幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因克隆、表達(dá)與純化

李美玉，曹洪玉，張慶芳，王曉輝*（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622）

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因克隆、表達(dá)與純化

李美玉，曹洪玉，張慶芳，王曉輝*
（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622）

該研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法從假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonassp.）DL-6菌株中成功克隆了幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因。PCR測(cè)序結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)1 596 bp，編碼531個(gè)氨基酸，其理論分子質(zhì)量為58.517 ku，等電點(diǎn)（pI）4.35，命名為CBP58（Gen-Bank登錄號(hào)KF234016）。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，該蛋白包括1個(gè)33家族碳水化合物結(jié)合模塊（CBM），2個(gè)類型3幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChtBDs）；用Insight II 2005軟件以同源建模的方法構(gòu)建CBP58蛋白CBM33結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型，Ramachandram圖譜檢測(cè)和三維結(jié)構(gòu)評(píng)估顯示模型結(jié)構(gòu)合理，整體相容性較為可信；將CBP58基因構(gòu)建到pET23b載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)；利用鎳柱親和層析純化獲得重組蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)顯示目的蛋白可溶表達(dá)，為后期幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（CBP）的生化性質(zhì)表征奠定理論基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白；假交替單胞菌DL-6；克?。槐磉_(dá)；純化

幾丁質(zhì)（chitin）是海洋環(huán)境中含量最豐富，自然界中僅次于纖維素的第二大可再生的生物質(zhì)來(lái)源［1］。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物為高附加值的幾丁寡糖（chitin oligosaccharides），其具有良好的生物相容性、生物降解性，而且還表現(xiàn)出調(diào)節(jié)免疫力、抗菌、抗腫瘤、誘導(dǎo)植物抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等生物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)等眾多領(lǐng)域［2］。開發(fā)利用海洋環(huán)境含量豐富的可再生資源幾丁質(zhì)，對(duì)于解決目前面臨的資源、環(huán)境和能源危機(jī)具有重大意義［3］。微生物降解幾丁質(zhì)主要是通過(guò)糖苷水解酶系［4］來(lái)完成，即幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（chitin-binding proteins，CBP）分散幾丁質(zhì)糖鏈，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶隨機(jī)切割多糖鏈，外切幾丁質(zhì)酶沿糖鏈末端降解幾丁質(zhì)（見圖1）［2］，生成的幾丁寡糖在β-N-乙酰己糖胺酶或殼二糖酶作用下生成單糖。

幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白是能與幾丁質(zhì)特異結(jié)合的一類蛋白質(zhì)［3］。CBP在幾丁質(zhì)酶系中單獨(dú)存在、僅具有幾丁質(zhì)結(jié)合域、不具有酶催化活性。CBP不但可以結(jié)合幾丁質(zhì)，使其結(jié)構(gòu)變松散，還可以增強(qiáng)酶活性，大大提高降解效率，既節(jié)省資源，又綠色環(huán)保，具有很高的應(yīng)用價(jià)值［4］。此外，由于幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白具有結(jié)合單糖和多糖底物的能力，從而賦予相應(yīng)蛋白殺菌，抗真菌活性［5-6］。CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)氨基酸序列相似性，將幾丁質(zhì)結(jié)合域歸為碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules，CBM）第1、2、5、6、12、13、14、16、18、19、50、54和55家族。不具有酶催化活性、僅具有幾丁質(zhì)結(jié)合域、獨(dú)立存在的CBP屬于第14、18和33家族。2010年，VAAJE-KOLSTAD G等［7］首次報(bào)道CBP21具有依賴銅離子溶解性多糖單加氧酶（copper-dependent lytic polysaccharide monooxygenase，LMPO）活性，通過(guò)氧化作用斷裂幾丁質(zhì)的糖苷鍵，生成氧化的糖鏈末端和新的非還原糖鏈端，使得結(jié)晶底物的結(jié)構(gòu)趨于松散，為之后糖苷水解酶的進(jìn)一步作用提供基礎(chǔ)。本研究擬釣取幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因，構(gòu)建其pET系列的原核表達(dá)載體，成功表達(dá)并純化獲得大量可溶的表達(dá)蛋白，為今后研究其底物結(jié)合、協(xié)同降解，以及單氧酶功能等奠定理論基礎(chǔ)。

