YY超雄黃顙魚精子保存液和激活液的篩選及在生產(chǎn)上的應(yīng)用

古勇明　陳柏湘　韓林強(qiáng)　劉冰南　黎　潔

1.廣東省佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司，廣東佛山528216；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070

YY超雄黃顙魚精子保存液和激活液的篩選及在生產(chǎn)上的應(yīng)用

古勇明1陳柏湘1韓林強(qiáng)1劉冰南1黎潔2

1.廣東省佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司，廣東佛山528216；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070

分別以精子活力和受精率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)5種精子保存液在不同稀釋倍數(shù)下保存超雄黃顙魚精子的效果及不同濃度NaCl激活液的應(yīng)用效果進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，B保存液效果最好，精子活力和壽命保持時(shí)間最長(zhǎng)，8倍稀釋液在4℃條件下，96h內(nèi)可保持80%以上的活力；低濃度NaCl溶液能延長(zhǎng)精子的壽命，在0.3% NaCl溶液中激活精子活力最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)篩選的超雄黃顙魚精子保存液和激活液在全雄黃顙魚生產(chǎn)中具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

YY超雄黃顙魚；精子；保存液；激活液；受精率

黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）隸屬于鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，俗稱嘎魚、黃姑、黃蠟丁，是一種小型底層經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，肌間刺少，深受消費(fèi)者喜愛，已成為我國(guó)名特優(yōu)水產(chǎn)品重點(diǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一，2013年全國(guó)黃顙魚總產(chǎn)量超過50萬t[1]。

在相同養(yǎng)殖條件下，全雄黃顙魚的養(yǎng)殖效益顯著高于普通黃顙魚[2-3]，使得全雄黃顙魚苗種市場(chǎng)需求量不斷增加。全雄黃顙魚人工繁殖生產(chǎn)需殺超雄黃顙魚取精，剪碎研磨，再用精子保存液清洗和稀釋，若處理不當(dāng)將會(huì)影響精子活力，造成受精率低下，同時(shí)造成YY超雄魚親本浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本。

有關(guān)黃顙魚等鲇形目魚類精子保存液和激活液的研究已有報(bào)道[4-7]，但超雄黃顙魚（YY）與一般黃顙魚雄魚（XY）在遺傳基礎(chǔ)上存在本質(zhì)差異，兩者精子組成不同，保存液效果是否一致，目前還未見相關(guān)的研究報(bào)道。

本研究初步探討了5種保存液及不同濃度激活液對(duì)超雄黃顙魚精子活力的影響，以篩選出效果最優(yōu)的保存液和激活液參數(shù)，并在人工繁殖生產(chǎn)中應(yīng)用，指導(dǎo)苗種生產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1材料來源

YY超雄黃顙魚為佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司研發(fā)育成，使用前利用分子標(biāo)記鑒定確認(rèn)。在繁殖季節(jié)，選取體表無傷、無病、個(gè)體健康、性成熟的YY超雄黃顙魚，體重為200～250g。精子保存容器為經(jīng)洗滌和高溫滅菌處理后的10mL可密封青霉素玻璃瓶。

1.2精子保存液的制備

根據(jù)魚類精子保存的生理需要，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，配制了A～E共5種精子保存液，具體配方成分組成見表1。

1.3超雄黃顙魚精子采集

采用人工催產(chǎn)的方法進(jìn)行精子采集。催產(chǎn)激素及劑量為：LHRH-A24μg/kg，DOM1.0mg/kg，到達(dá)效應(yīng)時(shí)間時(shí)，先用干毛巾擦干魚身，然后剖腹取出乳白色的精巢，剔除血污等，置于吸水紙上吸去水分，在孔徑為0.150mm的干凈網(wǎng)布中擠出精子，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4精液的保存

