兩種卵黃抗體不同提取方法的比較試驗(yàn)

林婷婷王全溪

（1.龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)?！「＝垘r　364000；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院　福州　350002）

兩種卵黃抗體不同提取方法的比較試驗(yàn)

林婷婷1王全溪2

（1.龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)校福建龍巖364000；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院福州350002）

卵黃抗體（IgY）具有許多其他類型抗體所沒有的優(yōu)點(diǎn)，其分離純化的方法有有機(jī)物抽提法、鹽析法、水稀釋法等。試驗(yàn)分別用聚乙二醇（PEG）6000和氯仿來提取卵黃抗體，對其收集的抗體量和抗體效價進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：100 g的卵黃用PEG6000法比氯仿法多收集71m L卵黃抗體溶液，且PEG6000法的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于氯仿法，有很好的經(jīng)濟(jì)效益，而PEG6000法提取的卵黃抗體效價比氯仿法略低一個滴度。

卵黃抗體提取 氯仿聚乙二醇6000

卵黃抗體（yolk antibody）是禽類B淋巴細(xì)胞在抗原物質(zhì)刺激下所產(chǎn)生并沉積在卵黃中能與特異抗原結(jié)合的一種免疫球蛋白，稱為IgY［1-2］。現(xiàn)已證明特異性IgY對人及動物的許多疾病具有一定的預(yù)防和治療作用，可用來預(yù)防和治療多種沒有特效藥物的禽類傳染病 （如新城疫、禽流感、禽傳染性法氏囊炎［3］）、初生仔豬和犢牛腹瀉及其他許多疾病，在疾病的免疫檢測和防治方面有突出的應(yīng)用，還可以作為飼料添加劑與蛋白質(zhì)研究素材。

IgY抗體存在于豐富的卵黃脂質(zhì)中，不容易被分離，使得雞蛋作為抗體來源的研究受到限制。近年來，出現(xiàn)了許多提取卵黃蛋白的方法，如有機(jī)物沉淀法使用聚乙二醇與硫酸葡聚糖，有機(jī)溶劑抽提法應(yīng)用氯仿分離IgY，天然膠法，還有中鏈脂肪酸法，用辛酸靜置分層卵黃抗體，還有去污劑分離法，水稀釋法及超臨界氣體提取法等［4］。為了更好地提取卵黃抗體，以發(fā)揮其優(yōu)勢，選用操作比較簡單，材料取得也較容易的氯仿和聚乙二醇6000來提取卵黃抗體，前人的研究也表明，這兩種方法分離卵黃抗體的提取率和純度相對比較大。用氯仿和25%聚乙二醇6000［5］提取卵黃抗體，分別從收集量、抗體效價、消耗與成本等問題作比較研究，以確定一個比較好的提取方法。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器組織搗碎機(jī)；離心機(jī)；V形微量反應(yīng)板；50μL移液管；滴頭。

1.2試驗(yàn)材料免疫雞蛋：由龍巖某雞場提供，經(jīng)常規(guī)新城疫免疫程序免疫母雞所產(chǎn)的蛋；生理鹽水500 mL/瓶；氯仿：分析純500 mL/瓶；聚乙二醇（PEG）6000：分析純500 g/瓶；新城疫抗原：Ⅳ系（Lasota株）疫苗；25%聚乙二醇6000溶液：稱取5 g聚二乙醇6000完全溶于20mL蒸餾水中，備用；1%雞紅細(xì)胞液。

1.3試驗(yàn)方法分別用氯仿和聚乙二醇6000做3次重復(fù)試驗(yàn)。每次試驗(yàn)，取4枚新鮮高免雞蛋用自來水洗去蛋殼表面的污物，再用蒸餾水沖洗兩遍，經(jīng)1%新潔爾滅浸泡消毒后無菌分離卵黃，均勻攪拌分成等量的兩份，以保證同次試驗(yàn)中兩種不同方法提取的卵黃抗體相同。稱重后，兩份卵黃用氯仿法和聚乙二醇法分別提取。

1.3.1氯仿提取法在無菌分離的卵黃中加入2倍量滅菌生理鹽水，用組織搗碎機(jī)攪拌成蛋黃液，測量蛋黃液的量。然后按蛋黃液量的兩倍加入氯仿，充分搖勻，置室溫 1～2 h，3 000 r/min離心抽提 15～20min。無菌收集上清液，得卵黃抗體溶液，測量收集液的量。