圖1　粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶降解系統(tǒng)圖［2］Fig.1 Degradation system diagram ofSerratia marcescenschitinase

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株、質(zhì)粒與引物

假交替單胞菌（Pseudoalteromonassp.DL-6）：中國(guó)遼寧大連渤海海域近海底泥6～100 m；E.coliTop 10菌株：實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMDTM19-T Vector Cloning Kit：寶生物工程（大連）有限公司［4］；表達(dá)載體pET23b購(gòu)自Novagen公司；引物合成和基因測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本實(shí)驗(yàn)所用的引物見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCl 10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：向LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入2%瓊脂。

LA培養(yǎng)基：LB液體或固體培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL氨芐青霉素。

1.1.3化學(xué)試劑

DNA限制性內(nèi)切酶：美國(guó)Amresco公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、T4連接酶：寶生物工程（大連）有限公司；BM5000 DNA Marker：北京博邁德基因技術(shù)有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）、氨芐青霉素、二硫蘇糖醇、苯甲基磺酰氟：生工生物工程（上海）有限公司；預(yù)染蛋白Marler PageRuler Prestained Protein Ladder：美國(guó)Thermo公司；鎳柱（Ni2+-NTA）：美國(guó)Novagen公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TC-25/HPCR儀：美國(guó)ThermoHybaid公司；BOT-860SR紫外凝膠-顯微成像儀和掃描儀：上海復(fù)日生物技術(shù)研究所研制；PowerPac 300蛋白電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Centrifuge 20PR-52D臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；MilliQ plus超純水系統(tǒng)：美國(guó)MILLIPORE公司；50 mL超濾離心管（3 ku）：生工生物工程（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1CBP58基因的克隆

從平板上挑取菌株P(guān)seudoalteromonassp.DL-6單菌落，接種于50mL種子培養(yǎng)基，20℃、150r/min振蕩培養(yǎng)20h，12 000 r/min離心10 min收集菌體，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物如下：上游引物（5′-ATGGCATCAATTAAACTTAAC-3′）；下游引物（5′-TTAMAGTKTKKTCCATACATYGGCTTG-3′）。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)條件為：94℃、2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃、30 s，55℃、30 s，68℃、7 min，30個(gè)循環(huán)；68℃、15 min，1個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物大小正確的克隆送生工（上海）生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2CBP58基因生物信息學(xué)分析

采用Vector NTI Suite軟件進(jìn)行開放閱讀框（open reading frames，ORF）分析。序列的同源分析通過(guò)NCBI上的本地序列基本搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）完成。采用在線的簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具（simple modular architecture research tool，SMART）進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)域分析。采用Align X軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)。

1.3.3同源模建

將CBP58蛋白的CBM33結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列導(dǎo)入Insight II 2005軟件中BLAST Search（DS Server）模塊，搜索PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇同源模建的蛋白。根據(jù)搜索結(jié)果得到與CBP58同源性最高的晶體結(jié)構(gòu)4GBO（來(lái)源菌株褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的E7）構(gòu)建目標(biāo)蛋白的空間結(jié)構(gòu)。利用Insight II 2005平臺(tái)同源建模，Ramachandran plot和Verify-3D評(píng)價(jià)模型。

