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    下調(diào)miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路

    2015-09-23 09:35:12慕生枝孫要文王國(guó)棟
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2015年23期
    關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞空白對(duì)照瘢痕

    慕生枝,孫要文,王國(guó)棟

    (陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科 陜西 西安 710068)

    下調(diào)miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路

    慕生枝,孫要文,王國(guó)棟

    (陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科陜西西安710068)

    目的:探討microRNA-21(miR-21)對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD4)表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法:利用熒光定量PCR檢測(cè)正常皮膚成纖維細(xì)胞GM0639和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)中miR-21的表達(dá)。構(gòu)建含有PDCD4-pGC-Fu-GFP慢病毒和空載體對(duì)照慢病毒pGC-Fu-GFP感染HSF細(xì)胞。將HSF細(xì)胞按照不同處理方法分為:空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染非特異miRNA的陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制物的mir21 Inhibitor組、轉(zhuǎn)染miR-21質(zhì)粒的miR-21 mimic組、PDCD4-pGC-Fu-GFP組、pGC-Fu-GFP組和Ly294002組。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。采用免疫熒光技術(shù)、熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-21 mimic組和miR-21 Inhibitor組細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)以及基因和蛋白水平。采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)PDCD4-pGC-Fu-GFP組、pGC-Fu-GFP組和Ly294002組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-MYC,CCND1以及通路相關(guān)蛋白p-Akt、JNK1的蛋白表達(dá)。結(jié)果:HSF細(xì)胞中miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)。與空白對(duì)照組相比,抑制miR-21表達(dá)可以抑制HSF細(xì)胞增殖,上調(diào)PDCD4表達(dá)。過表達(dá)PDCD4可以抑制細(xì)胞增殖,下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-MYC,CCND1的表達(dá),同時(shí)抑制通路蛋白p-Akt和JNK1的表達(dá)。結(jié)論:下調(diào)miR-21的表達(dá)能夠促進(jìn)PDCD4表達(dá),抑制HSF細(xì)胞增殖以及PI3K/AKt信號(hào)通路。

    microRNA-21;PDCD4;人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞;細(xì)胞增殖;抑制;PI3K/Akt

    增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)常發(fā)生于創(chuàng)傷尤其是燒傷后,是一種病理性愈合現(xiàn)象,不僅影響美觀而且可能導(dǎo)致機(jī)體功能障礙[1]。在組織學(xué)上增生性瘢痕的形成是由傷區(qū)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原分泌活性增強(qiáng)導(dǎo)致。瘢痕形成過程中,成纖維細(xì)胞合成并分泌大量的膠原蛋白,使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分大量沉積在組織中[2]。目前對(duì)增生性瘢痕的預(yù)防和治療仍面臨著很多困難。雖然有許多治療方法,但眾多學(xué)者還在不斷地探索更理想的防治方案[3],但是還沒有對(duì)瘢痕形成的治療模式達(dá)成共識(shí)[4]。研究發(fā)現(xiàn),一些miRNAs參與了纖維化過程中ECM的代謝調(diào)控,在心衰、間質(zhì)纖維化和心肌肥厚等疾病中,成纖維細(xì)胞中miR-21的表達(dá)增加。同時(shí)miR-21的表達(dá)失調(diào)也與肺纖維化病變中的多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路有關(guān)[5-6]。另外,有研究表明抑制 miR-21的表達(dá)能夠降低博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部間質(zhì)纖維化的病變程度[7]。然而,miR-21是否參與了增生性瘢痕組織形成的調(diào)控目前還不清楚,本研究將從miR-21對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖影響及調(diào)控機(jī)制展開研究和討論,從而為增生性瘢痕的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1材料

