狂犬病疫苗研究進(jìn)展

江馗語

在全球共有150多個(gè)國家和地區(qū)存在狂犬病，每年大約有2～6萬人死于該病，其中99%發(fā)生在亞洲和非洲等發(fā)展中國家。有關(guān)國際組織已經(jīng)制定了全球消滅狂犬病的目標(biāo)路線圖，計(jì)劃到2015年和2020年，分別在拉美國家和東南亞國家消滅人類和犬的狂犬病。國際社會普遍認(rèn)為，狂犬病是一種100%可通過疫苗預(yù)防的疫病，在狂犬病感染國，只要犬的免疫密度能夠達(dá)到70%，犬狂犬病即可消滅，且人間病例可快速下降至零。我國狂犬病每年發(fā)病人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。因此，我們要實(shí)施犬的全面免疫，做好人的暴露后預(yù)防工作，加快推進(jìn)狂犬病的控制以及消滅進(jìn)程。今年，我省也提到要按照《遼寧省養(yǎng)犬管理規(guī)定》要求，組織開展狂犬病免疫工作?，F(xiàn)將幾種狂犬病疫苗的研究進(jìn)展分別進(jìn)行介紹。

一、常規(guī)疫苗

目前，狂犬病免疫所用的常規(guī)疫苗分為滅活疫苗和弱毒活疫苗兩類。

（一）滅活疫苗 滅活疫苗主要是經(jīng)滅火劑等滅活生產(chǎn)的組織或細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。發(fā)達(dá)國家一直使用滅活疫苗，而我國還沒有在犬的免疫預(yù)防中推廣開來。由于狂犬病滅活疫苗具有安全、高效的優(yōu)點(diǎn)，從安全的角度考慮，人們越來越傾向于滅活的狂犬病疫苗。近幾年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的獸用狂犬疫苗有中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的Flury株凍干滅活疫苗、解放軍軍事獸醫(yī)研究所的CVS-11 株滅活疫苗、遼寧成大的PV2061株滅活疫苗、遼寧益康的 Flury 株滅活疫苗、唐山怡安的CTN1株滅活疫苗、常州同泰的 SAD 株滅活疫苗等。另外，常州同泰生物藥業(yè)科技有限公司去年正在探索將CVS-11病毒滅活后同SAD病毒液混合后的免疫效果，這也為新型狂犬病滅活疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

狂犬病滅活疫苗常常配合佐劑使用。目前常用的佐劑有鋁膠佐劑、白介素-2（IL-2）、干擾素、PolyIC佐劑、氫氧化鋅(Zn(OH)2)、水包油佐劑等。鋁膠佐劑成本低廉，安全無毒，但只誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，適用于以抗體保護(hù)為主的疾病疫苗，且在注射部位緩慢釋放抗原的效應(yīng)較低，作用較慢，產(chǎn)生的中和抗體較遲。有研究表明，與鋁佐劑疫苗和無佐劑疫苗相比，IL-2佐劑疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的時(shí)間早，抗體滴度高，疫苗具有良好的免疫學(xué)效果。王忠海的研究表明，與無佐劑狂犬病疫苗相比，干擾素佐劑狂犬病疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的時(shí)間早、滴度高，具有良好的免疫學(xué)效果。李茂光等研究顯示PolyIC佐劑狂犬病疫苗可減少抗原用量，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，特別是能產(chǎn)生早期的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而提高傳統(tǒng)狂犬病疫苗的保護(hù)效果。Zn(OH)2是含鋅元素的一種無機(jī)納米粒子，在一定條件下能以膠體的形式穩(wěn)定存在，并具有吸附蛋白抗原的能力。有研究表明，Zn(OH)2作為佐劑與疫苗聯(lián)合應(yīng)用，其致敏原性和安全性優(yōu)于氫氧化鋁。利用水包油作為佐劑時(shí)，需要的抗原量較少，免疫劑量也少，可針對此原理進(jìn)一步對狂犬病滅活疫苗進(jìn)行開發(fā)創(chuàng)新。