1.3.4CBP58表達(dá)與純化

CBP58基因（去除信號(hào)肽）和原核表達(dá)載體pET23b（+）的PCR產(chǎn)物經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET23b-CBP58，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliTop 10中。雙酶切鑒定正確的陽(yáng)性克隆接入含氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14 h。按1%的接種量接種到含氨芐的LB培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600nm值達(dá)到0.6～0.8左右，加入0.2 mmol/L的IPTG，16℃、100 r/min低溫誘導(dǎo)6h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，4℃、5 000×g離心5 min，收集菌體，用10 mL，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl（pH 8.0）洗滌菌體3次。最后用10mL含1mmol/L二硫蘇糖醇，1mmol/L苯甲基磺酰氟，20 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L NaCl（pH 8.0）的緩沖液重懸菌體。離心管置于冰上超聲（400 W）破碎3次，每次30 s，每次間隔1 min。4℃、8 000×g離心20min，收集上清液，即為粗蛋白。粗蛋白用鎳柱（Ni2+-NTA）進(jìn)行親和層析純化，洗脫蛋白液轉(zhuǎn)至超濾管（3 ku）濃縮后于50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中4℃保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠方?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）［15］檢測(cè)，其中濃縮膠含量5%，分離膠含量12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。預(yù)染蛋白Marker用于SDS-PAGE。

1.3.5蛋白質(zhì)含量測(cè)定

蛋白含量通過(guò)Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1CBP58全長(zhǎng)基因的克隆

圖2　CBP58基因保守區(qū)片段的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of the conserved region fragment ofCBP58

以Pseudoalteromonassp.DL-6菌株基因組DNA為模板，利用引物CBP58-F和CBP58-R，擴(kuò)增出一條大小約為1 509 bp的DNA條帶（見圖2），與預(yù)計(jì)片段大小相近。PCR產(chǎn)物測(cè)序表明該基因序列全長(zhǎng)1 596 bp，編碼531個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.35，理論分子質(zhì)量為58.517 ku，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小命名為CBP58。該基因提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KF234016。SMART數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)域分析顯示，CBP58的N端1-29位氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，30-228位氨基酸構(gòu)成幾丁質(zhì)結(jié)合3區(qū)域（chitin_bind_3，CBM33），441-483位和489-531位氨基酸構(gòu)成類型3幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChtBD3），即CBP58為多結(jié)構(gòu)域的33家族幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。

2.2CBP58基因生物信息學(xué)分析

為分析CBP58基因的保守氨基酸殘基信息，利用Align X生物信息學(xué)軟件將編碼氨基酸序列與已知晶體結(jié)構(gòu)或研究較透徹的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。所選序列包括粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）CBP21（PDB：2BEM_A），解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CBP33（PDB：2YOW_A），糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CBP33（PDB：4A02_A），乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）LICBP33A，橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis）CHB1，天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）CBP33（PDB：4OY7_A）和褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）E7（PDB：4GBO_A）。GUSTAN V K等［8-9］解析了Serratia marcescens菌株CBP21晶體結(jié)構(gòu)，并通過(guò)定點(diǎn)突變驗(yàn)證了發(fā)揮幾丁質(zhì)結(jié)合活性的關(guān)鍵氨基酸（酪氨酸Tyr54、谷氨酸Glu55、谷氨酸Glu60、組氨酸His114、天冬氨酸Asp182和天冬酰胺Asn185），在幾丁質(zhì)結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

圖3　細(xì)菌幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBM33結(jié)構(gòu)域的氨基酸多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of the bacteria chitin bindingprotein CBM33 domain

由圖3可知，CBP58中的CBM33結(jié)構(gòu)域中存在2個(gè)高度保守氨基酸（組氨酸His144和天冬氨酸Asp215），其他4個(gè)被谷氨酰胺Gln77、丙氨酸Ala78、酪氨酸Tyr85和谷氨酸Glu219取代，推測(cè)這些氨基酸在CBP58與底物結(jié)合中發(fā)揮關(guān)鍵作用。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本研究CBP58具有CBP21發(fā)揮氧化酶作用的2個(gè)高度保守的活性組氨酸（His30和His144）［10-12］。此外，CBP58還包含CBP21中3個(gè)保守的芳香族氨基酸簇酪氨酸Tyr138、色氨酸Trp149、色氨酸Trp211，早期報(bào)道該保守區(qū)直接位于銅離子結(jié)合位點(diǎn)的下方，推測(cè)其在電子傳遞過(guò)程［12-13］中發(fā)揮作用。本研究的CBP58蛋白不僅具有CBM33結(jié)構(gòu)域，還包含兩個(gè)ChtBD結(jié)構(gòu)域，這在已報(bào)道的CBP結(jié)構(gòu)域中較少見，由此表明CBP58為CBM33家族一名新成員。

