外源抗氧化劑對荔枝酒發(fā)酵的影響研究

張　斌，羅帝洲，鄭　倩，吳湃泳（惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東惠州516007）

外源抗氧化劑對荔枝酒發(fā)酵的影響研究

張斌，羅帝洲，鄭倩，吳湃泳
（惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東惠州516007）

為了解決過量二氧化硫影響果酒品質(zhì)的問題，探索二氧化硫的取代物，考察了添加二氧化硫、抗壞血酸、異抗壞血酸、谷胱甘肽和乙二胺四乙酸（EDTA）對荔枝酒中多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、總糖、總酸、酒精度、雜醇淮和總酯的影響。結(jié)果顯示，添加抗氧化劑有利于抑制酶活、促進香氣物質(zhì)的生成。在抗氧化劑添加量為250 mg/L時，添加異抗壞血酸比添加SO2的酒樣中PPO酶活、POD酶活、總糖分別降低了70.0%、66.7%、79.4%，而酒精度、雜醇淮、總酯分別提高了3.8%、16.5%、61.4%；添加EDTA比添加SO2的酒樣中PPO酶活、POD酶活、總糖分別降低了60.0%、58.3%、75.0%，而酒精度、雜醇淮、總酯分別提高了1.9%、10.8%、57.1%。研究表明，添加異抗壞血酸或乙二胺四乙酸可以部分的取代二氧化硫，有利于提升荔枝酒的品質(zhì)。

荔枝酒；抗氧化劑；多酚氧化酶；過氧化物酶

荔枝酒的氧化褐變嚴重影響荔枝酒的品質(zhì)，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）是引起果酒酶促氧化褐變的關(guān)鍵酶，多酚氧化酶是一種含銅氧化酶，可將多酚氧化為醌，醌類物質(zhì)發(fā)生聚合會產(chǎn)生類黑色素，過氧化物酶（peroxidase，POD）可促進酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀［1-4］。果酒在傳統(tǒng)釀造中允許添加少量的二氧化硫作抗氧化劑、防腐劑和抑菌劑等。中國國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定葡萄酒中二氧化硫最大使用量為250 mg/L，過量的二氧化硫會影響酒的品質(zhì)，會對人體健康造成危害，故探索合適的二氧化硫取代物尤為重要。

通過添加適量抗氧化劑可以抑制果酒的氧化褐變，提高果酒的品質(zhì)。范遠景等［5］研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑的作用要點是降低介質(zhì)含氧量和氧的活化度，延長誘導(dǎo)期的時間，誘導(dǎo)期后加入的抗氧化劑則效果不佳；曹緒章［6］發(fā)現(xiàn)在含金屬離子的溶液中加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）可以明顯加強防腐抑菌能力；SCHNEIDER V［7］研究發(fā)現(xiàn)維生素C及其鈉鹽在添加濃度較低時，其表現(xiàn)出抗氧化性，超過一定量后反而表現(xiàn)出促氧化作用而加速褐變。

本實驗研究了二氧化硫（SO2）、抗壞血酸（vitamin C，VC）、異抗壞血酸（異VC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和EDTA對荔枝酒發(fā)酵的影響，對荔枝酒中的PPO、POD、總糖、總酸、酒精度、雜醇淮和總酯進行檢測分析，探索了取代二氧化硫的可行性。國標(biāo)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定發(fā)酵果酒中抗氧化劑的最大添加量為1 000 mg/L，本實驗通過研究4種抗氧化劑對荔枝酒發(fā)酵的影響，并與二氧化硫的作用效果進行比較，確定可有效取代二氧化硫的物質(zhì)，為果酒行業(yè)降低二氧化硫使用量提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

荔枝冷凍汁：廣東禎州集團有限公司；抗壞血酸、異抗壞血酸、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸、食品級亞硫酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、磷酸緩沖液、乙醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇均為色譜純：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀-5975質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；頂空固相微萃取裝置（聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭100 μm）：美國Supelco公司；UV-7504紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1荔枝果酒發(fā)酵工藝流程

荔枝汁→成分調(diào)整（調(diào)糖、酸）→接種酵母菌（250 mg/L）→添加抗氧化劑（100～300 mg/L）→酒精發(fā)酵→過濾→陳釀→成品

1.3.2雜醇淮的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜條件［8-12］

（1）頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）

在15 mL頂空樣品瓶中添加10 mL白蘭地酒樣，在磁力攪拌器作用下于50℃平衡10 min，將微萃取纖維100 μm的PDMS在250℃老化處理2 h，再于50℃頂空萃取40 min，再在230℃脫附3 min，待檢。

