堿性蛋白酶酶解縊蟶制備多肽工藝

張惠婷，程文健，趙卉雙，鐘 機(jī)，陳麗嬌

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

縊蟶是軟體動(dòng)物門竹蟶科水產(chǎn)動(dòng)物[1]。在我國(guó)沿海地區(qū)，尤其在氣候比較溫暖的福建、浙江和廣東等地縊蟶產(chǎn)量較高[2]?？O蟶富含蛋白質(zhì)以及鈣、磷、鐵、碘等礦物質(zhì)，熱量、脂肪含量較低[3]，是一種食用價(jià)值極高的高蛋白低脂肪水產(chǎn)動(dòng)物。蛋白質(zhì)是人體內(nèi)不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。但蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易被人體消化吸收[5]。因此，如何提高蛋白質(zhì)的消化利用率，成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。將蛋白質(zhì)水解成小分子的生物活性多肽，是提高蛋白質(zhì)消化利用率的有效方法之一，且已有研究表明，二肽以上的多肽能被人體完整吸收[6]。

生物活性多肽是指具有特定氨基酸序列的生物活性物質(zhì)[7]，不但能提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗病毒、抗細(xì)菌等多種生理活性[8]。生物活性多肽的制備方法以酶解法應(yīng)用最廣泛[9]。由于酶水解具有較高的選擇性[10]，且受pH、料液比、酶解溫度、酶添加量、酶解時(shí)間等因素的影響，因此，利用酶解法制備多肽時(shí)，酶的選擇及酶解條件的控制尤為重要。堿性蛋白酶是來源于枯草桿菌的一種內(nèi)切酶，能水解含谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)的肽鍵[11]，水解位點(diǎn)較多。利用堿性蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，生物活性肽得率高。因此，本研究采用堿性蛋白酶對(duì)縊蟶進(jìn)行水解，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，為酶解法制備縊蟶多肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與設(shè)備

1.1.1 原料 縊蟶購(gòu)于福州市永輝超市;堿性蛋白酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，酶活性為203 000 U·g－1;Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司。

1.1.2 設(shè)備 BS 224S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);PB-10型pH計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解流程 縊蟶—→絞碎—→酶解—→滅酶—→粗提液—→離心—→取上清液—→測(cè)定多肽含量。

1.2.2 主要成分的測(cè)定 (1)水分:采用直接干燥法[12];(2)蛋白質(zhì):采用凱氏定氮法[13]。(3)粗脂肪:采用索氏提取法[14]。

1.2.3 多肽含量的測(cè)定 凡具有2個(gè)直接連接的肽鍵都有雙縮脲反應(yīng)[15]。因此，參照文獻(xiàn)[16－17]多肽含量的測(cè)定方法，獲得四肽標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度[X/(mg·mL－1)]與其光密度(Y)之間的回歸方程為:Y=0.144 3X+0.001 7，R2=0.999 8，X∈(0，1)。

稱取10 g縊蟶，在特定酶解工藝參數(shù)下水解后，90℃水浴中滅酶10 min，冷卻后將水解產(chǎn)物在8 000 r·min－1離心15 min，取上清液A。量取上清液A以及等體積三氯乙酸水溶液(0.1 g·mL－1)，混勻、靜置10 min后，4 000 r·min－1離心15 min，取上清液B。將上清液B與雙縮脲試劑按3∶2的體積比加入試管中反應(yīng)10 min后，2 000 r·min－1離心10 min，取上清液測(cè)定D540nm，再根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)四肽回歸方程，計(jì)算上清液B中多肽含量。

式中，M為縊蟶多肽含量/(mg·g－1);“2”表示相同體積的上清液A與10%三氯乙酸混合后反應(yīng)體系體積擴(kuò)大的倍數(shù);C為上清液B多肽含量/(mg·mL－1);V為上清液A的總體積/mL;m為縊蟶質(zhì)量/g。