應(yīng)用Insight II 2005軟件同源建模幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP58的CBM33結(jié)構(gòu)域。同源比對(duì)分析，系統(tǒng)以褐色嗜熱裂孢菌E7的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：4GBO_A）為模板生成CBM33結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)模型。模型的拉曼圖譜（Ramachandran plot evaluation）分析和評(píng)估評(píng)分（Profile-3D）都表明建?？尚藕侠?。由圖4可知，CBP58與第一個(gè)晶體解析來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌33家族幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21結(jié)構(gòu)類似，該結(jié)構(gòu)為一個(gè)“芽”狀纖連蛋白III型褶皺，即3個(gè)短的α螺旋組成一個(gè)65個(gè)氨基酸的“芽”位于β-折疊“三明治”構(gòu)象的β1和β2之間。比對(duì)發(fā)現(xiàn)CBP58蛋白結(jié)合底物的保守氨基酸（谷氨酰胺Gln77、丙氨酸Ala78、酪氨酸Tyr85、組氨酸His144、天冬氨酸Asp215和谷氨酸Glu219）位于蛋白表面，推測(cè)其可特異結(jié)合幾丁質(zhì)底物，發(fā)揮酶協(xié)同降解等生理功能。

圖4　CBP58的拉曼圖（A）和三維結(jié)構(gòu)（B）分析Fig.4 Ramachandran plot（A）and three-dimensional structure（B）analysis of CBP58

2.3CBP58基因的表達(dá)與純化

2.3.1重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET23b-CBP58的酶切鑒定

通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取1、2、3、4、6、7、9和10號(hào)白斑的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NdeI/XhoI進(jìn)行雙酶切，酶解產(chǎn)物全量上樣1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物片段大小分別約為1.6 kbp和3.7 kbp左右，即表達(dá)的CBP58基因和原核表達(dá)載體pET23b（+），說(shuō)明成功地構(gòu)建了CBP58基因原核表達(dá)載體。

圖5　重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5 Identification results of recombinant plasmid by double digestion

選取1、4、6和9號(hào)構(gòu)建的重組質(zhì)粒以通用引物為模板進(jìn)行PCR測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明1號(hào)和4號(hào)有一定的點(diǎn)突變，而6號(hào)和9號(hào)測(cè)序結(jié)果和PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果完全一致。

2.3.2 CBP58在大腸桿菌內(nèi)的重組表達(dá)

將酶切鑒定與測(cè)序鑒定正確的6號(hào)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）中異源表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。如圖6所示。

圖6　轉(zhuǎn)化株E.coliBL21（DE3）/pET23b-CBP58表達(dá)CBP58Fig.6 Detection of CBP58 expressed by transformantsE.coliBL21（DE3）/pET23b-CBP58

由圖6可知，加入0.2 mmol/L IPTG后成功誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。以沒有裝載CBP58的E.coliBL21（DE3）/pET23b菌體作為對(duì)照，在E.coliBL21（DE3）/pET23b-CBP58菌體裂解液全菌、上清液和沉淀的約58 ku位置清晰可見出現(xiàn)一條蛋白帶，該條帶分子質(zhì)量大小與重組CBP58的理論分子質(zhì)量（58.517 ku）相一致，由此推測(cè)該蛋白帶為誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白CBP58。

2.3.3 CPB58的Ni-NTA親和純化

表達(dá)菌株超聲破碎后的上清液使用Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白CPB58，SDS-PAGE檢測(cè)洗脫收集液，如圖7所示。由圖7可知，目標(biāo)蛋白被150 mmol/L、300 mmol/L咪唑溶液洗脫，將150～300 mmol/L咪唑洗脫液合并后用3 ku超濾管超濾濃縮（用50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖液替換咪唑溶液）。SDS-PAGE檢測(cè)顯示該重組蛋白純化后得到單一條帶，大小約58 ku，與預(yù)期大小一致。純化蛋白質(zhì)量濃度為1.7 mg/mL，說(shuō)明目標(biāo)蛋白CBP58純度較高且濃度較大。