1.3.2聚乙二醇6000（PEG6000）沉淀法［6］在無菌分離的卵黃中加入2.5倍量滅菌生理鹽水，攪拌成蛋黃液，測量蛋黃液的量。按蛋黃液量的1/10加入25%PEG6000溶液，8 000 r/min勻漿3min，置4℃冰箱內(nèi)8～12 h。無菌收集下層清液，得卵黃抗體溶液，測量收集液的量。

1.3.3新城疫抗體效價的測定為比較兩種提取方法的效果，通過血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）檢測提取后卵黃抗體中新城疫抗體效價［7］。

2　結(jié)　果

2.1試驗(yàn)結(jié)果觀察氯仿法為有機(jī)溶劑抽提法［4］，通過氯仿進(jìn)行分離，離心后可得三相，上層水層，為卵黃抗體的水溶性組分，中層半固體相為分離出的脂類及脂蛋白，下層為氯仿層。抽取上層清液，即得初步提取的卵黃抗體溶液。聚乙二醇6000法為有機(jī)物沉淀法［4］，上層為黃色蓬松樣固體，蛋白質(zhì)于下層清液，收集得卵黃抗體溶液。氯仿法收集液較為澄清，呈無色，PEG6000法收集液較為渾濁，呈淡黃色。

2.2兩種方法收集量的結(jié)果比較三次重復(fù)試驗(yàn)，測量兩種收集液的量，結(jié)果如下：第一次試驗(yàn)用23 g卵黃，氯仿法得到收集液43mL，25%PEG法得到收集液57mL；第二次試驗(yàn)用23.5 g卵黃，氯仿法得到收集液41 mL，25%PEG法得到收集液60 mL；第三次試驗(yàn)用24 g卵黃，氯仿法得到收集液46 mL，25%PEG法得到收集液63 mL。通過計(jì)算，1 g卵黃用氯仿法平均可提取1.84 mL卵黃抗體液，用25%PEG法平均可提取2.55 mL卵黃抗體液，100 g卵黃用PEG6000法比氯仿法可多收集71 mL卵黃抗體溶液，則氯仿法提取100 mL卵黃抗體液要54 g卵黃，25%PEG提取100 mL卵黃抗體液要39 g卵黃。由結(jié)果所得，PEG法的收集量大于氯仿法（見表1）。

表1　卵黃抗體液收集量的分析

2.3收集液新城疫抗體效價檢測結(jié)果

2.3.1新城疫病毒的血凝價三次試驗(yàn)中，血凝試驗(yàn)使用的是同一抗原，其血凝價為1：256，則1：64為其四個凝集單位。

2.3.2收集液新城疫抗體效價根據(jù)HA試驗(yàn)結(jié)果，1：64為四個凝集單位作固定病毒稀釋卵黃抗體液，每次檢測都做三次重復(fù)，以100%抑制凝集的抗體最大稀釋度為該抗體的滴度，即抗體效價。結(jié)果如下：第一次試驗(yàn)，氯仿法的平均新城疫抗體效價為1：256，25%PEG法的平均新城疫抗體效價為1：128；第二次試驗(yàn)，氯仿法的平均新城疫抗體效價為1：512，25%PEG法的平均新城疫抗體效價為1：256；第三次試驗(yàn)，氯仿法的平均新城疫抗體效價1：256，25%PEG法的平均新城疫抗體效價1：256。氯仿法提取的卵黃抗體中新城疫抗體效價約比25%PEG法高一個滴度。

2.4經(jīng)濟(jì)效益分析氯仿法中，直接加入卵黃液量兩倍的氯仿，消耗大，1份卵黃需要6倍量氯仿。即（1份卵黃+2份生理鹽水）=卵黃液+兩倍卵黃液的氯仿。而PEG法，若換算成卵黃量和PEG固體的比例，則為 （1份卵黃+2.5份生理鹽水）=卵黃液+含10%卵黃液的25%PEG溶液，一份卵黃量只需要7/80份PEG6000固體。

