蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液濃縮工藝研究

周榮華等

摘要： 通過對2種不同亞種的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）發(fā)酵液進行濃縮工藝的研究，探索了不同溫度對濃縮液有效成分的影響程度，比較了不同濃縮方式、不同干燥方式處理下有效成分的回收率。結(jié)果表明，真空薄膜濃縮工藝的回收率要高于離心濃縮工藝23%～29%。

關鍵詞： 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）； 真空薄膜濃縮； 離心濃縮

中圖分類號：Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4479-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.022

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是當前研究最多、應用最廣的微生物農(nóng)藥，在農(nóng)作物蟲害生物防治中起到重要作用，廣泛應用于蔬菜、水稻、棉花、林業(yè)、衛(wèi)生害蟲的生物防治。蘇云金芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝主要按照液體深層發(fā)酵、離心濃縮、噴霧干燥、劑型化的路徑進行的，在離心濃縮過程中會產(chǎn)生工藝廢水，其化學需氧量和生化需氧量均較高，廢水處理成本高[1，2]。而在離心濃縮的工藝廢水中存在著大量可溶性物質(zhì)，其中包含許多值得回收的氨基酸、增效物質(zhì)、抗菌物質(zhì)等。根據(jù)未公開的記錄，湖北省農(nóng)業(yè)科學院生物農(nóng)藥工程研究中心在20世紀90年代初，曾開展過蘇云金芽孢桿菌真空薄膜濃縮工藝的探索，限于當時的裝備條件和控制水平，經(jīng)常發(fā)生結(jié)焦堵管的現(xiàn)象。而中國現(xiàn)在的裝備條件、加工工藝和控制水平較20年前有了長足的進步，只要能有效地將物料溫度控制在較低的水平，結(jié)焦堵管的現(xiàn)象完全可以避免。本研究就蘇云金芽孢桿菌兩個菌種的真空薄膜濃縮工藝進行了濃縮條件和回收率的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種MP18、蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種NBIC380，均系湖北省農(nóng)業(yè)科學院生物農(nóng)藥工程研究中心分離并保存；發(fā)酵液由湖北省農(nóng)業(yè)科學院生物農(nóng)藥工程研究中心工程技術(shù)研究室提供。

儀器：真空薄膜濃縮器，蒸發(fā)量30 L/h，由黑龍江大三源乳品機械有限公司生產(chǎn)；Eppendorf 5424 離心機（艾本德中國有限公司）；LGJ-200F冷凍干燥機（黑龍江大三源乳品機械有限公司）；噴霧干燥塔，蒸發(fā)量10 L/h，由黑龍江大三源乳品機械有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 真空薄膜濃縮方法 取5 L發(fā)酵液加入真空薄膜濃縮器料斗中，經(jīng)加熱器加熱到設定溫度后送至分離器，在真空度-80～-90 kPa下進行蒸發(fā)和分離，蒸氣通過冷凝器冷凝成水后排出，濃縮后的物料取出后通過不同方式進行干燥。

1.2.2 離心濃縮方法 取5 L發(fā)酵液分批加入離心管中，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下進行離心分離，倒掉上清液，取出沉淀通過不同方式進行干燥。

1.2.3 冷凍干燥方法 將濃縮物放入冷凍干燥機中24 h，待完全干燥后取出，稱重后備用。

1.2.4 噴霧干燥方法 將濃縮物在進口風溫150 ℃、塔內(nèi)溫度60 ℃條件下進行噴霧干燥，收集稱重后備用。

1.2.5 分析檢測方法 蘇云金芽孢桿菌MP18、蘇云金芽孢桿菌NBIC380均采用GB/T19567.1-2004中生物測定法測定生物效價。

1.2.6 總有效成分計算方法 總有效成分=生物效價×質(zhì)量

1.2.7 有效成分回收率計算方法 有效成分回收率=不同處理的產(chǎn)物質(zhì)量×產(chǎn)物生物效價×100/發(fā)酵液直接凍干的產(chǎn)物總有效成分

