胰蛋白酶水解谷朊粉制備多肽的工藝優(yōu)化

劉玉婷，潘進(jìn)權(quán)*，劉夏婷

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江524048）

胰蛋白酶水解谷朊粉制備多肽的工藝優(yōu)化

劉玉婷，潘進(jìn)權(quán)*，劉夏婷

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江524048）

為提高谷朊粉蛋白的加工性能及功能性質(zhì)，考察了胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白制備水溶性多肽的工藝。采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)法對(duì)影響谷朊粉蛋白酶解工藝的多個(gè)因素進(jìn)行了分析，通過試驗(yàn)優(yōu)化確定了谷朊粉蛋白適宜的酶解工藝條件為：谷朊粉蛋白質(zhì)量濃度3 g/100 mL，加酶量為4 056 U/g，pH 11，溫度48℃，時(shí)間為4 h。在優(yōu)化的工藝條件下，谷朊粉蛋白的水解度可以達(dá)到8.03%，水溶性多肽得率為64.2%。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用胰蛋白酶的水解作用將谷朊粉蛋白轉(zhuǎn)化為水溶性的多肽具有可行性。

谷朊粉；胰蛋白酶；水解；多肽

谷朊粉俗稱小麥面筋蛋白，它是將小麥面粉中的蛋白質(zhì)經(jīng)初步分離并烘干而獲得的一種粉末狀產(chǎn)品，其主要成分是蛋白質(zhì)，含量高達(dá)70%～80%，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，因其氨基酸組成較為合理，谷朊粉是一種營養(yǎng)價(jià)值較為豐富的天然植物蛋白質(zhì)［1-2］。然而，由于谷朊粉蛋白肽鏈中含有較多的疏水性氨基酸，其分子內(nèi)疏水作用區(qū)域較大，這導(dǎo)致該蛋白的水溶性及分散性能極差；此外，由于其分子內(nèi)疏水相互作用太強(qiáng)導(dǎo)致其成膜性、起泡性及乳化性均較弱［3］。因此，谷朊粉蛋白在食品加工中推廣應(yīng)用受到了很大的限制。提高谷朊粉蛋白質(zhì)的加工性能及功能性質(zhì)是開發(fā)應(yīng)用這一蛋白資源的關(guān)鍵。對(duì)此，國內(nèi)外已有一些有關(guān)谷朊粉蛋白質(zhì)的化學(xué)改性［4-6］、物理改性［7-8］及酶促改性［9-10］的相關(guān)研究報(bào)道。

從谷朊粉蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來看，制約該蛋白加工性能及功能性質(zhì)的關(guān)鍵是其水溶性太差，改善其水溶性是解決問題的關(guān)鍵［11-12］。已有的大量研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)初步酶解后得到的多肽往往具有優(yōu)良的水溶特性，其乳化性、起泡性也可以得到很好的改善［13］；此外，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解制備的多肽通常具有多種多樣的生理功能，如參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收及抗血栓等［14-15］，已成為篩選藥物、制備功能性食品和食品添加劑的天然資源寶庫［16-18］。因此，利用蛋白酶對(duì)谷朊粉蛋白的酶解作用將其轉(zhuǎn)化為水溶性多肽即可以解決其固有的加工性能之缺陷，同時(shí)又可以拓寬該植物蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。鑒于此，本研究將以谷朊粉蛋白水解及水溶性多肽的高效制備為目標(biāo)對(duì)谷朊粉的酶解工藝進(jìn)行了探討，并采用響應(yīng)面分析的方法對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，其研究結(jié)果將為谷朊粉蛋白多肽的工業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

谷朊粉（蛋白質(zhì)含量70.53%）：華森食品配料有限公司；胰蛋白酶（酶活力73 907.6 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)過程中用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SKD-08S2紅外智能消化爐、SKD-600自動(dòng)凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；723N可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋：江蘇金壇市億通電子有限公司；LXJ-IIB飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；pHS-3C+酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；TH-300A梯度混合器：上海青浦瀘西儀器廠；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；2XZ-4型旋片式真空泵：上海德英真空照明設(shè)備有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1谷朊粉的酶解工藝流程

谷朊粉液→調(diào)節(jié)pH值→加入胰蛋白酶→保溫酶解→沸水浴滅酶→離心分離→蛋白水解液

操作要點(diǎn)：用蒸餾水配制蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L的谷朊粉液，調(diào)節(jié)其pH值為8.0，按照2 500 U/g蛋白的加酶量加入胰蛋白酶，混勻后置于45℃水浴中保溫酶解3 h；將酶解液在100℃水浴中滅酶10min，于8000 r/min條件下離心10min，收集上清液即得到蛋白水解液。

1.3.2測定方法

粗蛋白含量、總氮的含量及多肽含量的測定采用凱氏定氮法［19］；蛋白酶活力標(biāo)定：采用Folin-酚法［20］；氨基酸態(tài)氮的含量的測定采用甲醛滴定法［21］，蛋白質(zhì)水解度（degree of hydrolysis，DH）及多肽得率的計(jì)算公式如下：