使用定量移液槍將精液分別用保存液A～E進(jìn)行4、8倍稀釋，保存瓶置于冰箱（4℃）保存，設(shè)置3個(gè)平行。

1.5精子活力觀察

用1mL微型注射器針尖挑取少量精液，放至事先滴好低滲溶液的計(jì)數(shù)板上，激活精子，在數(shù)碼顯微鏡下拍攝出精子在各種低滲溶液中的運(yùn)動(dòng)狀況。用精子激活后的活力（快速運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分比）為指標(biāo)對(duì)保存效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。“+++”表示100%精子快速運(yùn)動(dòng)；“++”表示80%精子快速運(yùn)動(dòng)；“+”表示50%精子快速運(yùn)動(dòng)；“+-”表示10%～30%精子快速運(yùn)動(dòng)；“-”表示少量精子在原地振動(dòng)或全部死亡。精子的激活率、強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)期、慢速運(yùn)動(dòng)期和壽命的觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.6人工授精受精率統(tǒng)計(jì)

每組各取卵子約500粒于培養(yǎng)皿中，分別加入0.1mL精液，并加入10mL水激活，迅速振蕩使卵子和精子充分結(jié)合并黏于培養(yǎng)皿底部后統(tǒng)一置于塑料大盆中，定期換水、充氣，保證溶氧。受精卵處于原腸中期時(shí)，在解剖鏡下抽樣觀察并計(jì)數(shù)受精卵，計(jì)算其受精率，受精率=（原腸中期卵數(shù)目/總卵數(shù)）×100%。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.7試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）不同保存液對(duì)超雄黃顙魚精子保存效果的影響。

在低溫（4℃）條件下，觀察5種精子保存液4、8倍稀釋保存的結(jié)果。前12h每隔2～4h觀察1次，以后12～24h時(shí)觀察1次，記錄結(jié)果。獲得超雄黃顙魚精子活力的時(shí)間變化規(guī)律，確定最優(yōu)保存液和最佳保存時(shí)間。

2）不同保存時(shí)間對(duì)人工授精效果的影響。

利用篩選的最優(yōu)保存液保存精液，評(píng)估不同保存時(shí)間的授精效果。選擇發(fā)育良好的雌魚3尾和超雄魚2尾，注射催產(chǎn)激素，2次注射，針距10h，第1針LHRH-A210μg/kg，第2針LHRH-A25μg/kg、 DOM2.0mg/kg和HCG1500IU/kg，效應(yīng)時(shí)間后擠卵，選擇卵質(zhì)良好、數(shù)量較多的同一尾雌魚卵用于實(shí)驗(yàn)。在培育皿中各取約500顆卵粒分別與不同保存時(shí)期保存的精液和新鮮精液授精，加水激活，然后放入塑料盆中孵化，統(tǒng)計(jì)受精率，每組設(shè)置3個(gè)平行。

3）不同低滲激活液對(duì)超雄黃顙魚精子活力的影響。

考察超雄黃顙魚精子在不同鹽度激活液中的激活情況，統(tǒng)計(jì)精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和平均壽命，篩選出最佳的激活液濃度。

4）不同低滲激活液對(duì)人工授精效果的影響。

生產(chǎn)過程中選擇發(fā)育較好的雌魚，注射催產(chǎn)激素，效應(yīng)時(shí)間后，選擇卵質(zhì)良好的卵用于實(shí)驗(yàn)，干法授精，分別用不同濃度激活液（0.0%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）激活，統(tǒng)計(jì)受精率，每組設(shè)置3個(gè)平行。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在SSPP19.0軟件中整理并作多重比較分析，顯著水平為P=0.05。

表1　精子保存液配方組成情況

2　結(jié)果與分析

2.1不同保存液對(duì)超雄黃顙魚精子保存效果的影響

超雄黃顙魚精子在不同保存液中的保存效果見表2。低溫條件下（4℃），5種保存液4倍和8倍稀釋保存下的精液在前24h內(nèi)精子活力均很強(qiáng)，激活后幾乎100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；24h后活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但不同保存液中的精子活力變化有所不同，不同稀釋倍數(shù)間也開始出現(xiàn)差異。

1）保存液A：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后僅約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120h精子基本死亡。8倍稀釋保存中，保存48h后精子活力下降不明顯，激活后仍有接近100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～120h活力下降明顯，激活后作快速運(yùn)動(dòng)的精子量從80%逐步降低到10%；144h精子基本死亡。

