枯草芽孢桿菌NKY1145高密度發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

李　達(dá)，牛春華，姜媛媛，王景會(huì)*（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長(zhǎng)春130033）

枯草芽孢桿菌NKY1145高密度發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

李達(dá)，牛春華，姜媛媛，王景會(huì)*
（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長(zhǎng)春130033）

通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌NKY1145發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行發(fā)酵罐5 L、50 L放大培養(yǎng)對(duì)優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證。確定了枯草芽孢桿菌NKY1145搖瓶發(fā)酵罐工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度37℃，初始pH值為7.0，接種量15%，轉(zhuǎn)速250 r/min。在此最佳發(fā)酵條件下，菌液OD600nm值為3.24。在5 L、50 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)條件下，菌液OD600nm值分別為3.18、3.30，驗(yàn)證了枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化組合的穩(wěn)定性，為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的借鑒。

枯草芽孢桿菌NKY1145；高密度發(fā)酵；條件優(yōu)化

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtlis）屬于芽孢桿菌屬的一種，其廣泛分布于土壤及其腐敗的有機(jī)物中，并喜歡在枯草浸泡液中繁殖［1-3］。中國(guó)農(nóng)業(yè)部允許枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑使用，并重點(diǎn)應(yīng)用于微生態(tài)試劑方面。因其無(wú)毒無(wú)殘留和無(wú)污染等特點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景［3-6］。

目前已有一些對(duì)枯草芽孢桿菌益生菌高密度培養(yǎng)的研究報(bào)道，但僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小試水平，沒(méi)有大規(guī)模中試水平的報(bào)道［7-8］。本研究在枯草芽孢桿菌NKY1145高密度培養(yǎng)基研究的基礎(chǔ)上，對(duì)搖瓶高密度生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，并進(jìn)一步采用中試規(guī)模放大培養(yǎng)驗(yàn)證高密度培養(yǎng)工藝條件。為枯草芽孢桿菌NKY1145高密度發(fā)酵的工業(yè)化提供了重要的前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)和工藝條件參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

供試菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NKY1145：由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所保藏提供。

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂均為分析純：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；糖蜜、黃豆粉：市售。

1.1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，糖蜜3%，酵母粉3%，蛋白胨3%，黃豆粉2%，氯化鈉3%，硫酸鎂2%，檸檬酸鈉3%。

1.2儀器與設(shè)備

GUCZ5-50機(jī)械攪拌發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司；MLS-3780高壓滅菌器：日本Sanyo公司；Cary300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1搖瓶發(fā)酵溫度對(duì)微生物OD600nm值的影響［9］

選取22℃、27℃、32℃、37℃、42℃5個(gè)溫度作為搖瓶發(fā)酵溫度，在初始pH 7.0、接種量5%、裝液量150 mL/500 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值。

1.3.2搖瓶初始pH值對(duì)微生物OD600nm值的影響［10］

將培養(yǎng)基的初始pH使用1 molL/L HCl溶液調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在裝液量150 mL/500 mL、接種量5%、溫度37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值。

1.3.3搖瓶接種量對(duì)微生物OD600nm值的影響［11］

選取接種量1%、3%、5%、10%、15%，在初始pH 7.0、裝液量150 mL/500 mL、溫度37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值。

1.3.4搖瓶搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)微生物OD600nm值的影響［12］

選取100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300 r/min 5個(gè)轉(zhuǎn)速，在初始pH 7.0、接種量5%、裝液量150 mL/500 mL、溫度37℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值。

1.3.5搖瓶工藝參數(shù)正交試驗(yàn)優(yōu)化［13］

在搖瓶單因素試驗(yàn)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行工藝參數(shù)（發(fā)酵溫度、接種量、初始pH、轉(zhuǎn)速）4因素3水平正交試驗(yàn)，培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液OD600nm值。

