維生素D減緩牙周炎癥反應的實驗研究

黃玲燕

（咸寧市中心醫(yī)院·同濟咸寧醫(yī)院口腔科　湖北　咸寧　437100）

維生素D減緩牙周炎癥反應的實驗研究

黃玲燕

（咸寧市中心醫(yī)院·同濟咸寧醫(yī)院口腔科湖北咸寧437100）

目的：初步探討維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞炎癥反應的抑制作用，為牙周病的防治提供一定的依據(jù)。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附實驗、實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)檢測維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α水平的影響。結果：維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞分泌炎癥因子白介素1β、腫瘤壞死因子α有顯著的抑制作用，最低有效濃度為6.25μg/ml，且隨著維生素D濃度的增加，抑制作用越明顯。結論：維生素D是一種潛在的防治牙周炎癥反應的藥物。

維生素D；1，25-二羥維生素D3；牙周炎；白介素1β；腫瘤壞死因子α

牙周炎是以炎癥因子滲出、牙周支持組織破環(huán)為主要病理表現(xiàn)的慢性、廣泛性炎癥反應，是成人失牙的首要原因。已被醫(yī)學界定論為繼癌癥、心腦血管疾病之后，威脅人類身體健康的第三大殺手，也是口腔健康的“頭號殺手”。流行病學研究結果顯示牙周炎是加重心血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多種系統(tǒng)性疾病進程，影響預后的重要誘因[1]。發(fā)病機制與免疫、炎癥反應密切相關?，F(xiàn)已證實革蘭氏陰性厭氧菌——牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎發(fā)生、發(fā)展的主要病原菌，約占牙周炎患者95%以上的病變活動區(qū)域[2]。牙齦卟啉單胞菌能利用多種毒力因子如半胱氨酸蛋白酶（常指牙齦素）、菌毛和脂多糖侵襲牙周組織和宿主免疫系統(tǒng)。維生素D是保持骨骼健康，調節(jié)機體免疫、炎癥反應的重要元素，不僅與鈣吸收、破骨細胞活性密切相關，還參與調節(jié)基因表達、蛋白合成和免疫/炎癥反應[3]。本實驗的目的就是研究維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的人牙周膜細胞炎癥反應的影響。

1　材料和方法

1.1材料

維生素D代謝物1，25-二羥維生素D3[1，25（OH）2D3]購自Sigma公司，牙齦卟啉單胞菌購自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室。1，25-二羥維生素D3溶液的配置：將晶體用95%的乙醇配置成10mg/ml的母液，置于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋成各種濃度梯度（100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μg/ml）的工作液。

1.2實驗方法1.2.1實驗菌液的準備、細菌復蘇及培養(yǎng)：將牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株復蘇并接種于含有20μM氯高鐵血紅素和0.0001%維生素K的Todd-Hewitt肉湯（THB-HK）中，在37℃厭氧環(huán)境下（CO210%、N290%）培養(yǎng)48h，經(jīng)形態(tài)學鑒定后傳代培養(yǎng)24h，備用。

1.2.2人牙周膜成纖維細胞的培養(yǎng)：采取酶消化原代培養(yǎng)法。刮取臨床因正畸或阻生拔除牙齒的根中1/3的健康牙周膜，立即投入含三抗的D-Hanks內。清洗刮取的牙周膜，去除血污及不需要組織。加入0.1%膠原酶37℃消化30min，加入含10%FBS的DMEM終止消化，二層無菌紗布濾除組織塊，1 000ppr 5min離心去上清，加入含10%FBS的DMEM進行培養(yǎng)。4～8代用于實驗。

1.2.3維生素D對人牙周膜成纖維細胞活性的影響：消化離心收集人牙周膜細胞，臺盼藍計數(shù)調整細胞密度為106/ml接種于96孔板中，培養(yǎng)2h待細胞貼壁后添加不同濃度的維生素D和厭氧培養(yǎng)了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液，繼續(xù)孵育72h。接著每孔添加10μl MTT溶液置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，再每孔添加100μl溶解溶液孵育過夜。最后使用分光光度儀進行讀數(shù)。

1.2.4牙齦卟啉單胞菌誘導人牙周膜成纖維細胞發(fā)生炎癥反應：消化離心收集人牙周膜細胞，臺盼藍計數(shù)調整細胞密度為106/ml接種于24孔板中，培養(yǎng)過夜。次日，在孔板中添加200μl不同濃度的維生素D置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。將厭氧培養(yǎng)了24h的牙齦卟啉單胞菌的菌液轉移至塑料離心管，10 000ppr，10min，4℃離心，棄上清液后用含1%FBS的DMEM清洗2次。測 OD660，并根據(jù)孔板內牙周膜細胞密度計算感染倍數(shù)（multiplicityof infection，MOI）為100時，所需細菌混懸液體積（OD660=1表明細菌密度為2.5×109/ml）。將感染倍數(shù)為100的菌液添加到孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)液置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨rizol裂解細胞，酚/氯仿法提取細胞總RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ELISA檢測IL-1β、TNF-α蛋白的表達：按ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書步驟操作：使用標準品繪制標準曲線，取反應板加樣、并按說明依次加入一抗、酶標抗體及底物工作液，最后加入反應終止液，于酶標儀以波長450nm讀取各孔光密度值。通過標準曲線和ELISAcalc軟件計算各樣本含量。

