雙酶法水解辣椒粕蛋白的工藝研究

趙　靜，王　燕*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

雙酶法水解辣椒粕蛋白的工藝研究

趙靜，王燕*
（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

以水解度和肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的工藝條件，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)對(duì)此工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的最佳工藝條件為：復(fù)合蛋白酶/風(fēng)味酶質(zhì)量比為2∶1，總酶用量為2%，酶解時(shí)間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。

辣椒粕；蛋白酶；酶解

紅辣椒經(jīng)過提取得到辣椒紅色素和辣椒素，其質(zhì)量只占辣椒總質(zhì)量的7%～10%，殘余物辣椒粕占質(zhì)量的90%～93%，辣椒粕中含有蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、維生素及多種礦物質(zhì)元素，纖維素含量高達(dá)23.84%，蛋白質(zhì)含量可達(dá)14%～19%［1］。目前，對(duì)辣椒蛋白的研究較少且主要集中在辣椒籽蛋白的研究。胡志輝等［2］對(duì)辣椒種子貯藏蛋白質(zhì)的組成及含量進(jìn)行了研究。寧娜［3］測(cè)定了9中辣椒籽的蛋白質(zhì)組成，結(jié)果表明，氨基酸種類齊全，谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸含量豐富。而在辣椒粕的研究方面，則主要針對(duì)飼料添加劑量進(jìn)行研究，田宗祥等［4］在60～90 kg豬的飼料中添加2.5%去籽辣椒粕，可使屠宰率提高1.60%，同時(shí)添加辣椒粕組與未添加辣椒粕空白組對(duì)比，可明顯改善豬肉品質(zhì)，肉香味變濃，增強(qiáng)肌肉的多汁性，提高保水力。趙國群等［5］以辣椒粕水浸提液作為培養(yǎng)基，對(duì)4種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，篩選出適宜以辣椒粕為原料生產(chǎn)細(xì)胞蛋白的優(yōu)良菌種，為充分利用辣椒粕這一資源奠定基礎(chǔ)。

近年來，全世界對(duì)蛋白資源作了較多深入的研究。水解植物蛋白是眾所周知的調(diào)味產(chǎn)品。到目前為止，玉米蛋白［6］、花生蛋白［7］、菜籽蛋白［8］、米糠蛋白［9］、豆粕蛋白［10］、南瓜籽粕蛋白［11］等酶解產(chǎn)物中相繼被發(fā)現(xiàn)含有獨(dú)特生理活性的功能肽抑或是風(fēng)味增強(qiáng)肽，其中大豆多肽、玉米多肽等成功進(jìn)行了產(chǎn)業(yè)化。但在實(shí)際應(yīng)用中就如何綜合利用辣椒粕蛋白的研究和報(bào)道均較少。為了充分利用好這些蛋白質(zhì)資源，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解是十分必要的。植物蛋白水解率一般較動(dòng)物蛋白低，采用單酶水解較難獲得足夠短肽。復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味酶的適宜pH和溫度范圍較為接近，水解位點(diǎn)也具有一定互補(bǔ)性，因此生產(chǎn)和研究中兩者多復(fù)配使用。

本研究以實(shí)驗(yàn)室自制的辣椒粕蛋白為底物，以水解度和肽得率為考察指標(biāo)，研究了復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶雙向酶解辣椒粕蛋白制備多肽的工藝條件，以期為辣椒粕蛋白的高值化利用提供新的理論依據(jù)，同時(shí)為實(shí)際生產(chǎn)中利用可控酶解技術(shù)水解植物蛋白制備鮮味肽奠定了工藝基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

辣椒粕：山東中椒英潮辣業(yè)發(fā)展有限公司；辣椒粕蛋白為實(shí)驗(yàn)室自制（蛋白質(zhì)含量約為59.14%）：復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、風(fēng)味酶（200 U/mg）：上?？笊锛夹g(shù)有限公司；氫氧化鈉、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、鹽酸、硼砂、甲醛、無水硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼酸等化學(xué)試劑均為分析純：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；D45 mm透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 u）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；AUY220型分析天平：日本島津公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KDN-103F型定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)TDZ5型離心機(jī)：湖南赫西裝備儀器有限公司；GL-3250B磁力攪拌器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FD-1B冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1辣椒粕蛋白制備多肽的工藝流程

辣椒粕→粉碎→過100目篩→超聲輔助堿溶酸沉法提?。弦罕?∶20（g∶mL），溫度50℃，時(shí)間4 h，超聲功率250 W）→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→收集上清液→酸沉（稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.6）→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→收集沉淀→經(jīng)透析袋脫鹽（截留分子質(zhì)量8000～14000u）→冷凍干燥（溫度-50℃，時(shí)間10 h）→辣椒粕蛋白→酶解（復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶水解辣椒粕蛋白）→滅酶（沸水浴中保持5 min）→自然冷卻→離心分離（3 000 r/min離心15 min）→取上清液→辣椒粕蛋白多肽液