2）保存液B：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96～120h激活后約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h精子仍有約10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，保存48h后精子活力下降不明顯，激活后仍有接近100%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～96h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120～144h激活仍可觀察到約50%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)。

3）保存液C：4倍稀釋保存中，24h后精子活力下降，48～96h激活后超過80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h后僅有不到10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，24h后精子活力變化不大，48h仍可觀察到100%的精子快速運(yùn)動(dòng)，72～96h激活后超過80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅有約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h觀察僅有不到10%的精子可以快速運(yùn)動(dòng)。

4）保存液D：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120～144h僅有約10%～30%的精子可快速運(yùn)動(dòng)。8倍稀釋保存中，24h后精子活力下降較明顯，48～120 h激活后作快速運(yùn)動(dòng)的精子量從80%逐步降低至10%；144h精子基本死亡。

5）保存液E：4倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48～72h激活后50%的精子在做快速運(yùn)動(dòng)；96h激活后僅有約20%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120 h 精子基本死亡。8倍稀釋保存中，24h后活力下降趨勢(shì)明顯，48h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)；72～96h激活后僅有約50%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；120h激活后僅有約10%~30%的精子作快速運(yùn)動(dòng)；144h精子基本死亡。

表2　超雄黃顙魚精子在不同保存液中的保存效果（4℃）

6）原精：保存8h精子活力未見明顯降低，8h之后活力下降明顯，12h激活后80%左右精子作快速運(yùn)動(dòng)，24h激活后約50%精子作快速運(yùn)動(dòng)，48h觀察基本看不到快速運(yùn)動(dòng)的精子了。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保存液B對(duì)超雄黃顙魚精液的保存效果相對(duì)較佳。稀釋倍數(shù)方面，除了保存液D的4倍稀釋效果略優(yōu)于8倍稀釋外，其他保存液的結(jié)果均顯示8倍稀釋較4倍稀釋的效果好。綜合以上結(jié)果，篩選出保存液B的8倍稀釋作為超雄黃顙魚精液的保存液。

2.2不同保存時(shí)間對(duì)人工授精效果的影響

不同保存時(shí)間的精液人工授精的受精率見圖1。

從圖1可知，對(duì)照組的受精率始終保持在約90%的水平，且不同時(shí)間的差異較小。低溫條件下，保存液B的8倍稀釋保存精液在48h內(nèi)的受精率（84.5%～94.6%）與原精（85.3%～94.3%）相比差異極小，受精效果均較好。48～96h與原精相比，受精率呈現(xiàn)一定下降趨勢(shì)，120h后保存精液的受精率急劇下降，144h受精率降低至約60%。結(jié)果表明，保存液B的8倍稀釋保存精液最好在2～3d內(nèi)使用，保存時(shí)間過長(zhǎng)，受精效果存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使用前要求鏡檢精子的活力情況，該結(jié)果與觀察到的不同保存時(shí)間精液的精子活力結(jié)果基本吻合。

圖1　不同保存時(shí)間的精液人工授精的受精率

圖2　不同濃度NaCl激活液條件下人工授精的受精率

2.3不同低滲激活液對(duì)超雄黃顙魚精子活力的影響

超雄黃顙魚精液在不同濃度NaCl溶液中激活的情況見表3。

結(jié)果顯示，低滲溶液能不同程度地提高超雄黃顙魚精子的活力與壽命。各試驗(yàn)組的精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組，以0.2%濃度組和0.3%濃度組最高，分別為32.3±4.6、38.7±3.8s，相比對(duì)照組延長(zhǎng)了9～15s；精子慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間同樣以0.2%濃度組和0.3%濃度組最高，其次是0.4%濃度組，均顯著高于對(duì)照組。精子壽命以0.3%濃度組最高，0.4%和0.2%次之，同樣顯著高于對(duì)照組。

