慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性研究

詹愛琴，杜美玲，左維澤，程　麗，朱慶峰，季　榕，買力坎木，程光海，居馬百克，謝松松，張　硯

·論著·

慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性研究

詹愛琴，杜美玲，左維澤，程麗，朱慶峰，季榕，買力坎木，程光海，居馬百克，謝松松，張硯

目的探討慢性HBV感染者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性。方法選取2013年1月—2014年12月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科收治的住院和門診慢性HBV感染者100例，其中輕中度慢性乙型肝炎(CHBLM)組43例、乙型肝炎肝硬化(LC)組27例、慢性重型乙型肝炎(CSHB)組30例;選取同期該院健康體檢者36例為健康對(duì)照(HC)組。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(FQ－PCR)檢測(cè)HBV－DNA載量，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg水平。外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果CHBLM、LC、CSHB組的HBV－DNA載量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.564，P＜0.05);兩兩比較顯示，CHBLM組與LC組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CHBLM、LC、CSHB、HC組的Treg水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.218，P＜0.05);組間兩兩比較顯示，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CHBLM、LC、CSHB組外周血Treg水平與HBV－DNA載量均呈正相關(guān)(r值分別為0.458、0.697、0.544，P＜0.05)。結(jié)論慢性HBV感染者Treg水平增加，Treg水平與HBV－DNA載量呈正相關(guān)。提示Treg在慢性HBV感染中擔(dān)負(fù)著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，可能抑制HBV感染者特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，與HBV感染的慢性化及肝病的臨床發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;HBV－DNA;HBV感染

詹愛琴，杜美玲，左維澤，等.慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性研究［J］．中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(25):3439－3442.［www.chinagp.net］

Zhan AQ，Du ML，Zuo WZ，et al．Correlation between regulatory T cell level in the peripheral blood and HBV－DNA load of patients with chronic hepatitis B virus infection［J］．Chinese General Practice，2015，18(25):3439－3442.

HBV感染后可能發(fā)展為慢性HBV攜帶、慢性肝炎、肝硬化、肝癌，其病情容易慢性化，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且至今尚未完全闡明，目前認(rèn)為除與HBV的直接作用有關(guān)外，也與宿主免疫應(yīng)答調(diào)控的紊亂、體內(nèi)缺乏特異性抗病毒免疫關(guān)系密切，宿主的免疫應(yīng)答同時(shí)導(dǎo)致了肝細(xì)胞的損傷和病毒的清除兩個(gè)方面，這可能是HBV感染后導(dǎo)致慢性肝損傷的主要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞可以分化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，Treg具有免疫抑制作用［1］，參與HBV感染后機(jī)體免疫耐受機(jī)制，與慢性乙型肝炎發(fā)病有密切關(guān)系［2］。本研究探討了慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性，以期了解Treg在慢性HBV感染發(fā)病機(jī)制中的作用，為慢性肝病的診斷及減少肝硬化、肝癌的發(fā)生提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年1月—2014年12月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科收治的住院和門診慢性HBV感染者100例，其中輕中度慢性乙型肝炎(CHBLM)組43例、乙型肝炎肝硬化(LC)組27例、慢性重型乙型肝炎(CSHB)組30例。所有患者的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)2010年聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》［3］。排除甲、丙、丁、戊等病毒性肝炎，酒精性肝炎，脂肪肝，自身免疫性肝炎，遺傳性肝病，腎功能不全及惡性腫瘤。選取同期該院健康體檢者36例為健康對(duì)照(HC)組。本研究通過該院倫理委員會(huì)審核，患者均知情同意。

1.2研究方法(1)乙型肝炎抗原抗體的檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，由專職檢驗(yàn)師嚴(yán)格按照荷蘭理利公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。(2) HBV－DNA的定量檢測(cè):采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(FQ－PCR)，嚴(yán)格按照廣州達(dá)安公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3)Treg水平的檢測(cè):采集所有受試者外周靜脈血5 ml，肝素抗凝(1 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè))。取2個(gè)流式試管，分別加入抗人CD4－FITC/CD25－PE及其同型對(duì)照IgG2b－FITC/IgG1－PE各10 μl，各管再加入50 μl新鮮抗凝全血，混勻，室溫避光孵育30 min，加入固定劑50 μl，室溫避光放置10 min后用1.5 ml免洗紅細(xì)胞裂解液裂解10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。其中抗人CD4－FITC、CD25－PE、IgG2b－FITC、IgG1－PE均購(gòu)于天津協(xié)科生物技術(shù)有限公司，固定劑、免洗紅細(xì)胞裂解液、流式細(xì)胞儀購(gòu)于德國(guó)Partec公司。采用FloMax專用軟件獲取及分析，計(jì)算Treg占CD4淋巴細(xì)胞的比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組一般情況比較CHBLM、LC、CSHB、HC組的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); CHBLM、LC、CSHB組的HBeAg陽性率、HBV－DNA陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