    正常人皮膚成纖維細(xì)胞GM0639和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblasts,HSF),SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物試劑公司,新生牛、胎牛血清為PAA產(chǎn)品,Opti-MEM、RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品,LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司。PDCD4多克隆抗體為Cell Signal公司產(chǎn)品,βactin(鼠抗)、HRP標(biāo)記的抗鼠、抗兔二抗為中杉金橋公司產(chǎn)品,C-MYC、CCND1、p-Akt抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司,JNK1購(gòu)自epitomics公司。10%正常羊封閉血清購(gòu)自福州碩博生物技術(shù)有限公司,免疫熒光染色二抗稀釋液購(gòu)自碧云天生物。Ly294002為Cayman Chemical公司產(chǎn)品。

    1.2構(gòu)建PDCD4-pGC-Fu-GFP病毒表達(dá)載體

    從上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司購(gòu)買PDCD4全長(zhǎng)克隆,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增PDCD4編碼框序列,產(chǎn)物經(jīng)過純化、AgeⅠ酶切、酶切片段凝膠回收、連接,將其克隆到慢病毒表達(dá)載體pGC-Fu-GFP中。并且將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)表達(dá),挑取克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。鑒定陽(yáng)性者送公司測(cè)序。比對(duì)分析后,提取測(cè)序成功的克隆的質(zhì)粒。

    1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組

    人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HSF)常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中,放置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染前1天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代,使其融合度為40%的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)處理方法的不同將HSF細(xì)胞分為以下幾組:①空白對(duì)照組:不轉(zhuǎn)染,細(xì)胞正常生長(zhǎng);②陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染非特異性siRNA作為陰性對(duì)照;③miR-21 mimic組:轉(zhuǎn)染miR-21質(zhì)粒;④miR-21 Inhibitor組:轉(zhuǎn)染miR-21抑制物;⑤PDCD4-pGC-Fu-GFP組:感染含有PDCD4的慢病毒載體PDCD4-pGC-Fu-GFP;⑥pGC-Fu-GFP組:感染pGC-Fu-GFP空載對(duì)照慢病毒;⑦Ly294002組:終濃度為20μmol/L Ly294002處理細(xì)胞阻斷PI3K/Akt通路。

    1.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況

    分別取上述處理后的各組細(xì)胞,按每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,每孔體積為200μl,每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,各培養(yǎng)24 h、36h、48h和72h。每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl,37℃培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)基,加入150μl DMSO,室溫避光搖床震蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。以空白孔為對(duì)照,酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(OD值),OD值的大小表示細(xì)胞增殖能力的大小。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

    1.5免疫熒光染色檢測(cè)PDCD4表達(dá)

    細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%~100%時(shí),用1× PBS洗3次,每次10 min;4%的甲醛室溫固定25 min;0.2%Triton X-100透化2~5min;5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30min,加一抗PDCD4(用1%BSA按照1:1 000稀釋)4℃過夜,1×PBS洗滌3次,每次10 min;加二抗IgG(用1%BSA按照1:1 000稀釋)暗室避光30min,95%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝圖片。陽(yáng)性反應(yīng)為綠色熒光。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量熒光強(qiáng)度并定位分析。

    1.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-21、PDCD4、C-MYC和CCND1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

    各組處理后的細(xì)胞根據(jù)按照GREEN spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA。按照Takara RNA PCR Kit(AMY)Ver.3.0說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA的第1鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析、DNA吸光度掃描檢測(cè);顯色條帶圖像分析系統(tǒng)(Alpha Imager 2 000)檢測(cè)其積分吸光度值,與內(nèi)參β-actin條帶的比值為mRNA表達(dá)水平參數(shù)。正常人皮膚成纖維細(xì)胞和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中檢測(cè)miR-21的表達(dá),miR-21的基因表達(dá)檢測(cè)是以U6小RNA為內(nèi)參。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-21 mimic組和miR-21 Inhibitor組檢測(cè)PDCD4的mRNA表達(dá),空白對(duì)照組、PDCD4-pGC-Fu-GFP組和pGC-Fu-GFP組檢測(cè)C-MYC和CCND1的mRNA表達(dá)。所用引物均由上海生工有限公司合成。具體引物序列表1。

    1.7 Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)

