，但其機理尚不明確，還需進一步研究。

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