1.2.6 qPCR檢測IL-1β、TNF-αmRNA的表達：提取的總RNA經(jīng)濃度測定、純度鑒定后，逆轉錄為cDNA，按照反應體系依次添加SYBR Green染料、引物、dNTP、cDNA、Taq酶及去離子水，配制PCR反應溶液。置于Real-time PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：95℃3min預變性，然后按照95℃30s變性，58℃1min退火，72℃1min，共40做個循環(huán)，最后72℃7min延伸。

2　結果

2.1維生素D對人牙周膜成纖維細胞活性的影響

如圖1所示：與空白對照組相比，牙齦卟啉單胞菌組牙周膜成纖維細胞的增殖被顯著抑制，當維生素D濃度為3.125和6.25μg/ml時，牙齦卟啉單胞菌引起的細胞毒性作用非常顯著?？梢姡例l卟啉單胞菌顯著抑制人牙周膜成纖維細胞的增殖，當維生素D濃度≥12.5μg/ml能減弱牙齦卟啉單胞菌引起的細胞毒性。單純的維生素D不影響人牙周膜成纖維細胞的活性。

2.2維生素D對牙齦卟啉單胞菌誘導的IL-1β、TNF-α表達水平的影響

圖1　維生素D對人牙周膜成纖維細胞活性的影響

圖2　ELISA檢測維生素D對人牙周膜成纖維細胞分泌IL-1β和TNF-α的影響

圖3　qPCR檢測維生素D對人牙周膜成纖維細胞分泌IL-1β和TNF-α的影響

ELISA及qPCR檢測結果均顯示牙齦卟啉單胞菌顯著增加人牙周膜成纖維細胞分泌IL-1β和TNF-α，當維生素D濃度≥6.25μg/ml時，能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的炎癥介質的分泌（如圖2、3）。

3　討論

維生素D是由暴露于紫外線的皮膚合成或從日常飲食中直接獲取的開環(huán)甾類化合物。具有鈣化醇（維生素D2）和膽鈣化醇（維生素D3）兩種形式。這兩種形式的維生素均在肝臟代謝為25-羥基維生素D并在腎臟被1-羥化酶轉化為其活性形式1，25-二羥維生素D。因此本實驗選取維生素D的活性形式作為研究試劑。

牙周炎伴隨的牙槽骨破壞主要起源于病原菌誘導的過強炎癥反應。IL-1β和TNF-α是破骨細胞活化的主要因子。馬寧等人在大耳白兔牙周組織注射IL-1β、TNF-α，能成功建立典型而穩(wěn)定，近似臨床牙周炎表現(xiàn)的實驗動物模型[4]。尹麗媛等采用RT-PCR技術檢測成人牙周炎患者牙齦組織中IL-1β、TNF-αmRNA表達水平的結果顯示：其在病變牙齦的表達強度顯著高于正常牙齦，因此推測IL-1β、TNF-α表達與牙周炎發(fā)病機理密切相關，有效抑制其分泌與合成有利于牙周炎的治療與預后[5]。本實驗研究結果顯示牙齦卟啉單胞菌能顯著增加人牙周膜細胞分泌、合成IL-1β和TNF-α，誘導細胞炎癥反應，能在細胞水平模擬牙周炎的病理狀態(tài)。

流行病學觀察顯示牙周健康與維生素D的攝入量密切相關。與每日攝入≥800IU的人群相比，攝入量≤400IU的人群更容易罹患重度牙周疾病并伴隨中重度的牙槽骨破壞[6]。25-羥基維生素D和1，25-二羥維生素D血清濃度偏低者牙周炎和牙喪失的發(fā)病率更高[7-8]。維生素D不僅能夠增加骨密度，抑制骨吸收，減少牙喪失[9-10]，還能通過其抗炎活性發(fā)揮免疫調節(jié)作用[11-12]。本實驗研究結果也顯示1，25-二羥維生素D能顯著抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的IL-1β和TNF-α的分泌。盡管大量研究顯示維生素D在保持骨密度，減少慢性炎癥疾病等方面作用顯著，但是維生素D缺乏和不足在人群中仍然廣泛存在。因此政府呼吁不同年齡段的人群每日口服維生素D 200-600IU[13]。此外，適當日光浴、進食富含維生素D的食物如魚肝油均是有效的途徑。

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編輯/張惠娟

The research of vitamin D inhibiting the inflammation of periodontal tissues

HUANG Ling-yan
（Department of Stomatology，Xianning Center Hospital of Tongji，Xianning 437100，Hubei，China）

Objective To investigate the inhibitory effect of vitamin D on Porphyromonas gingivalisinduced inflammation of human periodontal ligament cells，provide evidence for the prevention of periodontitis.Methods The enzyme linked immunosorbent assay and real-time quantitative PCR detecting system were used to observe the effects of vitamin D on the secretion of interleukin 1β and tumor necrosis factor α induced by Porphyromonas gingivalis.Results Vitamin D could inhibit the production of interleukin 1β and tumor necrosis factor α significantly.The minimum inhibitory concentration was 6.25μg/ml.With the increase of concentration of vitamin D，the inhibitory effect was enhanced.Conclusion Vitamin D may be a potential medicine of periodontitis.

vitamin D；1，25-dihydroxy vitamin D3；periodontitis；interleukin 1β；tumor necrosis factor α

R781.4+2

A

1008-6455（2015）23-0035-04

2015-09-28

2015-11-27