氯仿分析純 （500mL/瓶）的價格為25元/瓶，PEG6000分析純（500 g/瓶）的價格為30元/瓶。生理鹽水 （500mL/瓶）的價格為5元/瓶。以下以提取100mL卵黃抗體液的成本進(jìn)行比較分析。氯仿法提取100 mL卵黃抗體液需54 g卵黃，25%PEG法提取100mL卵黃抗體液需39 g卵黃。則提取100mL卵黃抗體液用氯仿法需要氯仿54×6=324 mL，用25%PEG法需要PEG6000為39×（7/80）=3.4 g。氯仿法藥品的成本為 （324/500）×25=16.2元，25%PEG法藥品的成本為（3.4/500）×30=0.20元。提取100mL卵黃抗體液，用氯仿法所需的生理鹽水量為54×2= 108 mL，用25%PEG法所需的生理鹽水量為39× 2.5=97.5mL。氯仿法生理鹽水的成本為（108/500）× 5=1.08元，25%PEG法生理鹽水的成本為（97.5/500）×5=0.98元。氯仿法的總成本約為17.28元，25%PEG法的總成本約為1.18元（見表2）。

在生產(chǎn)中提取100 L卵黃抗體液，氯仿法的成本約為17 280元，25%PEG法的成本約為1 180元，相差近十五倍，25%PEG法的成本遠(yuǎn)低于氯仿法，有很好的經(jīng)濟(jì)效益。

3　小結(jié)與討論

表2　成本分析表

1）從試驗(yàn)情況來看，氯仿法和聚乙二醇法提取卵黃抗體的操作都相對簡單。1 g卵黃用氯仿法平均可提取約1.84mL卵黃抗體液，用25%PEG法平均可提取約2.55mL卵黃抗體液，則100 g卵黃用PEG6000法比氯仿法多收集71 mL卵黃抗體溶液。100 mL卵黃抗體液用氯仿提取總成本約為17.28元，用25%PEG總成本約為1.18元，25%PEG法的經(jīng)濟(jì)效益遠(yuǎn)大于氯仿法。而25%PEG提取的卵黃抗體液新城疫效價比氯仿提取的低一個滴度。25%PEG法提取的清液較氯仿法渾濁，有較多的雜蛋白，但是初步提取的卵黃抗體都還必須用其他方法進(jìn)一步提純，而PEG法的成本低、收集量大，在工業(yè)生產(chǎn)中還是有很大的優(yōu)點(diǎn)，因此，適合于大規(guī)模生產(chǎn)和使用。

2）兩種提取方法的原理。（1）氯仿法：氯仿是優(yōu)良的有機(jī)氯溶劑，亦稱為三氯甲烷，能迅速溶解脂肪、油脂、樹脂和蠟，為有機(jī)物抽提法。由于卵黃里的脂肪、脂蛋白易溶于有機(jī)溶劑，以生理鹽水稀釋蛋黃，讓其中的IgY能夠溶于水中，通過離心抽提得到IgY水溶性成分于上層清液，中層為密度較輕的脂類脂蛋白及其他蛋白，下層為密度最大的氯仿層。（2）聚乙二醇（PEG）6000法：聚乙二醇（PEG）是非離子型水溶性聚合物［8］，有很強(qiáng)的親水性，其強(qiáng)親水性可以破壞蛋白質(zhì)的水化層。聚乙二醇（PEG）6000就是通過抗體蛋白的親水和疏水性，破壞蛋白質(zhì)的水化層來分離提取卵黃抗體。PEG溶液于水中不發(fā)熱升溫，即使?jié)舛群芨咭膊粫鸬鞍踪|(zhì)變性［8］。25% PEG6000溶液提取卵黃抗體，靜置后可分兩層，上層為黃色蓬松樣固體，下層為卵黃抗體清液。

3）兩種提取方法的比較。（1）工作量與耗時：氯仿法只需攪拌一次蛋黃液，直接加入氯仿后，靜置、離心，在實(shí)驗(yàn)室里，離心方法簡便易操作。PEG法必須配置25%PEG溶液，加入PEG溶液后還需高速勻漿，但不需要離心處理。而其水溶性組分的收集，氯仿法的上層清液收集較PEG法下層液體簡易。氯仿法加入氯仿后需靜置1～2 h，而PEG法需要在4℃條件下放置8～12 h，耗時較長。（2）殘留與毒性：在氯仿法中，三氯甲烷會有一部分殘留在卵黃抗體提取物中。三氯甲烷對哺乳動物可引起DNA損傷，可引起淋巴姐妹染色體發(fā)生變化。三氯甲烷能引起肌肉、骨骼、腸胃系統(tǒng)及顱面部發(fā)育不正常，有高度的胎毒，會引起人的慢性中毒如嘔吐、消化不良、食欲減退、神經(jīng)過敏、失眠抑郁，對人并有致癌作用。有研究表明，氯仿法進(jìn)行卵黃抗體提取，其殘留的氯仿會影響酶標(biāo)板的吸附力，增加了非特異性吸附［9］，不適用于ELISA檢測。PEG作為高親水性聚合物，在卵黃抗體液中也會有殘留。但PEG對于動物是否有毒性，目前尚不詳［8］。