（2）氣相色譜-質(zhì)譜操作條件

氣相色譜條件：DB-1色譜柱（30.0m×0.25mm×0.25μm），柱溫為程序升溫：先45℃保持1 min，再以3℃/min的速度升溫至55℃，保持1 min，再以10℃/min的速度升溫至120℃，保持10 min后再升溫到200℃。進樣口溫度為230℃，載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：電離方式電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，檢測器電壓為350 V，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，以35～335 amu為掃描質(zhì)量范圍。

（3）數(shù)據(jù)處理

以保留時間進行定性，外標(biāo)峰面積法進行定量。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甲醇20.0 mg、丙醇30.0 mg、正丁醇40.0 mg、異丁醇40.0 mg、異戊醇40.0 mg，用體積分數(shù)40%乙醇水溶液溶解并定容至10 mL，混勻，密封后置于冰箱中保存，使用時用體積分數(shù)40%乙醇水溶液稀釋10倍。

1.3.4理化指標(biāo)測定方法

總糖、總酸和酒精度等常規(guī)理化指標(biāo)測定采用國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，總酯測定方法參照國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

1.3.5 PPO活性測定［13］

取荔枝汁在12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。加入1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，1.95 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液，取0.05 mL上清液迅速搖勻，測定波長410 nm處每分鐘的吸光度值變化，以每分鐘△OD410nm變化0.001表示一個酶活力單位（U），酶活性表示為U/mL。

1.3.6 POD活性測定［13］

取荔枝汁在12 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。加入0.1 mL4.0%愈創(chuàng)木酚、0.1 mL0.46%過氧化氫和2.7 mL 0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），取0.1 mL粗酶液迅速搖勻，靜置5～8 min，測定波長470 nm處的吸光度值變化，以每分鐘△OD470nm變化0.01表示一個酶活力單位（U），酶活性表示為U/mL。

2　結(jié)果與分析

2.1 PPO活性分析

各種抗氧化劑對PPO酶活的影響見圖1。

圖1　抗氧化劑對PPO酶活的影響Fig.1 Effect of antioxidant on PPO activity

從圖1可以看出，隨著抗氧化劑添加量的增加，各酒樣的PPO酶活基本呈現(xiàn)降低的趨勢。當(dāng)抗氧化劑添加量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L時，添加異VC比添加SO2的酒樣中PPO酶活分別降低了25.0%、33.3%、72.7%、70.0%和55.6%；添加EDTA比添加SO2的酒樣中PPO酶活分別降低了18.8%、25.9%、63.6%、60.0%和44.4%；添加谷胱甘肽比添加SO2的酒樣中PPO酶活分別降低了9.4%、7.4%、27.3%、15.0%和11.1%。添加VC比添加SO2的酒樣中PPO酶活分別提高了9.4%、11.1%、9.1%、14.0%和22.2%。

幾種物質(zhì)中異VC對PPO酶的抑制性最強，VC與其他抗氧化劑相比效果不明顯，VC及其鈉鹽在果酒中既有抗氧化作用，又有過氧化作用。當(dāng)質(zhì)量濃度較低時，表現(xiàn)出抗氧化性，隨著質(zhì)量濃度的增加，反而表現(xiàn)出促氧化作用而加速果酒褐化。異VC影響酶活性是競爭性地消耗氧，且可使酚類的第一步氧化逆轉(zhuǎn)，即將醌轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酚而延緩氧化的啟動。異VC可以有效抑制荔枝酒中PPO酶活，并在添加量為200 mg/L時達到最大的抑制效果。

2.2 POD活性分析

各種抗氧化劑對POD酶活的影響見圖2。

圖2　抗氧化劑對POD酶活的影響Fig.2 Effect of antioxidant on POD activity

由圖2可知，隨著抗氧化劑添加量的增加，各酒樣的POD酶活基本呈現(xiàn)降低的趨勢。當(dāng)抗氧化劑添加量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L時，添加異VC比添加SO2的酒樣中POD酶活分別降低了29.2%、54.5%、81.3%、66.7%、70.0%；添加EDTA比添加SO2的酒樣中POD酶活分別降低了16.7%、36.4%、62.5%、58.3%、50.0%。金屬離子在價態(tài)發(fā)生變化過程中起傳遞電子的作用，可縮短鏈引發(fā)期的時間，從而加快了氧化褐變速度，EDTA能與金屬形成隋性的絡(luò)合物，抑制了氫過氧化物的分解，抑制自由基生成，從而起到抑制氧化褐變的作用。可見，異VC對POD酶的抑制效果最強，對果酒的抗氧化效果最好，其次是EDTA。