1.2.8 工藝廢水化學需氧量和5日生化需氧量檢測方法 取離心濃縮上清液和真空薄膜濃縮冷凝液各5 L送武漢市環(huán)境監(jiān)測中心委托檢測，采用GB11914-1989、HJ505-2009兩項標準中的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種MP18的濃縮試驗結(jié)果

2.1.1 最適濃縮溫度 由表1、圖1均可看出，隨著濃縮溫度的逐漸升高，MP18的效價有明顯的下降。

在45、50、55 ℃條件下濃縮產(chǎn)物的生物效價見表2，結(jié)果表明，45、50 ℃濃縮條件下MP18活性保持相差不大。

2.1.2 不同濃縮方式處理的產(chǎn)物回收率 用MP18的發(fā)酵液直接真空薄膜濃縮得到的產(chǎn)物效價要普遍低于離心濃縮處理得到的產(chǎn)物效價（61 579 IU/mg，表1），但是將2種處理方式得到的濃縮液凍干或者噴霧干燥后，前者得到的產(chǎn)物的質(zhì)量要遠遠大于后者，因為離心濃縮后丟棄的上清液里含有一定量的可溶性物質(zhì)。

上表顯示采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產(chǎn)物的質(zhì)量是離心濃縮方式得到的產(chǎn)物質(zhì)量的1.77倍，回收率得到了極大的提高，效價回收率提高了29%。

2.1 蘇云金芽孢桿菌NBIC380的濃縮試驗

2.2.1 最適濃縮溫度 由表4可知，50、60 ℃條件下蒸發(fā)后的產(chǎn)品效價差別較小，但顯然60 ℃條件下的蒸發(fā)效率較高，故后續(xù)采用60 ℃左右的溫度繼續(xù)試驗。因此不同的菌株在真空薄膜濃縮蒸發(fā)條件下效價可能有很大的差別。

進一步的濃縮試驗結(jié)果見表5，表明60 ℃比較適合NBIC380的濃縮，該條件下既保證了NBIC380的濃縮效率，又不至于過多降低其效價。

2.2.2 不同濃縮方式的產(chǎn)物回收率 與MP18發(fā)酵液的濃縮試驗不同，由NBIC380的發(fā)酵液直接真空薄膜濃縮得到的產(chǎn)物效價只是略為低于離心濃縮處理得到的產(chǎn)物效價（85 642 IU/mg，表4），說明NBIC380的發(fā)酵上清里有超過MP18的大量增效物質(zhì)存在。分別計算以真空薄膜濃縮（60 ℃）和離心濃縮兩種方式回收到的產(chǎn)物量，結(jié)果見表6。

表6顯示，采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產(chǎn)物的質(zhì)量是離心濃縮方式得到的產(chǎn)物質(zhì)量的1.41倍，效價回收率提高了23%，且前者的產(chǎn)量要遠遠高于后者。

2.3 工業(yè)廢水化學需氧量和五日生化需氧量的測定結(jié)果

從表7可以顯看出，蒸發(fā)冷凝液的化學需氧量和五日生化需氧量均不到離心上清液的1%。

3 討論

結(jié)果表明，從回收率和生產(chǎn)效率兩方面綜合考察，50～60 ℃之間是相對適宜的蒸發(fā)溫度，不同菌株適宜的蒸發(fā)溫度有差異，回收率較離心濃縮工藝提高10%～36%。理論上講，更低的溫度應該會對有效成分的回收更加有利，但會帶來生產(chǎn)效率下降和生產(chǎn)成本增加，因此在選擇濃縮條件和工藝時需綜合考慮。

相比離心濃縮工藝產(chǎn)生的廢水，采用真空薄膜濃縮工藝產(chǎn)生的廢水的生化需氧量明顯會小得多，廢水處理的成本也會小得多[3-5]，這方面的環(huán)保效益還需要進一步的研究。

由于真空薄膜濃縮保留了大量溶解在水中的各種成分[6，7]，使得原藥的有效成分含量有所下降，且其中有些成分可能對后續(xù)的劑型加工有一定的影響。但這些被保留的成分，如氨基酸、糖類、抑菌物質(zhì)等對作物生長可能帶來積極的影響。這些同樣需要進一步的研究。

參考文獻：

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