4）試驗(yàn)中，氯仿法加入的生理鹽水量小于PEG6000，而氯仿法收集液的量也小于聚乙二醇法，因此，收集液的多少可能與生理鹽水的加入量有關(guān)。氯仿法提取的卵黃抗體效價略高于聚乙二醇6000法一個單位，這也可能是PEG6000法中加入的生理鹽水量大于氯仿法，降低了抗體的滴度。因此，在卵黃抗體效價比較中，不僅要考慮不同提取藥品對效價的影響，也要考慮其中生理鹽水有可能對效價的影響。試驗(yàn)中采用25%PEG提取的清液較氯仿法渾濁，有較多的雜蛋白，但是初步提取的卵黃抗體都還必須用其他的方法進(jìn)一步提純。氯仿法在制備過程耗時少，上清液中脂類污染極微，卵黃抗體液較為清亮，純度相對較大，但由于其有殘留和毒性，成本又高，在抽提過程中有大量沉淀，不適合連續(xù)離心，因此，適合于實(shí)驗(yàn)室少量制備。

5）在卵黃抗體的生產(chǎn)上，目前還沒有完善的質(zhì)量和管理標(biāo)準(zhǔn)，一些生物制品單位生產(chǎn)的卵黃抗體未進(jìn)一步加以純化，不符合藥品規(guī)范，經(jīng)稀釋后直接用于被動免疫保護(hù)，由于卵黃液中含有大量不飽和脂肪酸和磷脂，極易腐敗變質(zhì)，對動物產(chǎn)生毒性。在這樣的情況下，卵黃抗體的分離、提取、純化就顯得很重要。而我們的目標(biāo)就是通過對卵黃抗體分離提取方法的研究，建立一套完善的藥品規(guī)范與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以更好地發(fā)揮卵黃抗體的作用與優(yōu)勢。

［1］范剛，楊海民，盛東風(fēng)，等.禽卵黃抗體的應(yīng)用與開發(fā)［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005（1）：4-5.

［2］楊漢春.動物免疫學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003（2）：49.

［3］王昕，李然棟，張艷平.抗強(qiáng)毒新城疫、禽流感（H 5、H 9）多價二聯(lián)高免卵黃抗體的研制和應(yīng)用 ［J］.中國動物檢疫，2004，21（5）：28-30.

［4］甄宇紅，徐永平，夏艷秋，等.卵黃抗體分離、提取和純化方法研究進(jìn)展［J］.中國飼料，2003（18）：8-10.

［5］于洪勛.新城疫康復(fù)雞卵黃抗體液的制備［J］.中國獸醫(yī)雜志，2004，40（10）：59.

［6］王進(jìn)榮，楊利國.如何純化卵黃抗體［J］.生物技術(shù)，2000（1）：27-29.

［7］易全茂，謝艷霞.雞卵黃抗體研究進(jìn)展［J］.動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2004（2）：44-45，33.

［8］王洪新，劉學(xué)賢，穆海波，等.雞新城疫卵黃抗體IgY的分離提純研究［J］.中國家禽，2003（19）：11-14.

The com parison trial about two kinds ofmethod in w ithdraw ing the yolk antibody

Lin Tingting1Wang Quanxi2
（1.Longyan agricultural school，F(xiàn)ujian 364000；2.College of animal science，F(xiàn)ujian agriculture and forestry university，F(xiàn)uzhou 350002）

The yolk antibody（IgY）had more advantages thanmany other types of antibody，but itwas difficult to separate and purify. Themethod of separation and purification of IgY were extraction of organic compounds，salt fractionation，water dilution.Chloroform and PEG6000 were used to withdraw yolk antibody respectively in this experiment，then the antibody level of Newcastle Disease was examined.The result showed that themethod of using PEG6000 collected 71mL solution of IgY more than themethod using chloroform from 100 g yolk and the first one which was good and economic benefit cost far less than the other one.The antibody level of IgY by the firstmethod was lower however.

yolk antibody withdrawing chloroform PEG6000

A

1003-4331（2015）03-0003-04