2.3總糖含量分析

添加不同抗氧化劑進行酒精發(fā)酵結(jié)束后所得荔枝酒的總糖含量結(jié)果見圖3。

圖3　抗氧化劑對總糖含量的影響Fig.3 Effect of antioxidant on total sugar content

由圖3可知，隨著抗氧化劑量的增加，總糖含量基本呈現(xiàn)遞減的趨勢。除VC和SO2外，添加抗氧化劑均促進了總糖的減少，例如，當(dāng)抗氧化劑添加量為100mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L時，添加EDTA比添加SO2的酒樣中總糖含量分別降低了51.9%、54.4%、59.4%、75.0%和84.8%；添加異VC比添加SO2的酒樣中總糖含量分別降低了53.8%、56.4%、54.7%、79.4%和85.4%；添加谷胱甘肽比添加SO2的酒樣中總糖含量分別降低了39.4%、37.8%、37.5%、50.0%和65.0%。添加EDTA、異VC和谷胱甘肽均能有效促進總糖的消耗，添加量增加時的促進效果也增加。果酒中總糖尤其是還原糖和氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）間會發(fā)生美拉德反應(yīng)，促進果酒氧化褐變，總糖的消耗可以有效避免果酒的褐變。

2.4總酸含量分析

酸類物質(zhì)是荔枝酒中的重要物質(zhì)，主要含有檸檬酸、蘋果酸和酒石酸等有機酸，可促進多糖和果膠物質(zhì)的分解，加速酒體的澄清，賦予果酒怡悅的鮮爽感等?？寡趸瘎偹岷康挠绊懸妶D4。

圖4　抗氧化劑對總酸含量的影響Fig.4 Effect of antioxidant on total acid content

由圖4可知，總酸含量基本呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，總酸含量變化為8～10 g/L。添加谷胱甘肽與SO2相比，可以在一定程度上抑制酸類物質(zhì)的過量生成，例如，在添加量分別為150mg/L、200mg/L、250mg/L和300mg/L時，添加谷胱甘肽比添加SO2的酒樣中總酸含量分別降低了0.29%、0.81%、2.51%和2.42%?？梢姡入赘孰目梢砸种瓶偹嵘赏?，其他物質(zhì)對總酸的影響不明顯，并會在一定程度上促進總酸的生成。葡萄糖和果糖在酸性條件下容易發(fā)生分解反應(yīng)生成5-羥甲基糠醛，從而引起非酶褐變。

2.5酒精度含量分析

各酒樣的酒精度隨抗氧化劑添加量的變化見圖5。

圖5　抗氧化劑對酒精度的影響Fig.5 Effect of antioxidant on alcohol content

由圖5可知，各酒樣的酒精度隨抗氧化劑添加量的增加基本呈現(xiàn)遞增的趨勢，但添加VC除外，VC對氧有極強的親和力，很容易被氧化成為脫氫抗壞血酸，從而消耗果酒中的溶解氧，酵母菌在前期的繁殖生長過程中需要氧，氧的不足抑制了酵母菌的大量繁殖，從而降低了酵母菌轉(zhuǎn)化酒精的能力。當(dāng)添加量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L時，添加EDTA比添加SO2的酒樣中酒精度分別提高了4.9%、6.0%、2.6%、1.9%、5.5%；添加異VC時分別提高了4.7%、5.6%、2.4%、3.8%、6.2%；添加谷胱甘肽時分別提高了3.0%、3.0%、1.8%、0.87%、3.2%。但是，添加VC量為200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L時，比添加SO2的酒樣中酒精度分別降低了8.9%、7.8%和9.3%。可見，添加異VC的酒精度最高，而添加VC的酒精度最低。添加異VC可有效提高荔枝酒中的酒精得率，促進發(fā)酵。果酒的酒精度越高，越有利于抑制酒體發(fā)生氧化褐變。

2.6雜醇淮含量分析

果酒中的雜醇淮主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇和異戊醇，適量可以增加酒體的厚重感［14-16］。各抗氧化劑對酒樣中雜醇淮含量的影響見圖6。