1.3.2復(fù)配酶雙向酶解的單因素試驗(yàn)

復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶比例：總酶用量2%（相對(duì)于辣椒粕蛋白的質(zhì)量），酶解pH 6.5，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃時(shí)，考察復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1（g∶g））對(duì)辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

總酶用量：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比2∶1，酶解pH值6.5，酶解時(shí)間5h，酶解溫度50℃時(shí)，考察總酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對(duì)辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解時(shí)間：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比2∶1，總酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解溫度50℃時(shí)，考察酶解時(shí)間（4h、5h、6 h、7 h、8 h）對(duì)辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解pH值：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比2∶1，總酶用量2%，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50℃時(shí)，考察酶解pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對(duì)辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

酶解溫度：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比2∶1，總酶用量2%，酶解pH值6.5，酶解時(shí)間5 h時(shí)，考察酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）對(duì)辣椒粕蛋白酶解效果的影響。

1.3.3復(fù)配酶雙向酶解的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將固液比固定為1∶10（g∶mL），固定總酶用量2%，以水解度和肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，作復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比、酶解時(shí)間、酶解pH值、酶解溫度的4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　辣椒粕蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

1.3.4辣椒粕蛋白酶解液的水解度及肽得率的測(cè)定

水解度是衡量蛋白質(zhì)水解的重要指標(biāo)之一，水解度越大，表明蛋白質(zhì)水解越徹底，游離氨基酸的含量越高［12］。在蛋白酶解過程中，由于酶作用程度的不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解程度不同，從而使得蛋白水解物中氨基酸和肽的含量存在一定的差異。當(dāng)?shù)鞍酌附猱a(chǎn)物中氮的存在形態(tài)主要是以肽基氮形式存在時(shí)，肽得率將提高，酶解液會(huì)呈現(xiàn)良好的風(fēng)味和口感。按照凱氏定氮法測(cè)定總氮（total nitrogen，TN）甲醛電位滴定法［13］測(cè)定酶解液中游離氨基酸態(tài)氮（amino nitrogen，AN）。水解度及肽得率［14］的計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比對(duì)辣椒粕蛋白酶解的影響

圖1　復(fù)合蛋白酶/風(fēng)味酶對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.1 Effect of mass ratio of protamex to flavorzyme on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖1可知，隨著復(fù)合蛋白酶所占比例的增加，水解度呈先上升后下降趨勢(shì)，肽得率也緩慢升高，當(dāng)復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，水解度為20.04%，肽得率為6.42%，且均達(dá)到最大值。這是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶屬于非特異性蛋白質(zhì)肽鍵內(nèi)切酶，辣椒粕蛋白在其作用下快速水解，生成游離氨基酸和小分子肽。同時(shí)，辣椒粕蛋白經(jīng)酶解后其疏水性氨基酸殘基暴露出來，得到的酶解液將會(huì)帶有明顯苦味；而風(fēng)味酶是經(jīng)深層發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶和肽酶的復(fù)合物，含有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性，可以有效地將疏水性氨基酸從脯氨酸末端切除，有助于酶解形成良好風(fēng)味［15］。因此，綜合這兩種酶的作用效果及酶的價(jià)格，選擇復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比為2∶1。

2.1.2總酶用量對(duì)辣椒粕蛋白酶解的影響

圖2　總酶用量對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.2 Effect of total enzyme addition on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖2可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率隨著酶用量的增多先升高后降低。這是由于添加一定量的蛋白酶，其活性位點(diǎn)與底物充分接觸，酶解效果較好，繼續(xù)加酶，肽在繼續(xù)酶解的過程中將會(huì)降解為游離氨基酸，肽得率降低。所以，綜合酶解效果和酶的價(jià)格，選擇總酶用量為2%。

2.1.3酶解時(shí)間對(duì)辣椒粕蛋白酶解的影響

圖3　酶解時(shí)間對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和肽得率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在水解初期，水解程度快速增加；在酶解時(shí)間5 h時(shí)，水解度為20.02%，而肽得率達(dá)到最大值6.43%；在酶解時(shí)間6h時(shí)，水解度達(dá)到最大值20.50%，肽得率相對(duì)較高即為6.39%，之后便顯著降低。這可能是由于在一定時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)得到充分的酶解，且都以小肽形式存在，故肽得率較高；繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解液體系內(nèi)的產(chǎn)物增加到一定濃度，反而對(duì)酶的活力產(chǎn)生抑制作用，使肽得率下降［16］。因此確定復(fù)配酶雙向酶解時(shí)間為5 h。