1.3.6 5 L、50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證

在搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行5 L、50 L發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為搖瓶發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)工藝條件，每2 h測(cè)定發(fā)酵液OD600nm值，繪制其生長(zhǎng)曲線。對(duì)比搖瓶、5 L和50 L發(fā)酵生長(zhǎng)曲線，驗(yàn)證優(yōu)化發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)3個(gè)平行，采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵溫度對(duì)微生物活菌量的影響

圖1　不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on the fermentation broth ofB.subtilis

由圖1可知，低溫和高溫對(duì)枯草芽孢桿菌NKY1145生長(zhǎng)都有不同程度的影響，溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì)對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)造成延遲，生物合成量降低等不良現(xiàn)象［14］。在22～37℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，菌種培養(yǎng)液OD600nm值升高，各溫度控制點(diǎn)培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液OD值呈現(xiàn)顯著性差異。在37℃時(shí)OD600nm值最大，該溫度為最適發(fā)酵溫度。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為42℃時(shí)，菌種培養(yǎng)液OD600nm值開(kāi)始略有下降，37℃培養(yǎng)24 h后菌液OD600nm值與42℃培養(yǎng)的菌液OD600nm值相互之間不呈現(xiàn)顯著性差異，考慮到工藝能耗與成本方面，因而枯草芽孢桿菌NKY1145的最適發(fā)酵溫度為37℃左右。

2.2初始pH值對(duì)微生物活菌量的影響

圖2　不同初始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的影響Fig.2 Effect of different initial pH on the fermentation broth of B.subtilis

由圖2可知，在初始pH值為5.5～7.0時(shí)，枯草芽孢桿菌NKY1145發(fā)酵液OD600nm值隨初始pH值的增加而增加，初始pH值為5.5～6.0時(shí)，兩組發(fā)酵液之間OD600nm值不呈顯著性差異，但初始pH值為7.0時(shí)，與其他初始pH組OD600nm值呈現(xiàn)顯著性差異，當(dāng)培養(yǎng)液初始pH值為7.5時(shí)，發(fā)酵液OD600nm值開(kāi)始明顯下降，且與初始pH 7.0組OD600nm值呈現(xiàn)顯著性差異。因此，枯草芽孢桿菌NKY1145最適初始pH值為7.0左右。

2.3接種量對(duì)微生物活菌量的影響

圖3　不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的影響Fig.3 Effect of different inoculum on the fermentation broth of B.subtilis

由圖3可知，在接種量1%～10%時(shí)，隨著接種量的增加，其發(fā)酵菌液OD600nm值升高，接種量＞10%后，枯草芽孢桿菌NKY1145發(fā)酵液OD600nm值開(kāi)始略有下降，但接種量為15%發(fā)酵液OD600nm值與接種量10%發(fā)酵液OD600nm值沒(méi)有呈顯著性差異，從生產(chǎn)成本角度考慮，枯草芽孢桿菌NKY1145的最適接種量為10%。

2.4搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)微生物活菌量的影響

枯草芽孢桿菌NKY1145生長(zhǎng)過(guò)程需要氧氣的參與，通過(guò)改變搖瓶轉(zhuǎn)速可以調(diào)節(jié)發(fā)酵液中含氧量。搖瓶轉(zhuǎn)速過(guò)低，發(fā)酵液中含氧量小，不利于菌體生長(zhǎng)，搖瓶轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，產(chǎn)生的剪切力對(duì)菌體破壞，不利于菌體生長(zhǎng)［15-16］。由圖4可知，轉(zhuǎn)速在100～250 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的提高，發(fā)酵液OD600nm值升高，轉(zhuǎn)速達(dá)到250 r/min時(shí)，發(fā)酵液OD600nm達(dá)到最高。轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，發(fā)酵液OD600nm值開(kāi)始下降，但與轉(zhuǎn)速250 r/min組發(fā)酵液OD600nm值沒(méi)有呈現(xiàn)顯著性差異。從生產(chǎn)工藝、能耗及其高轉(zhuǎn)速對(duì)設(shè)備磨損角度，枯草芽孢桿菌NKY1145的最適搖瓶轉(zhuǎn)速為250 r/min。