式中：N1為蛋白水解過程中生成的氨基酸態(tài)氮的含量，g/g谷朊粉；N2為樣品中總氮的含量；g/g谷朊粉。

式中：M1為水解液中多肽含量，g/mL；M2為水解液中蛋白質(zhì)含量，g/mL。

1.3.3酶解工藝的單因素試驗(yàn)

底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響：配制蛋白質(zhì)量濃度分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L的谷朊粉溶液，按照1.3.1所述方法進(jìn)行酶解，測定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察底物蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響。

酶用量對(duì)酶解工藝的影響：按照1.3.1所述方法，分別在1 200 U/g、1 600 U/g、2 000 U/g、2 400 U/g、2 800 U/g、3 200 U/g蛋白的加酶量下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察加酶量對(duì)酶解工藝的影響。

酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響：按照1.3.1所述方法，分別在不同時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h）條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響。

pH值對(duì)酶解工藝的影響：按照1.3.1所述方法，分別在不同pH（6、7、8、9、10、11、12）條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察pH值對(duì)酶解工藝的影響。

酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響：按照1.3.1所述方法，分別在不同溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測定蛋白水解液的水解度及多肽得率，由此考察溫度對(duì)酶解工藝的影響。

1.3.4酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果及分析，初步確定了影響谷朊粉酶解工藝的主要因素以及各因素的適宜取值范圍。以加酶量、酶解溫度及pH值3個(gè)因素為變量，分別以水解度（Y1）及多肽得率（Y2）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)對(duì)這3個(gè)因素做進(jìn)一步考察并優(yōu)化，由此確定它們的最佳取值，進(jìn)而確定最佳的酶解工藝條件，因素與水平見表1。

表1　中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)分析

2.1.1底物蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響

在其他條件不變的前提下，分別以不同質(zhì)量濃度的谷朊粉蛋白進(jìn)行酶解試驗(yàn)，考察了蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1　底物蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酶解工藝的影響Fig.1 Effect of protein concentration on the hydrolysis process of wheat gluten

由圖1可知，在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍之內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度低于4 g/100 mL時(shí)，蛋白水解度受底物質(zhì)量濃度的影響并不明顯，這說明在此試驗(yàn)條件下原蛋白肽鏈中能夠被作用的肽鍵已水解完全；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度＞4 g/100 mL，水解度會(huì)隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而降低，說明原蛋白肽鏈上部分能夠被作用的肽鍵并沒有被水解，這是由于谷朊粉蛋白難溶于水，過高的質(zhì)量濃度會(huì)造成蛋白分散困難，甚至結(jié)團(tuán)從而直接影響其水解效率。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)水溶性多肽的得率與蛋白水解度的變化趨勢基本相一致，并與蛋白質(zhì)量濃度有一定關(guān)系，酶解體系中蛋白質(zhì)量濃度太高（＞3 g/100 mL）將會(huì)導(dǎo)致多肽得率明顯降低。綜合考慮水解度及多肽得率兩個(gè)指標(biāo)，確定了酶解工藝適宜的谷朊粉蛋白質(zhì)量濃度為3 g/100 mL。

2.1.2加酶量對(duì)水解度的影響

在酶解體系中分別加入不同量的胰蛋白酶進(jìn)行谷朊粉酶解試驗(yàn)，考察了加酶量對(duì)酶解工藝的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　加酶量對(duì)酶解工藝的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the hydrolysis process of wheat gluten

由圖2可知，在試驗(yàn)條件下谷朊粉蛋白的水解度及多肽得率隨加酶量的增加而顯著增加，當(dāng)加酶量＞3 500 U/g時(shí)，水解度與多肽得率增加趨于平緩，說明原蛋白肽鏈中能夠被作用的肽鍵已基本水解完全。因此，初步確定酶解體系中胰蛋白酶的適宜添加量在3 500 U/g左右。

2.1.3酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響

分別在不同的溫度條件下進(jìn)行谷朊粉酶解試驗(yàn)，考察了酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3　酶解溫度對(duì)酶解工藝的影響Fig.3 Effect of hydrolyzing temperature on the hydrolysis process of wheat gluten

由圖3可知，當(dāng)酶解體系溫度＜50℃時(shí)，隨著酶解溫度的升高蛋白水解度及多肽得率隨之增加；當(dāng)酶解體系溫度＞55℃時(shí)，蛋白水解度會(huì)迅速下降，說明在此溫度條件下酶失活嚴(yán)重。因此，初步確定谷朊粉酶解的適宜酶解溫度在50℃左右。

2.1.4pH值對(duì)酶解工藝的影響

在不同的pH值條件下進(jìn)行谷朊粉酶解試驗(yàn)，考察了pH值對(duì)酶解工藝的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4　pH對(duì)酶解工藝的影響Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis process of wheat gluten