2.1.4酶解pH值對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響

圖4　酶解pH值對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the hydrolysis of hot pepper residues protein

從圖4可知，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率隨酶解pH值的增大先升高，后降低。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，水解度達(dá)到最大值21.66%，肽得率較低；當(dāng)pH值為6.5時(shí)，水解度相對(duì)較高，肽得率達(dá)到最大值6.47%。究其原因，可能是由于中性的復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶以2∶1復(fù)配時(shí)，在中性至微酸性條件對(duì)辣椒粕蛋白有較好的水解效果。故確定酶解pH值為6.5。

2.1.5酶解溫度對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響

圖5　酶解溫度對(duì)辣椒粕分離蛋白酶解的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of hot pepper residues protein

由圖5可知，當(dāng)酶解溫度在40～50℃時(shí)，辣椒粕蛋白酶解液的水解度和肽得率顯著升高；隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，水解度和肽得率急劇降低。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，酶與底物之間的接觸機(jī)會(huì)增多，水解度增大，肽得率升高；繼續(xù)升高溫度，蛋白酶喪失活性，酶解效果下降［16-17］。因此，選擇復(fù)配酶雙向酶解溫度為50℃。

2.2辣椒粕蛋白酶解條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定總酶用量為2%，以水解度和肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比、酶解時(shí)間、酶解pH值、酶解溫度對(duì)結(jié)果的影響。辣椒粕蛋白酶解正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響水解度的因素主次關(guān)系是C＞B＞A＞D，即酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶的復(fù)配比＞酶解溫度。水解度最高的酶解最佳工藝組合為A3B3C1D2；而以肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響肽得率的因素主次關(guān)系是A＞C＞B＞D，即酶的復(fù)配比＞酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。肽得率最高的酶解工藝組合為A2B3C2D2。

由表3可知，因素A、B、C對(duì)水解度影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），因素D對(duì)水解度影響達(dá)到顯著水平（0.01＜P＜0.05）；因素A、C對(duì)肽得率影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），因素B、D在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)對(duì)肽得率幾乎沒有顯著影響。

表2　辣椒粕蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization of hot pepper residues protein

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3最優(yōu)組合驗(yàn)證試驗(yàn)

由于理論最優(yōu)水平組合A3B3C1D2或A2B3C2D2均未出現(xiàn)在試驗(yàn)方案中，故應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即組合A3B3C1D2酶解條件為：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比為3∶1，總酶用量為2%，酶解時(shí)間為6 h，酶解pH值為6.0，酶解溫度為50℃進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測(cè)得酶解液的水解度為19.31%，肽得率為6.41%。組合A2B3C2D2酶解條件為：復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比為2∶1，總酶用量為2%，酶解時(shí)間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃進(jìn)行酶解試驗(yàn)，測(cè)得酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)比較得出，最優(yōu)的水平組合為A2B3C2D2。

3　結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)確定了復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶雙向酶解辣椒粕蛋白的最佳工藝條件為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶的質(zhì)量比為2∶1（g∶g），總酶用量為2%，酶解時(shí)間為6 h，酶解pH值為6.5，酶解溫度為50℃。在此條件下得到的辣椒粕蛋白酶解液的水解度為19.44%，肽得率為6.52%。因此，酶解是一條優(yōu)化辣椒粕蛋白的途徑，研究結(jié)果為酶解辣椒粕蛋白制備呈味肽或抗氧化肽等提供了理論依據(jù)，今后還將對(duì)不同酶制劑組合復(fù)配水解植物蛋白（hydrolyzed vegetable protein，HVP）生產(chǎn)增味香精提供參考，以期達(dá)到低值植物蛋白的高值化利用，對(duì)蛋白質(zhì)的精深加工具有重要的指導(dǎo)意義。

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Technology of hot pepper residues protein hydrolysis by double enzymes

ZHAO Jing，WANG Yan*
（College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

With hydrolysis degree and peptide yield as evaluation index，the hot pepper residues protein was hydrolyzed by double enzymes（protamex and flavorzyme）method and its hydrolysis technology was researched.On the base of single factor experiments，the hydrolysis technology was optimized by orthogonal experiment.The results showed that the optimum hydrolysis technology conditions were as follows：protamex and flavorzyme mass ratio 2∶1，total enzyme addition 2%，hydrolysis time 6 h，pH 6.5，hydrolysis temperature 50℃.Under this condition，the hydrolysis degree was 19.44%，the peptide yield was 6.52%.

hot pepper residues；protease；enzymatic hydrolysis

X705

A

0254-5071（2015）11-0066-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.015

2015-10-10

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：13A040）

趙靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。

王燕（1968-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。