    收獲各組細(xì)胞,加入裂解液提取蛋白,BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白/樣本,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉過夜。封閉完畢后PBST洗膜5次,分別加一抗(所用的一抗稀釋比例分別為抗體PDCD4 1:2000;抗體C-MYC 1:1000;抗體CCND1 1:1000;抗體p-Akt 1:1000;抗體JNK1 1:1000),37℃反應(yīng)1.5 h,PBS洗膜5次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,37℃反應(yīng)1h,PBS洗膜5次。染色,曝光,采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影,Quantity One Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)(x±s)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較釆用LSD法,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 所有所有檢測(cè)基因具體引物序列

    2 結(jié)果

    2.1正常成纖維細(xì)胞和HSF中miR-21的表達(dá)檢測(cè)

    與人正常皮膚成纖維細(xì)胞相比,HSF細(xì)胞中miR-21的表達(dá)顯著增加(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

    2.2miR-21調(diào)控HSF細(xì)胞增殖

    與空白對(duì)照組相比,miR-21 Inhibitor組中HSF細(xì)胞增殖顯著受到抑制(圖2),miR-21 mimic組中HSF細(xì)胞增殖顯著增加,陰性對(duì)照組無明顯差異。2.3 miR-21調(diào)控HSF細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)

    圖1 GM0639和HSF細(xì)胞中miR-21表達(dá)量檢測(cè)

    與空白對(duì)照組相比,miR-21 Inhibitor組中HSF細(xì)胞內(nèi)PDCD4的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。miR-21 mimic組中HSF細(xì)胞內(nèi)PDCD4的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著降低,免疫熒光強(qiáng)度也降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3),陰性對(duì)照組中無明顯差異。

    圖2 miR-21對(duì)HSF細(xì)胞增殖的影響

    2.4 PDCD4過表達(dá)抑制HSF細(xì)胞增殖

    與空白對(duì)照組相比,PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞增殖顯著受到抑制(圖4),pGC-Fu-GFP組無明顯差異。

    圖3 miR-21對(duì)HSF細(xì)胞中PDCD4表達(dá)的影響

    2.5 PDCD4過表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表達(dá)

    圖4 過表達(dá)PDCD4對(duì)HSFb細(xì)胞增殖的影響

    與空白對(duì)照組相比,PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的基因表達(dá)(P<0.05)和蛋白表達(dá)都顯著減少(圖5),pGCFu-GFP組無明顯差異。

    2.6 PDCD4過表達(dá)抑制PI3K/Akt通路

    與空白對(duì)照組相比,PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞PI3K/AKt通路中相關(guān)蛋白pAKt、JNK1的蛋白表達(dá)顯著減弱(圖6),Ly294002組中pAKt、JNK1的蛋白表達(dá)也顯著減弱,pGC-Fu-GFP組無明顯差異。

    3 討論

    增生性瘢痕是人體對(duì)創(chuàng)傷產(chǎn)生過度愈合反應(yīng)的結(jié)果,是人體創(chuàng)傷、炎癥、燒傷、外傷或自發(fā)的一種過度的皮膚纖維增生性疾病,以成纖維細(xì)胞增殖旺盛、細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積,膠原纖維排列紊亂為主要病理特征[3,8]。目前臨床上對(duì)于增生性瘢痕還沒有十分滿意的治療方案。由于成纖維細(xì)胞參與了瘢痕形成的整個(gè)過程,抑制成纖維細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化對(duì)于瘢痕治療有重要意義[9]。