由圖4可知，在pH值＜8的情況下，蛋白水解度及多肽得率隨pH的增加呈現(xiàn)緩慢增加趨勢；當(dāng)體系pH值為8～11時(shí)，蛋白水解度及多肽得率隨pH值升高迅速增加；當(dāng)體系pH值＞11時(shí)，蛋白水解度及多肽得率的增加又趨于平緩；堿性的環(huán)境有助于谷朊粉蛋白的水解，這可能與谷朊粉蛋白在堿性條件下相對(duì)較好的水溶性有關(guān)［22］。因此，初步確定了胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白的適宜pH值在11左右。

2.1.5酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響

分別在不同的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行谷朊粉酶解試驗(yàn)，考察了酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響Fig.5 Effect of hydrolyzing time on the hydrolysis process of wheat gluten

由圖5可知，在酶解時(shí)間＜4 h時(shí)，蛋白水解度及多肽得率隨著酶解時(shí)間的延長而逐漸增加，說明這此時(shí)間范圍內(nèi)蛋白肽鏈上可被作用的肽鍵并未完全水解，酶解不充分；當(dāng)酶解時(shí)間＞4 h后，蛋白水解度及多肽得率的增加不明顯，說明在此試驗(yàn)條件下酶解已結(jié)束。因此，谷朊粉蛋白酶解的適宜時(shí)間為4 h。

2.2酶解工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定谷朊粉蛋白質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，酶解時(shí)間為4 h，以水解度（Y1）及多肽得率（Y2）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法中的中心組合試驗(yàn)對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

分別以水解度及多肽得率為響應(yīng)值對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，可以擬合得到以下數(shù)學(xué)模型：

表2　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design and experimental results

由表3方差分析可知，該模型的P=0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.142 8，表明擬合得到的模型極顯著，失擬不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.960 4，說明該模型可以解釋96.04%的試驗(yàn)結(jié)果，模型擬合度非常高，可以用于說明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。此外，在考察的3個(gè)因素中，因素A與因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01），因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P＜0.05）；在各因素設(shè)定的取值范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值（Y1）的影響強(qiáng)弱依次為A＞C＞B。

表3　回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

以谷朊粉蛋白水解度（Y1）為響應(yīng)值，在固定一個(gè)因素取值為0水平的前提下，繪制模型（1）的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖6所示。

圖6　加酶量（A），溫度（B）與pH（C）交互作用對(duì)谷朊粉蛋白水解度影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between enzyme addition，temperature and pH on hydrolysis degree of wheat gluten

由圖6可知，模型確定的響應(yīng)曲面是典型的凸面，在該曲面上必然存在最大響應(yīng)點(diǎn)，與之對(duì)應(yīng)的各因素取值分別為加酶量（A）4 056 U/g，溫度（B）48.2℃，pH值（C）為11.13。此條件下理論谷朊粉蛋白水解度為（8.09±0.19）%，多肽得率為（65.03±1.71）%?？紤]到實(shí)際操作的方便，將各因素修正為加酶量4 056 U/g，溫度48℃，pH值為11。在修正條件下進(jìn)行4次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，谷朊粉蛋白水解度結(jié)果的平均值為8.03%，多肽得率為64.2%，與模型預(yù)測值基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。

3　結(jié)論

本研究以谷朊粉蛋白水解及水溶性肽的制備為目標(biāo)，考察了影響胰蛋白酶水解谷朊粉蛋白的工藝條件：底物蛋白濃度、加酶量、溫度、pH值及酶解時(shí)間。采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化并確定了最佳的谷朊粉酶解工藝條件為谷朊粉蛋白質(zhì)量濃度3 g/100 mL，加酶量為4 056 U/g，pH 11，酶解溫度48℃，酶解時(shí)間為4 h。在此優(yōu)化的工藝條件下，谷朊粉蛋白的水解度可以達(dá)到8.03%，水溶性多肽得率達(dá)到64.2%。試驗(yàn)結(jié)果表明，胰蛋白酶對(duì)谷朊粉蛋白有相對(duì)較強(qiáng)的水解能力，通過胰蛋白酶的作用可顯著提高谷朊粉蛋白的水溶性，從而提高該蛋白原料的加工性能。

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Optimization of polypeptides preparation process from wheat gluten by trypsin hydrolysis

LIU Yuting，PAN Jinquan*，LIU Xiating
（School of Life Science and Technology，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China）

To improve the processing and functional properties of wheat gluten protein，the preparation process of polypeptides from wheat gluten protein by trypsin hydrolysis was investigated and optimized through single factor and response surface method.After optimization，the optimum process conditions for the enzymatic hydrolysis of wheat gluten protein were determined:wheat gluten protein concentration 3 g/100 ml，trypsin addition 4 056 U/g，pH 11，temperature 48℃，time 4 h.Under the conditions，the hydrolysis degree of wheat gluten protein could reach 8.03%，and the yield of water soluble polypeptides was 64.2%.The experimental results showed that the process for the transformation of gluten protein into water soluble polypeptides by trypsin hydrolysis was feasible.

wheat gluten；trypsin；hydrolysis；polypeptides

TS201.1

A

0254-5071（2015）10-0018-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.005

2015-09-16

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA780084）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A010107016）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310579014）

劉玉婷（1990-），女，助教，本科，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

潘進(jìn)權(quán)（1978-），男，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。