（二）弱毒活疫苗 目前我國在犬的狂犬病免疫預(yù)防實(shí)際應(yīng)用最廣泛的仍然是弱毒活疫苗。我國使用的獸用狂犬病弱毒疫苗，從20世紀(jì) 50年代到80年代先后采用了羊腦固定毒減毒苗，Semple型疫苗和Flury-LEP疫苗。隨后，弱毒疫苗所使用的毒株主要為SAD的衍生株，如SAG1和ERA等。ERA疫苗是基于在1935年于美國阿納巴馬的一頭犬身上發(fā)現(xiàn)的狂犬病毒。這一毒株也是后來開發(fā)出來的SAD-B19疫苗的基礎(chǔ)，這一疫苗是為野生動物口服用的，目的是減少自然界狂犬病毒的庫存。SAD-B19毒力不弱，所以后來進(jìn)一步減毒產(chǎn)生了SAG2，為印度改造的狂犬病病毒低毒疫苗，這也是現(xiàn)有的野生動物疫苗餌的主要成分之一。我國在80年代初從國外引進(jìn)了ERA株，通過BHK21細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，對犬的免疫力可達(dá)3年以上。中國藥品生物制品檢定所利用CTN181毒株在BHK21細(xì)胞傳代細(xì)胞上生產(chǎn)疫苗，疫苗免疫原性同F(xiàn)lury-LEP相似，但安全性比Flury-LEP好。長春生物制品研究所研制的αG株原代倉鼠腎細(xì)胞佐劑疫苗，犬免疫接種后，中和抗體至少可保持1年，加強(qiáng)免疫1次，免疫期可持續(xù)2年以上。中國軍事獸醫(yī)研究所、長春生物制品研究所分別從SAD和CTN181株中篩選制備口服疫苗，犬口服后陽轉(zhuǎn)率分別大于或等于97%和80%。

二、新型疫苗

（一）亞單位疫苗Fu等的研究表明，將桿狀病毒表達(dá)的狂犬病病毒糖蛋白經(jīng)口服免疫接種，誘導(dǎo)浣熊產(chǎn)生了中和抗體，并能抵抗狂犬病強(qiáng)毒株的攻擊。除此之外，也曾有學(xué)者利用酵母表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量很大，也可糖基化修飾，但糖基化位置和糖基化的類型會與天然蛋白存在差異，影響了免疫原性；用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病病毒G蛋白和N蛋白，加佐劑對動物進(jìn)行免疫可誘導(dǎo)機(jī)體對狂犬病病毒的細(xì)胞和體液免疫，并抵抗致死劑量狂犬病病毒的攻擊，但哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的亞單位疫苗工藝復(fù)雜、成本高、耗時(shí)長、表達(dá)水平低。因此該兩種方法制備狂犬病病毒亞單位疫苗均受到一定的限制。

（二）DNA疫苗 Xiang Z Q等將編碼狂犬病病毒糖蛋白的cDNA插到SV40啟動子下游構(gòu)建了狂犬病病毒的DNA疫苗，按設(shè)定計(jì)劃免疫小鼠后，誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗狂犬病病毒中和抗體、抗狂犬病病毒糖蛋白特異性CTL和分泌淋巴因子的Th細(xì)胞，用5倍LD50劑量的狂犬病病毒CVS株攻擊小鼠，免疫鼠全部獲得保護(hù)，對照組小鼠14天內(nèi)全部死亡。還有國外學(xué)者將帶有G基因的DNA包被在2.6μm金粒上免疫小鼠，初免及加免后均可在小鼠體內(nèi)檢測到高效價(jià)的抗體，持續(xù)300天。315天后用致死量的狂犬病病毒攻擊，小鼠全部存活。在我國，扈榮良等首先將狂犬病病毒G基因插入PMTOIO/A+表達(dá)載體中，免疫小鼠后體內(nèi)產(chǎn)生的抗狂犬病病毒抗體對狂犬病病毒強(qiáng)毒的攻擊有一定保護(hù)作用。李萍等將狂犬病病毒G基因插入質(zhì)粒PRC/CMV中，免疫小鼠可產(chǎn)生低滴度的中和抗體，對狂犬病病毒強(qiáng)毒攻擊有一定的保護(hù)作用。制備的狂犬病DNA疫苗由于外源目的基因進(jìn)入細(xì)胞，特別是進(jìn)入細(xì)胞核的數(shù)量少，免疫原表達(dá)量少，因此引發(fā)的免疫應(yīng)答經(jīng)常達(dá)不到預(yù)期水平。