    圖5 過表達(dá)PDCD4對(duì)HSF細(xì)胞中C-MYC和CCND1表達(dá)的影響

    圖6 過表達(dá)PDCD4對(duì)PI3K/AKt通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    miRNA是一種長(zhǎng)約19-22nt的非編碼RNA,在基因表達(dá)調(diào)控方面具有廣泛和普遍的作用,參與調(diào)節(jié)正常生理過程及病理過程,如器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的愈合以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等,它幾乎參與了調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié),例如細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[10]。已經(jīng)有研究報(bào)道m(xù)iR-21在心衰、間質(zhì)纖維化和心肌肥厚的成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)失調(diào)可能調(diào)控肺纖維化的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路[11-12]。通過上述文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)miR-21是對(duì)膠原等ECM合成起促進(jìn)作用的一類miRNA分子,在纖維化疾病中具有重要調(diào)控作用。在我們的研究中也證實(shí)了miR-21在HSF細(xì)胞中的表達(dá)量比正常皮膚成纖維細(xì)胞中顯著增加。PDCD4是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)的抑癌基因,同時(shí)是miR-21調(diào)控的靶基因[13]。本研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-21之后,HSF細(xì)胞中PDCD4表達(dá)顯著下降,同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞增殖。抑制miR-21表達(dá)之后,能夠顯著降低HSF細(xì)胞的增殖以及增加PDCD4的表達(dá)量。這表明miR-21的高表達(dá)能夠促進(jìn)瘢痕的形成,抑制miR-21表達(dá)能夠抑制瘢痕形成,臨床上可以通過基因干擾技術(shù)下調(diào)miR-21的表達(dá)來減少瘢痕的發(fā)生。

    PI3K/Akt信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一,其在維持細(xì)胞的正常生理功能如生長(zhǎng)、分化、代謝及細(xì)胞骨架重排中起著關(guān)鍵的作用[14]。PI3K/Akt通路已被證實(shí)廣泛存在于人體的多個(gè)生理功能中,大量證據(jù)說明激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抗細(xì)胞凋亡作用,而且這一通路與增生性疾病有著緊密的聯(lián)系。然而,有關(guān)在體外實(shí)驗(yàn)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與增生性瘢痕的相關(guān)性研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。Bao[15]等發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而減少肝癌細(xì)胞MHCC-97H的增殖與遷移。這表明miR-21與PI3K/ Akt通路在細(xì)胞增殖中具有密切協(xié)調(diào)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21表達(dá)之后,PDCD4表達(dá)上調(diào)。構(gòu)建含有PDCD4片段的慢病毒載體感染HSF使HSF細(xì)胞過表達(dá)PDCD4基因,抑制了HSF細(xì)胞的增殖,顯著減少了細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表達(dá),同時(shí)降低PI3K/ Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-AKt和JNK1的表達(dá),這與使用Ly294002阻斷PI3K/Akt通路后所降低p-AKt和JNK1蛋白表達(dá)的作用一致。因此,我們推斷下調(diào)miR-21之后能夠上調(diào)靶基因PDCD4表達(dá),通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而抑制HSF細(xì)胞增殖。

    綜上所述,在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中,miR-21呈現(xiàn)高表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞增殖和瘢痕的形成。通過干擾miR-21的表達(dá)之后,能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抑癌基因PDCD4的表達(dá),通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞增殖,減少瘢痕的發(fā)生,這對(duì)于臨床上應(yīng)用miR-21靶向分子治療增生性瘢痕提供了理論依據(jù)。

    [1]李戰(zhàn),農(nóng)曉琳,李佳荃,等.青蒿琥酯對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探討[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014,30(7):947-951.

    [2]TanJ,HeW,LuoG,etal.Involvementofimpaireddesmosomerelated proteins in hypertrophic scar intraepidermal blister formation[J].Burns,2015,41(7):1517-23.

    [3]Taghiabadi E,Mohammadi P,Aqhdami N,et al.Treatment of HypertrophicScarinHumanwithAutologous Transplantation of Cultured Keratinocytes and Fibroblasts along with Fibrin Glue[J].Cell J,2015,17(1):49-58.

    [4]郭文平,趙忠芳.瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的現(xiàn)代治療機(jī)制[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(16):130-132.

    [5]Dattaroy D,Pourhoseini S,Das S,et al.Micro-RNA 21 inhibition of SMAD7 enhances fibrogenesis via leptinmediated NADPH oxidase in experimental and human nonalcoholic steatohepatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2015,308(4):298-312.

    [6]Yao Q,Cao S,Li C,et al.Micro-RNA-21 regulates TGF-betainduced myofibroblast differentiation by targeting PDCD4 in tumor-stroma interaction[J].Int J Cancer,2011,128(8):1783-1792.