CHBLM、LC、CSHB組的HBV－DNA載量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩兩比較顯示，CHBLM組與LC組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.026，P＜0.05)，其他組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

表1　各組一般情況比較Table 1Comparison of general information among the three groups

2.2各組外周血Treg水平比較CHBLM、LC、CSHB、HC組的Treg水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =25.218，P＜0.05，見表2);組間兩兩比較顯示，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

2.3各組外周血Treg水平與HBV－DNA載量的相關(guān)性CHBLM組外周血Treg水平與HBV－DNA載量呈正相關(guān)(r=0.458，P＜0.05，見圖1);LC組外周血Treg水平與HBV－DNA載量呈正相關(guān)(r=0.697，P＜0.05，見圖2);CSHB組外周血Treg水平與HBV－DNA載量呈正相關(guān)(r=0.544，P＜0.05，見圖3)。

表2　各組外周血Treg水平比較(±s，%)Table 2Comparison of Treg level in peripheral blood among the four groups

表2　各組外周血Treg水平比較(±s，%)Table 2Comparison of Treg level in peripheral blood among the four groups

注:Treg=CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

組別例數(shù)Treg 水平CHBLM組368.12±2.80 439.23±3.30 LC組2710.35±3.21 CSHB組3011.95±3.26 HC組

表3　外周血Treg水平的組間兩兩比較結(jié)果Table 3Pairwise comparison of Treg level in peripheral blood

圖1　CHBLM組Treg水平與HBV－DNA載量相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 1Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in CHBLM group

3　討論

Treg是具有免疫調(diào)節(jié)功能的一種細(xì)胞亞群，它的作用表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一方面，在機(jī)體受到病原微生物感染時(shí)，Treg可以抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，避免過度的免疫病理損害;另一方面，Treg不利于病原體的清除，導(dǎo)致感染持續(xù)存在。Treg的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受有了新的認(rèn)識(shí)，機(jī)體可能更主要的是通過Treg以“主動(dòng)”的方式維持自身免疫耐受，其在抑制自身免疫性T細(xì)胞增殖、免疫穩(wěn)定方面有重要作用。在慢性HBV感染者中，Treg水平增高可能會(huì)抑制機(jī)體細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致免疫耐受，HBV感染持續(xù)存在，而HBV的持續(xù)存在與復(fù)制，是慢性乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌的主要因素。

圖2　LC組Treg水平與HBV－DNA載量相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 2Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in LC group

圖3　CSHB組Treg水平與HBV－DNA載量相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 3Scatterplot of correlation between Treg level and HBV－DNA load in CSHB group

人體感染HBV后，多數(shù)成人可以呈急性自限性感染，機(jī)體能迅速?gòu)氐浊宄《?約有10%的成人和90%的兒童感染HBV后，HBV在體內(nèi)長(zhǎng)期存在并不斷復(fù)制，成為慢性HBV攜帶者［4］。HBV感染后慢性化的機(jī)制比較復(fù)雜，其中機(jī)體免疫能力在HBV清除過程中起到關(guān)鍵作用，它既要清除HBV，又要抑制HBV的復(fù)制，達(dá)到臨床治愈的目的，免疫反應(yīng)是一把雙刃劍，在清除病毒的同時(shí)，也可能引起肝細(xì)胞壞死和凋亡，臨床出現(xiàn)重型肝炎或者導(dǎo)致炎性損傷遷延不愈、肝纖維化發(fā)生，甚至發(fā)展為肝硬化、肝癌等，但其中免疫發(fā)生機(jī)制尚不清楚［5－6］。本研究結(jié)果顯示，LC組患者的HBV－DNA載量低于CHBLM組，考慮符合上述機(jī)制。在長(zhǎng)期病程中，機(jī)體免疫力在清除病毒、抑制病毒復(fù)制的同時(shí)也引起肝細(xì)胞不斷出現(xiàn)炎癥、壞死、纖維化［7］。