圖4　不同搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的影響Fig.4 Effect of different shake flash rotation speed on the fermentation broth ofB.subtilis

2.5搖瓶工藝參數(shù)正交試驗(yàn)優(yōu)化

在搖瓶單因素發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化基礎(chǔ)上，進(jìn)行工藝參數(shù)正交試驗(yàn)，確定枯草芽孢桿菌NKY1145搖瓶發(fā)酵工藝最佳組合。

表1　搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization in shake flask

由表1可知，搖瓶發(fā)酵工藝各因素對(duì)結(jié)果的影響順序?yàn)镈＞A＞B＞C，即轉(zhuǎn)速＞發(fā)酵溫度＞初始pH值＞接種量。搖瓶發(fā)酵工藝最佳組合為A2B2C3D2，即發(fā)酵溫度37℃，初始pH值為7.0，接種量15%，轉(zhuǎn)速250 r/min。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，OD600nm值為3.24。

2.6 5 L、50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化工藝

圖55　 L與50 L發(fā)酵罐工藝參數(shù)驗(yàn)證Fig.5 Validation of process parameters for 5 L and 50 L fermenter

在搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模（5 L、50 L發(fā)酵罐），驗(yàn)證工藝參數(shù)組合穩(wěn)定性。由圖5可知，枯草芽孢桿菌NKY1145在5 L發(fā)酵罐菌株生長(zhǎng)曲線與50 L發(fā)酵罐菌株生長(zhǎng)曲線發(fā)酵周期基本一致，5 L、50 L發(fā)酵罐發(fā)酵18 h后OD600nm值達(dá)到最高值分別為3.18和3.30，與搖瓶發(fā)酵結(jié)果OD600nm值3.24基本相符，從而驗(yàn)證了搖瓶發(fā)酵罐工藝參數(shù)優(yōu)化組合在5 L和50 L發(fā)酵罐中的穩(wěn)定性。

3　結(jié)論

通過(guò)搖瓶單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定了枯草芽孢桿菌NKY1145發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度37℃，初始pH值為7.0，接種量15%，轉(zhuǎn)速250r/min。在搖瓶發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過(guò)5 L、50 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，得到發(fā)酵液OD600nm值基本與搖瓶發(fā)酵液OD600nm相符合，驗(yàn)證了高密度發(fā)酵工藝在5 L、50 L規(guī)模生產(chǎn)條件下的穩(wěn)定性，為下一步產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌NKY1145提供了良好的前期基礎(chǔ)。

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Optimization of high density fermentation conditions ofBacillus subtlisNKY1145

LI Da，NIU Chunhua，JIANG Yuanyuan，WANG Jinghui*
（Institute of Agro-Food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China）

The fermentation conditions ofBacillus subtilisNKY1145 were optimized by single factor experiments and orthogonal experiments and the optimal conditions were verified by 5 L and 50 L fermenter enlarge cultivations.The optimal conditions of shake flash cultivation ofB.subtilis NKY1145 were temperature 37℃，pH 7.0，inoculum 15%，rotation speed 250 r/min.Under this condition，OD600nmof fermentation liquid was 3.24.In the 5 L and 50 L fermenter enlarge cultivations，OD600nmof fermentation liquid was 3.18 and 3.30.The stability of the optimal fermentation conditions were indicated，which provided a powerful reference for later industrialized production.

Bacillus subtlisNKY1145；high density fermentation；conditions optimization

TS201.3

A

0254-5071（2015）11-0075-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.017

2015-09-21

吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（200150204080NY）；吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（ZYCX201315）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃（20150307019NY）

李達(dá)（1980-），男，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工工作。

王景會(huì)（1976-），女，研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工工作。