    [7]Liu G,F(xiàn)riggeri A,Yang Y,et al.miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis[J].J Exp Med,2010,207(8):1589-1597.

    [8]Wang H,Gao W,Kong M,et al.Preliminary study of the effect of abnormal savda munziq on TGF-beta1 and Smad7 expression in hypertrophic scar fibroblasts[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(1):519-525.

    [9]Zhang YF,Zhou SZ,Cheng XY,et al.Baicalein attenuates hypertrophicscarformationviainhibitionofthe transforming growth factor-beta/Smad2/3 signalling pathway[J].Br J Dermatol,2015:24.

    [10]MushtaqG,GreigNH,AnwarF,etal.miRNAsas CirculatingBiomarkersforAlzheimer'sDiseaseand Parkinson's Disease[J].Med Chem,2015:30.

    [11]Tong BD,Xiao MY,Zeng JX,et al.MiRNA-21 promotes fibrosis in orbital fibroblasts from thyroid-associated ophthalmopathy[J].MolVis,2015,30(21):324-334.

    [12]Wang JJ,Wang ZY,Chen R,et al.Macrophage-secreted Exosomes Delivering miRNA-21 Inhibitor can Regulate BGC-823 Cell Proliferation[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(10):4203-4209.

    [13]Wang G,Wang JJ,Tang HM,et al.Targeting strategies on miRNA-21 and PDCD4 for glioblastoma[J].Arch Biochem Biophys,2015,5(580):64-74.

    [14]Salasc F,Mutuel D,Debaisieux S,et al.Role for the PI3K/ Akt/TOR pathway during Ambidensovirus infection of insect cells[J].J Gen Virol,2015:26.

    [15]Bao L,Yan Y,Xu C,et al.MicroRNA-21 suppresses PTEN and hSulf-1 expression and promotes hepatocellular carcinoma progression through AKT/ERK pathways[J]. Cancer Letters,2013,337(2):226-236.

    編輯/張惠娟

    Down-regulation of miR-21 inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways via PDCD4

    MU Sheng-zhi,SUN Yao-wen,WANG Guo-dong
    (Department of Burn and Plastic and Cosmetic Surgery,Shaanxi Province People's Hospital,Xi'an 710068,Shaanxi,China)

    ObjectiveTo study the effect and mechanism of microRNA-21 on the expression of PDCD4 and the proliferation of HSF cells.Methods The level of miR-21 in GM0639 and HSF cells was detected with qRT-PCR.HSF cells were divided into seven groups:control group,negative control group(transfected with no-related siRNA),miR21 Inhibitor group(transfected with miRNA-21 inhibitors),miR-21 mimic group(transfected with miR-21 mimic),PDCD4-pGC-Fu-GFP group,pGCFu-GFP group and Ly294002 group.The cells proliferation was detected by MTT after the transfection with48h.TheexpressionofPDCD4geneandproteininthecellsweredetectedby immunofluorescence,Real-time PCR and Western-blot methods respectively.The expression of CMYC and CCND1 as well as p-Akt and JNK1 in the group of control,pGC-Fu-GFP and PDCD4-pGC-Fu-GFP were detected by Real-time PCR and Western blot,respectively.Results miR-21 was overexpressed in HSF cells.Compared with the group of control,down-regulation miR-21 obviously inhibited the HSF cells proliferation and induced the expression of PDCD4.PDCD4 overexpression inhibited the HSF cells proliferation and decreased the expression of C-MYC,CCND1,p-Akt and JNK1.ConclusionDown-regulation of miR-21 could induce the PDCD4 overexpression,which inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways.

    microRNA-21;PDCD4;hypertrophic scar fibroblasts;cell proliferation;inhibit;PI3K/Akt

    R619+.6

    A

    1008-6455(2015)23-0039-05

    孫要文,主任醫(yī)師;主要研究方向:瘢痕整形修復(fù),創(chuàng)傷修復(fù),自體脂肪移植;單位:陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科,陜西西安友誼西路256號(hào),郵編:710068

    2015-10-21

    2015-12-15

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