（三）重組活載體疫苗

1.痘病毒載體疫苗 學(xué)者對以痘苗病毒為載體的重組活載體疫苗VRG研究的最透徹，使用也最多。痘病毒載體重組疫苗具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如生產(chǎn)簡便、受原料限制較少、熱穩(wěn)定性好、可口服或皮上劃痕免疫，顯示出較大的應(yīng)用潛力。歐洲及北美等地的野生動物以VRG進(jìn)行口服免疫，已取得良好的免疫效果。但痘病毒載體狂犬病疫苗有一定的缺陷，主要表現(xiàn)在機(jī)體針對痘病毒產(chǎn)生的抗體會對相應(yīng)載體疫苗的二次免疫產(chǎn)生一定的影響，降低其免疫效果，且不適合接種與人類密切接觸的動物。為解決這個(gè)問題，開始有學(xué)者構(gòu)建“非復(fù)制痘苗病毒載體”。此類載體在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中降低或失去繁殖能力，卻能有效表達(dá)外源基因，提高病毒疫苗載體的安全性。我國李萍等利用此原理構(gòu)建了非復(fù)制型痘苗病毒載體狂犬病疫苗，免疫小鼠能使其快速產(chǎn)生滴度較高的中和抗體，抵抗致死劑量狂犬病病毒國際標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株（CVS）和中國上海犬流行病毒街毒株（SBD）株的攻擊。但外源基因的表達(dá)量隨著病毒復(fù)制的減弱或消失也往往會降低，這也是限制其發(fā)展的一個(gè)重要原因。

2.腺病毒載體疫苗 Zhou D等構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的黑猩猩腺病毒，可作為口服疫苗為機(jī)體提供黏膜免疫，阻止狂犬病病毒從黏膜感染機(jī)體。由于犬及犬鼬科野生動物是狂犬病病毒的主要宿主，且犬腺病毒的宿主范圍廣泛，毒株穩(wěn)定，因此以犬腺病毒作為載體，構(gòu)建狂犬病重組疫苗的意義更大。程瑋等的研究中，獲得了表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)基因的重組犬2型腺病毒，在犬科動物取得了良好的免疫效果。

3.皰疹病毒載體疫苗 有學(xué)者將狂犬病G蛋白基因重組到犬皰疹病毒TK基因中構(gòu)建出重組病毒并侵染MDCK細(xì)胞，可正確表達(dá)出G蛋白。將此重組犬皰疹病毒經(jīng)鼻腔接種犬后，所產(chǎn)生的抗狂犬病病毒中和抗體的滴度要高于常規(guī)滅活狂犬病疫苗。

4.偽狂犬病毒重組狂犬病疫苗 偽狂犬病毒（PRV）是一種極具開發(fā)潛力的疫苗載體。PRV基因組為線性雙鏈DNA，長度約143kb，遺傳穩(wěn)定性好；并含有許多病毒復(fù)制的非必需基因（TK、gI、gE、gG、PK），外源基因容量大，基因組具有感染性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后即可開始復(fù)制，產(chǎn)生高滴度子代病毒。且PRV具有廣泛的宿主范圍，可以感染豬、犬、牛、羊等多種家畜和野生動物，但不感染人。吉林大學(xué)韓乃君利用Tn5轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的方法，構(gòu)建了一株同時(shí)表達(dá)SRV9糖蛋白和EGFP綠色熒光蛋白的重組偽狂犬病毒rPRV/SRV9G/EGFP，利用該重組病毒對貓進(jìn)行免疫，對重組病毒進(jìn)行生物學(xué)特性和免疫學(xué)試驗(yàn)的研究。研究結(jié)果顯示該重組病毒可以通過肌肉注射和口服免疫兩種途徑誘導(dǎo)受試貓機(jī)體產(chǎn)生針對狂犬病病毒具有保護(hù)水平的中和抗體，初步的安全性評價(jià)也未發(fā)現(xiàn)其對受試貓有毒害作用。從而提示轉(zhuǎn)座方法可以作為一種簡單、有效的技術(shù)應(yīng)用于重組病毒疫苗的開發(fā)中，而得到的重組病毒rPRV/SRV9G/EGFP有作為備選狂犬病口服疫苗的潛力。

三、小結(jié)

近年來我國寵物犬貓以及流浪犬貓的數(shù)量持續(xù)上升，狂犬病流行十分嚴(yán)重，國家及我省對狂犬病的免疫力度不斷加大，對狂犬疫苗的需求也日益增加?？袢缁钜呙缇哂邪踩?、高效的優(yōu)點(diǎn)，但是在應(yīng)用上改進(jìn)空間很大，不能墨守成規(guī)，要不斷對滅活疫苗進(jìn)行探索創(chuàng)新?？袢∪醵疽呙珉m然存在一定的不安全因素，但是可以在野生動物中口服，也適用于流浪犬，值得探討的是，如果安全，為什么目前不能用于人?基因疫苗與重組活載體疫苗仍處于試驗(yàn)探索階段，尚未有在臨床進(jìn)行推廣應(yīng)用的產(chǎn)品。