精子被激活數(shù)量的觀察結(jié)果顯示，隨著低滲激活液濃度增大激活比例呈下降趨勢(shì)，但0.0%~0.3%濃度組精子的激活率下降不明顯，均保持在90%以上，而0.4%～0.5%濃度組精子的激活率顯著下降，僅60%左右。

2.4不同低滲激活液對(duì)人工授精受精率的影響

不同低滲激活液激活條件下全雄黃顙魚人工授精受精率的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見圖2。

結(jié)果表明不同低滲激活液條件下獲得的受精率存在差異（69.9%～77.1%），激活液在0.0%～0.3%的濃度范圍，受精率隨著濃度的升高而上升；在0.3%～0.5%的濃度范圍，受精率隨濃度的升高而下降，其中以0.3%濃度組的受精率最高，0.2%的次之，兩者顯著高于對(duì)照組。

表3　超雄黃顙魚精子在不同濃度低滲溶液中的活力1）

3　討論

3.1不同保存液及稀釋比例對(duì)超雄黃顙魚精液保存效果的影響

本研究考察了4℃條件下5種精子保存液保存超雄黃顙魚精液的效果，與對(duì)照組相比，5種保存液均可延長(zhǎng)YY超雄黃顙魚精液的保存時(shí)間。各保存液之間存在一定差異，保存液B的保存效果相對(duì)最佳，其次是D，再次是C、A、E。不同保存液間效果的差異與保存液的配方組成有關(guān)。精液的保存需要適當(dāng)?shù)臐B透壓、離子組成、pH、能量供給等一系列條件，保存液的組成越接近精漿的組成，保存時(shí)間就會(huì)越長(zhǎng)[9]。本實(shí)驗(yàn)中5種精子保存液均在相關(guān)研究中證實(shí)對(duì)精液短期低溫保存具有良好效果，但對(duì)于超雄黃顙魚精液的保存效果存在一定的差異。超雄黃顙魚精子在含葡萄糖溶液中的壽命較其他保存液中相對(duì)較長(zhǎng)，可能葡萄糖除提供適宜的滲透壓外，還起著額外的作用。這與蘇德學(xué)等[11]在黃顙魚精子保存中的研究結(jié)果類似，推測(cè)黃顙魚精子具有利用細(xì)胞外源性葡萄糖的能力，以彌補(bǔ)在活動(dòng)過程中消耗的部分能量，從而使精子壽命得到延長(zhǎng)。Gardiner[12]也認(rèn)為體外受精魚類的精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，可以通過氧化作用利用細(xì)胞外源性碳水化合物，尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖，這三種單糖可以是精子活動(dòng)存活的可選擇和次級(jí)的能源。

保存液不同的稀釋倍數(shù)對(duì)保存效果同樣存在影響。本研究結(jié)果表明，除了保存液D的4倍稀釋效果略優(yōu)于8倍稀釋外，其他保存液8倍稀釋均較4倍稀釋效果好，這與丁淑荃等[4]在實(shí)驗(yàn)中獲得的黃顙魚保存液以5～7倍的稀釋比例較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2保存精液對(duì)受精率的影響

對(duì)照組的受精率始終保持在90%左右的高受精率水平，且不同時(shí)間點(diǎn)的差異極小，表明實(shí)驗(yàn)過程中選擇的雌魚和雄魚發(fā)育情況良好，精卵質(zhì)量?jī)?yōu)良。精子保存過程中運(yùn)動(dòng)受到一定的抑制作用，精子的運(yùn)動(dòng)和滲透壓的維持是一個(gè)耗能的過程，保存液中精子活力隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)不同程度的下降，推測(cè)跟精子的能量消耗有關(guān)。低溫條件下，保存液B8倍稀釋保存的精子在48h內(nèi)的受精率（84.5%～94.6%）與鮮精（85.3%～94.3%）相比差異極小，受精效果均較好。在48～96h與鮮精相比受精率略微下降，120h后則急劇下降，144h受精率下降至60%左右。該保存液保存的精子在72～96h激活后80%的精子在作快速運(yùn)動(dòng)，由此可推測(cè)全雄黃顙魚人工授精要達(dá)到滿意的受精效果，使用的精液應(yīng)滿足激活后80%以上的精子可以快速運(yùn)動(dòng)，另外保存的精液最好在2～3d內(nèi)使用，保存時(shí)間過長(zhǎng)，受精效果存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使用前要求鏡檢精子的活力情況。魯大椿等[13-15]的研究結(jié)果表明家魚人工授精時(shí)，精卵的量比以30萬～40萬時(shí)受精率最高。大部分的鯉科魚類的精子濃度在60%～70%，密度大都在200億～400億/mL之間，即每毫升原精可以使50萬～100萬粒魚卵受精。超雄黃顙魚的精液量相對(duì)家魚少得多，精液不能擠出，人工繁殖過程中合適倍數(shù)的稀釋精液將大大提高生產(chǎn)的效率，減少精液的浪費(fèi)。