1.2.4 試驗(yàn)方案 (1)單因素試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取10 g縊蟶，酶解，固定其他因素，分別考察pH值(8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)、料液比(1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0)、溫度(30、40、50、60、70 ℃)、酶添加量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%)和酶解時(shí)間(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h)對(duì)縊蟶多肽含量的影響。按1.2.3方法測(cè)定縊蟶多肽含量，每組重復(fù)3次，取平均值。

(2)正交試驗(yàn):采用L25(56)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿性蛋白酶的酶解工藝。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)因素及水平Table1 Factors and levels of the orthogonal experiment for alkaline protease

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶主要成分分析

測(cè)定表明，縊蟶水分含量為80.74%、蛋白質(zhì)含量為15.51%、粗脂肪含量為2.35%，其余成分含量?jī)H占1.40%。由此可見，除水分外鮮縊蟶中蛋白質(zhì)含量最高，適合作為制備生物多肽的原料。

2.2 pH值對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響

由圖1可知，反應(yīng)液pH值在8.0－11.0之間時(shí)，多肽含量呈緩慢的先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，達(dá)到最高水平;當(dāng)pH值＞11.0時(shí)，可能由于反應(yīng)液堿性過高導(dǎo)致堿性蛋白酶活性降低，多肽含量也開始明顯下降。因此，采用堿性蛋白酶酶解縊蟶的較佳pH值為9.0左右。

圖1 pH值對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.1 Effects of hydrolytic pH on the yield of peptides

2.3 料液比對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響

由圖2可知，料液比在1∶1.0至1∶2.0之間時(shí)，由于反應(yīng)體系中溶液少，堿性蛋白酶擴(kuò)散速度較慢，導(dǎo)致酶與底物接觸的機(jī)會(huì)也較少，多肽含量上升趨勢(shì)緩慢。而當(dāng)料液比在1∶2.0至1∶3.0之間時(shí)，多肽含量上升趨勢(shì)較快，料液比為1∶3.0時(shí)達(dá)到最高水平。之后可能由于反應(yīng)體系中溶液增多，降低了底物與酶分子結(jié)合的機(jī)會(huì)，多肽含量開始下降。綜合來看，料液比選取1∶3.0左右為宜。

圖2 料液比對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.2 Effects of hydrolytic solid-liquid ratio on the yield of peptides

2.4 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響

由圖3可知，酶解溫度在30－50℃之間時(shí)，堿性蛋白酶酶解效果較穩(wěn)定。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，多肽含量最高。當(dāng)溫度＞50℃時(shí)，溫度過高導(dǎo)致部分堿性蛋白酶失活，且使絕大部分縊蟶蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致多肽含量急劇下降。因此，酶解溫度選擇40℃左右較佳。

圖3 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.3 Effects of hydrolytic temperature on the yield of peptides

2.5 酶添加量對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響

由圖4可知，當(dāng)酶添加量在1.0% －2.0%之間時(shí)，多肽含量呈上升趨勢(shì)。而當(dāng)酶添加量在2.0% －3.0%之間時(shí)，由于反應(yīng)體系中酶量相對(duì)較充足，除將縊蟶蛋白進(jìn)行水解外，還將酶解過程中產(chǎn)生的大分子多肽水解成小分子肽或氨基酸，降低多肽含量。當(dāng)酶添加量＞3.0%時(shí)，由于反應(yīng)體系中縊蟶蛋白已經(jīng)較完全水解，且水解液中的肽段切點(diǎn)已不適合堿性蛋白酶，多肽含量無明顯變化。因此，酶添加量應(yīng)控制在2.0%左右。

圖4 酶添加量對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.4 Effects of hydrolytic enzyme added on the yield of peptides

2.6 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響

由圖5可知，在酶解前期，多肽含量隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在2.0 h時(shí)，多肽含量最高，達(dá)到78.5 mg·g－1。而＞2.0 h時(shí)，由于水解液中有限數(shù)量的堿性蛋白酶除將縊蟶蛋白進(jìn)行水解外，還將水解過程中產(chǎn)生的大分子多肽水解成更小分子的肽或氨基酸，從而降低了多肽含量。因此，酶解時(shí)間控制在2.0 h效果較佳。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.5 Effects of hydrolytic time on the yield of peptides