圖7　重組CBP58不同洗脫條件下的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 The SDS-PAGE electrophoresis pattern of recombinant CBP58in different elution conditions

3　結(jié)論

目前已報(bào)道大部分33家族幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白僅由單獨(dú)的CBM33模塊構(gòu)成，本研究CBP58除CBM33外還包含兩個(gè)類型3幾丁質(zhì)結(jié)合域（ChtBD3），這些結(jié)構(gòu)域的功能已有文獻(xiàn)報(bào)道，但具體機(jī)制尚未完全闡述清楚［2］。BORASTON A B I等［14］驗(yàn)證CBM的底物結(jié)合特性，但是CBM家族到底如何結(jié)合底物、提高底物轉(zhuǎn)化效率的機(jī)制等并不完全清楚。UNI F等［15］定點(diǎn)突變芽孢桿菌（Bacillussp.J813）幾丁質(zhì)酶中ChtBD的Trp541和Trp542，結(jié)果降低了該酶結(jié)合與水解粉狀晶體幾丁質(zhì)聚合物的效率。KEZUKA Y等［16］突變灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）HUT6037幾丁質(zhì)酶C上ChtBD的Trp59和Trp60得到同樣結(jié)論。WATANABE T等［17-20］研究表明ChtBD3在幾丁質(zhì)酶降解粉狀晶體幾丁質(zhì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ChtBD3更利于幾丁質(zhì)酶催化域與底物結(jié)合、可持續(xù)作用幾丁質(zhì)并具有脫乙酰功能［21-24］。

本研究成功克隆了來(lái)源海洋菌株的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因，對(duì)基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同源建模其三維結(jié)構(gòu)，推測(cè)該蛋白的功能。并將其在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)，通過(guò)鎳親和柱純化獲得高純度的目的蛋白，目前深入的研究該蛋白的底物結(jié)合、協(xié)同降解等生物學(xué)功能，為實(shí)現(xiàn)其與幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)規(guī)模化制備幾丁寡糖等奠定理論基礎(chǔ)。

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Cloning，expression and purification of chitin-binding protein gene

LI Meiyu，CAO Hongyu，ZHANG Qingfang，WANG Xiaohui*
（School of Life Science and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China）

Chitin-binding protein gene was cloned successfully fromPseudoalteromonassp.DL-6 by polymerase chain reaction（PCR）.The PCR sequencing results indicated that the gene was 1 596 bp in length，and encoded 531 amino acid，and its theoretical molecular mass and isoelectric point（pI）was 58.517 ku and 4.35，respectively.It was named asCBP58（Genebank no.KF234016）.The structural domain analysis results showed that the chitin binding protein contained one 33 family carbohydrate-binding modules（CBM），two copies of chitin-binding domain type 3 classified（ChtBDs）. The three-dimensional structure model of the homology structure of CBM33 structural domain of the CBP58 protein was built by homologous modeling on Insight II 2005.The diagram of Ramachandram plot and Verify-3D showed that the structure of model was reasonable and the overall compatibility of this model was credible.TheCBP58gene was constructed into the pET23b vector and then transformed intoEscherichia coliBL21（DE3）to be induced for expression.The recombinant proteins were purified by Ni-NTA resin.CBP58was expressed successfully by the analysis of sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.The study laid a theoretical foundation for the biochemical characterization of the CBP.

chitin binding protein；Pseudoalteromonassp.DL-6；cloning；express；purification

Q93

A

0254-5071（2015）11-0041-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.010

2015-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31500039）；大連大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2014259）

李美玉（1993-），女，本科生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與酶工程。

王曉輝（1981-），女，講師，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。