3.3超雄黃顙魚精子在不同濃度NaCl溶液中活力

由于精巢中具有諸多抑制精子活動(dòng)的因素，精子的運(yùn)動(dòng)被抑制[5]，魚類的精子在精巢中是不運(yùn)動(dòng)的，但具有很強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)潛能[16]。當(dāng)精子排出體外，在適當(dāng)?shù)臈l件下精子便開始運(yùn)動(dòng)，這一過程稱之為激活[17]。滲透壓是調(diào)節(jié)魚類精子活力的主要因子，魚類精子激活比例隨外界溶液滲透壓的變化而變化，在一定范圍內(nèi)淡水魚精子激活比例隨外界溶液滲透壓的降低而上升[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度NaCl溶液對(duì)精子的活力與壽命有非常顯著的影響。在0.1%～0.5%的NaCl溶液中，精子壽命均高于直接用水激活。從精子被激活強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間來看，在0.3% NaCl溶液中精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)為38.7s，在0.5%溶液中精子強(qiáng)烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最短為26.0s。從精子數(shù)量來看，在0.0%～0.3%NaCl溶液中被激活的精子在93%以上，在0.4%～0.5%NaCl溶液中被激活的精子占50%～60%。由此得出0.3%NaCl溶液是超雄黃顙魚精子的最佳激活液，可提高人工繁殖效率，在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。

本研究中超雄黃顙魚精子在濃度為0.0%～0.5%的低滲溶液中，被激活后保持活力的時(shí)間和精子激活率的結(jié)果與黃顙魚基本一致，最適鹽度范圍為0.2%～0.3%[8]，但與瓦氏黃顙魚精子激活的最適鹽度范圍為0.45%～0.55%不同[19]，這與魚類不同的生態(tài)習(xí)性存在一定關(guān)系，一般認(rèn)為魚類精子激活最適的條件與其繁殖的環(huán)境相一致。

3.4結(jié)論

魚類精原細(xì)胞經(jīng)過一系列階段成為精子。染色體為XY♂的黃顙魚，產(chǎn)生X、Y兩種精子，而YY♂超雄魚僅產(chǎn)生Y精子。大量研究表明，X、Y精子存在多方面的差異，如精子膜表面電荷、精子核和頭部的形態(tài)學(xué)差異、對(duì)pH值的敏感性、Y精子中獨(dú)特的乳酸脫氫酶和H-Y抗原、精子密度、泳動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)特性、DNA含量等[20-21]。兩種不同雄魚的精子組成所適應(yīng)的保存條件要求是否一致，需要通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。研究結(jié)果表明，黃顙魚精液保存效果良好的保存液對(duì)于超雄黃顙魚的精子保存同樣具有較好的效果，其中以保存液B的8倍稀釋，0.3%NaCl激活液，可以提高繁殖生產(chǎn)的效率，適合在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。但兩者的保存液要求是否完全一致及是否有更加良好的超雄黃顙魚的精子保存液配方，還需進(jìn)一步深入研究。

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2015-06-08

高雄性率黃顙魚的雜交育種及規(guī)模化人工繁育技術(shù)推廣，清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C007）古勇明，男，1960年生，中級(jí)工程師。