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝結(jié)果見表2。對(duì)表2中極差R值進(jìn)行比較可知，5個(gè)因素對(duì)多肽含量影響程度依次為:酶添加量＞料液比＞時(shí)間＞溫度＞pH值。由表2中K值可知，最優(yōu)水平為:pH=9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、溫度45 ℃、時(shí)間2.5 h。

表2 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal experiment in alkaline protease

應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，5個(gè)因素對(duì)多肽含量影響順序?yàn)?酶添加量＞料液比＞時(shí)間＞溫度＞pH值，與極差分析結(jié)果相一致。酶添加量F值極顯著，說明堿性蛋白酶酶添加量在1.0% －3.0%之間，對(duì)多肽含量有極顯著影響，這與圖4變化趨勢(shì)相一致;料液比、時(shí)間F值顯著，說明在堿性蛋白酶酶解工藝中料液比、酶解時(shí)間對(duì)多肽含量有顯著影響，這與圖2、圖5變化趨勢(shì)相符;pH值、溫度F值不顯著，說明pH值、溫度對(duì)多肽含量影響都不顯著。根據(jù)表2、表3的結(jié)果，選擇pH 值為9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、溫度45 ℃、時(shí)間2.5 h為最佳組合。

表3 堿性蛋白酶正交試驗(yàn)方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experiment for alkaline protease

將正交試驗(yàn)所得最優(yōu)組合進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示最優(yōu)組合下多肽含量達(dá)(81.3±0.4)mg·g－1，表明堿性蛋白酶酶解工藝參數(shù)優(yōu)化成功。

3 結(jié)論

利用堿性蛋白酶酶解縊蟶蛋白，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化縊蟶多肽的制備工藝條件，以期得到縊蟶多肽制備的最適酶解環(huán)境。結(jié)果表明最適條件為:pH值9.5、酶添加量1.5%、料液比1∶3.0、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間2.5 h，在此工藝條件下每克鮮縊蟶可提取多肽(81.3±0.4)mg。

[1]王冬群.縊蟶育苗過程中幾個(gè)問題的探討[J].河北漁業(yè)，2004(3):9，22.

[2]安賢惠，李聯(lián)泰.縊蟶研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2005(1):4－5.

[3]雷曉凌，吳紅棉，范秀萍，等.縊蟶肉的食品化學(xué)特性及其營(yíng)養(yǎng)液的研制[J].海洋科學(xué)，2004，28(12):4－7.

[4]闞建全.食品化學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002:146－148.

[5]孔令明，李芳，陶永霞，等.多肽的功能活性與研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑，2009(3):71－73.

[6]索江華，李鳳玲，郭春燕.活性肽的生理功能與制備方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)飼料，2014(23):30－33.

[7]DE CASTRO R J S，SATO H H.Biologically active peptides:Processes for their generation，purification and identification and applications as natural additives in the food and pharmaceutical industries[J].Food Research International，2015，74:185 －198.

[8]李維，蘭海楠，郭風(fēng)，等.生物活性肽的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39(10):105－107.

[9]劉海軍，樂超銀，邵偉，等.生物活性肽研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2010(5):5－8.

[10]崔和平，郭興鳳.食源性降血壓肽制備研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2013，26(2):5－8.

[11]蔣海萍.藍(lán)圓鲹蛋白制備抗氧化肽的研究[D].南寧:廣西大學(xué)，2014.

[12]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品中水分的測(cè)定:GB 5009.3—2010[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[13]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定:GB 5009.5—2010[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[14]孫曉光，尹健.食品中粗脂肪的測(cè)定:GB/T 14772—2008[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[15]畢葳，邢延一，李燕燕，等.應(yīng)用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定鱉甲中總肽含量的方法學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(15):63－65.

[16]李理，張靜.蛋白水解產(chǎn)物中多肽得率的測(cè)定方法研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26(8):884－888.

[17]魯偉，任國(guó)譜，宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測(cè)定方法[J].食品科學(xué)，2005，26(7):169－171.