圖6　抗氧化劑對雜醇淮含量的影響Fig.6 Effect of antioxidant on fusel oil content

由圖6可知，隨著抗氧化劑添加量的增加，雜醇淮含量基本呈現(xiàn)遞增的趨勢，變化區(qū)間在0.20～0.45 g/L，均在合適的范圍之內(nèi)?？寡趸瘎┨砑恿繛?00 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L時，添加EDTA比添加SO2的酒樣中雜醇淮含量分別提高了31.4%、40.8%、15.4%、10.8%和15.3%；添加異VC比添加SO2的酒樣中雜醇淮含量分別提高了35.6%、34.6%、17.5%、16.5%和18.1%。但是，添加VC量分別為100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L時，比添加SO2的酒樣中雜醇淮含量分別降低了6.8%、7.7%、24.6%、20.5%和11.1%。由此可見，添加EDTA或異VC有利于雜醇淮在合適范圍內(nèi)的生成，增加果酒的厚重感。異VC在果酒中因容易被氧化而消耗溶解氧，從而減少了雜醇淮發(fā)生氧化反應(yīng)生成醛和酸的機會；EDTA能與金屬形成隋性的絡(luò)合物，從而減少了金屬作為催化劑催化氧化反應(yīng)和酯化反應(yīng)等發(fā)生的機會，一定程度上抑制了雜醇淮的氧化，使雜醇淮保持在合適范圍內(nèi)。

2.7總酯含量分析

酯類物質(zhì)是荔枝酒中的主要香氣物質(zhì)，酯類的產(chǎn)生主要依賴酵母菌的代謝活動，由酸類物質(zhì)先生成?；o酶A，再與醇類物質(zhì)進行酯化反應(yīng)而生成［17-18］。各酒樣的總酯含量變化結(jié)果見圖7。

圖7　抗氧化劑對總酯含量的影響Fig.7 Effect of antioxidant on total ester content

由圖7可知，總酯含量基本隨抗氧化劑的增加呈現(xiàn)遞增趨勢。在抗氧化劑添加量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L時，添加EDTA比添加SO2的酒樣中總酯含量分別提高了21.2%、51.8%、47.2%、57.1%和59.7%；添加異VC比添加SO2的酒樣中總酯含量分別提高了22.0%、42.9%、37.1%、61.4%和66.7%。由此可見，添加異VC或EDTA有利于荔枝酒中酯類物質(zhì)的生成。在酯化反應(yīng)中，醇作為親核試劑對羧基的羰基進行親核攻擊，在質(zhì)子酸存在時，羰基碳更為缺電子而有利于醇與他發(fā)生親核加成。添加異VC或EDTA可以促進果酒中酸類物質(zhì)的生成，從而對酯化反應(yīng)起到促進作用，提升果酒中酯類物質(zhì)的含量。

3　結(jié)論

荔枝酒發(fā)酵過程中與添加二氧化硫相比，添加EDTA或異VC可促進總糖的消耗及較高的酒精度，有利于雜醇淮在合適范圍內(nèi)的生成及酯類物質(zhì)的合成，但對總酸影響不明顯。異VC對PPO酶和POD酶的抑制性最強，當(dāng)添加量為200mg/L時對PPO酶達到最大的抑制效果。因此，添加EDTA或異VC可以部分的取代二氧化硫，作為荔枝酒發(fā)酵的抗氧化劑。

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Effect of exogenous antioxidant on litchi wine fermentation

ZHANG Bin，LUO Dizhou，ZHENG Qian，WU Paiyong
（Department of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，China）

In order to solve the problem that excess sulfur dioxide influenced the quality of fruit wine，substitute of sulfur dioxide was researched.The effects of glutathione and ethylene diamine tetraacetic acid（EDTA）on polyphenol oxidase（PPO），peroxidase（POD），total sugar，total acid，alcohol content，fusel oil and total ester of litchi wine was investigated.The results showed that antioxidant addition could inhibit enzyme activity and promote the formation of aroma substances.When the antioxidant addition was 250 mg/L，comparing with wine adding SO2，PPO enzyme activity，POD enzyme activity and total sugar of wine adding erythorbic acid reduced by 70.0%，66.7%and 79.4%，respectively，but alcohol content，fusel oil，total ester increased by 3.8%，16.5%and 61.4%，respectively.PPO activity，POD activity and total sugar of wine adding EDTA was reduced by 60.0%，58.3%and 75.0%，respectively，but alcohol content，fusel oil，total ester increased by 1.9%，10.8%and 57.1%，respectively.The study indicated that erythorbic acid or EDTA could partly replace sulfur dioxide for improving litchi wine quality.

litchi wine；antioxidant；polyphenol oxidase；peroxidase

TS262.6

A

0254-5071（2015）11-0131-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.030

2015-09-29

國家自然科學(xué)基金（21376094）；惠州學(xué)院科研基金（hzux1201416）

張斌（1979-），男，講師，博士，主要從事果葡酒釀造和食品綠色加工工作。