隨著Treg在肝臟疾病中的研究逐漸成為熱點(diǎn)，其越來越多的方面逐漸得到深入研究［8］。近年來發(fā)現(xiàn)Treg具有免疫低反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能特征，其機(jī)制可能是通過細(xì)胞間直接接觸和/或分泌抑制性細(xì)胞因子，在維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、防止自身免疫性疾病發(fā)生、誘導(dǎo)移植耐受以及調(diào)節(jié)腫瘤免疫方面都起著重要作用。本研究中CHBLM、CSHB、LC組中Treg水平均高于HC組，CSHB組最高，考慮可能與Treg能降低和T細(xì)胞增殖及其功能活性，減少干擾素γ (INF－γ)的產(chǎn)生，避免肝細(xì)胞大量的變性、壞死甚至凋亡有關(guān)。同時(shí)，由于、T效應(yīng)細(xì)胞功能受到抑制與INF－γ產(chǎn)生不足，機(jī)體產(chǎn)生的抗HBV特異性免疫應(yīng)答低下，僅部分HBV得到清除，臨床出現(xiàn)免疫耐受階段，導(dǎo)致HBV感染的慢性化。近年許多學(xué)者對(duì)Treg在慢性HBV感染中的作用、其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及其與臨床病程的相關(guān)性還存在一些爭(zhēng)議，本研究顯示，Treg可能是HBV免疫逃逸產(chǎn)生的重要機(jī)制，從而導(dǎo)致持續(xù)感染［9］。

本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染者外周血Treg水平與HBV－DNA載量呈正相關(guān)，病毒復(fù)制越活躍的患者體內(nèi)Treg的水平越高，可能是體內(nèi)Treg數(shù)量或功能異常，降低了機(jī)體對(duì)HBV特異性的效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，使得病毒不能被徹底清除，形成一種免疫耐受狀態(tài)［10－11］。同時(shí)也防止機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)過于強(qiáng)烈，引起肝細(xì)胞壞死和凋亡，臨床出現(xiàn)重型肝炎。這就說明Treg的免疫抑制效應(yīng)在HBV的復(fù)制過程中起了一定的作用，Treg的數(shù)量和功能可能為治療HBV感染提供一個(gè)新途徑。

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Correlation Between Regulatory T Cell Level in the Peripheral Blood and HBV－DNA Load of Patients With Chronic Hepatitis B Virus Infection

ZHAN Ai－qin，DU Mei－ling，ZUO Wei－ze，et al.Department of Infectious Disease，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China

Objective To explore the correlation between CD4+CD25+regulatory T cell(Treg)level in the peripheral blood and HBV－DNA load of patients with hepatitis B virus infection.MethodsWe enrolled 100 HBV inpatients and outpatients in the First Affiliated Hospital of the Medical College of Shihezi University between January 2013 to December 2014.Among the subjects，43 were assigned into light－medium chronic hepatitis B(CHBLM)group，27 were assigned into hepatitis B liver cirrhosis(LC)group，and 30 were assigned into severe chronic hepatitis B(CSHB)group.We also enrolled 36 healthy people who received physical examination in the hospital in the same period as health control(HC)group.FQ－PCR was used to examine HBV－DNA load，and flow cytometry was used to test Treg level.Pearson correlation analysis was conducted to investigate the correlation between Treg level and HBV－DNA load.ResultsThere were significant differences among the three groups in HBV－DNA load(F=4.564，P＜0.05);in pairwise comparison，significant difference existed between CHBLM group and LC group(P＜0.05)，while no significant differences existed between other two groups.The four groups were significantly different in Treg level(F=25.218，P＜0.05);in pairwise comparison，significant differences existed between any two groups(P＜0.05).In CHBLM group，LC group and CSHB group，there was positive correlation between Treg level and HBV－DNA load(r values were 0.458，0.697 and 0.544 respectively，P＜0.05).ConclusionPatients with chronichepatitis B virus infection have higher Treg level，and there is positive correlation between Treg level and HBV－DNA load.Treg has important immunomodulatory effects on chronic hepatitis B virus infection and may inhibit the specific cellular immune response，and it is related with the chronicity of HBV infection and the clinical application and development of liver diseases.

Regulatory T cell;HBV－DNA;Hepatitis B virus infection

R 512.62

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.25.014

2015－06－10;

2015－08－03)

(本文編輯:閆行敏)

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科(詹愛琴，左維澤，程麗，朱慶峰，季榕，買力坎木，程光海，居馬百克，謝松松，張硯);新疆兵團(tuán)第九師醫(yī)院感染科(杜美玲)

詹愛琴，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科;E－mail:403957842@qq.com