維吾爾藥異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及膠原蛋白表達(dá)的影響

李加輔，朱瑞祥，許言文，錢　璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科　新疆　烏魯木齊　830054）

·基礎(chǔ)研究·

維吾爾藥異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及膠原蛋白表達(dá)的影響

李加輔，朱瑞祥，許言文，錢璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科新疆烏魯木齊830054）

目的：探討維吾爾藥異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HFs）增殖抑制作用及對(duì)相關(guān)膠原蛋白合成的影響。方法：對(duì)HFs進(jìn)行體外培養(yǎng)并給予不同濃度的ASMq-TF處理，然后，通過(guò)CCK-8檢測(cè)其細(xì)胞增殖情況，通過(guò)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果：ASMq-TF能夠顯著抑制HFs的增殖及抑制膠原蛋白的表達(dá)。討論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASMq-TF通過(guò)促進(jìn)SMAD7合成及減少CollagenⅠ分泌等抑制HFs增殖。［關(guān)鍵詞］異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；體外培養(yǎng)；膠原蛋白；增殖

創(chuàng)面愈合是一個(gè)由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的即復(fù)雜又有高度協(xié)調(diào)性的過(guò)程，大概可以分為三個(gè)過(guò)程：炎癥期、肉芽組織形成期及重建期，且任何環(huán)節(jié)出錯(cuò)都會(huì)導(dǎo)致不良后果：①創(chuàng)面延遲愈合；②增生性瘢痕；③瘢痕疙瘩[1-4]。增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）作為一種諸如外傷、燒傷、外科手術(shù)等創(chuàng)面的過(guò)度愈合，越來(lái)越多的證據(jù)都指出其發(fā)病機(jī)制和成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，侵襲性加強(qiáng)，膠原蛋白合成增加有關(guān)[5-8]。維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）是從維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑（Abnormal savda munziq，ASMq）中提取的活性成分[9]。以往的研究結(jié)果表明，ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡等作用，可以減輕肝纖維化、肺纖維化等纖維化疾病。國(guó)內(nèi)外已有很多報(bào)道，多種黃酮類化合物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用[10-14]。因此本文研究ASMq-TF對(duì)HFs的增殖和膠原的合成是否具有抑制作用，旨在進(jìn)一步解釋ASMq對(duì)瘢痕的抑制作用，從而為維藥在臨床預(yù)防和治療HS提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

表2　相關(guān)引物

1　材料和方法

1.1試劑和化學(xué)品

異常黑膽質(zhì)成熟劑購(gòu)于新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：Z65020166），并經(jīng)水提取分離得到總黃酮（含量為1.62%）；培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS），胰酶，PBS緩沖液，青霉素和鏈霉素購(gòu)自于美國(guó)Hyclone公司；二甲基亞礬（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8購(gòu)自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所用5塊HS組織（其中男3例、女2例，均為漢族，年齡23～44歲。平均31.4歲）均來(lái)源于整形外科術(shù)后切除組織，經(jīng)病理檢查確診為HS。本實(shí)驗(yàn)中所有患者均無(wú)系統(tǒng)性疾病，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審議通過(guò)，所有提供標(biāo)本患者均簽署知情同意書。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將術(shù)中切取的組織標(biāo)本，在超凈臺(tái)內(nèi)以無(wú)菌PBS液漂洗2遍，去除殘留的血液及其他混雜異物，小心仔細(xì)的切除表皮及脂肪組織，將組織標(biāo)本修剪成小塊，均勻接種于100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning公司），而后緩慢加入含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)10%）及青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，含CO2（體積分?jǐn)?shù)為5%）及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d更換一次培養(yǎng)基。大約7～9d成纖維細(xì)胞從組織塊周圍爬出，待組織塊周圍細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，取出培養(yǎng)皿中組織塊并用胰酶將細(xì)胞消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選擇3～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在筆者以下的實(shí)驗(yàn)中HFs在加藥干預(yù)前均經(jīng)過(guò)無(wú)血清DMEM 24h均一化處理，然后在加入含10%FBS的DMEM進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

1.3.1細(xì)胞分組：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～6代的HFs分為：①空白對(duì)照組：加入等體積的培養(yǎng)液；②實(shí)驗(yàn)組：分別加入濃度為320、340、360、380、400μg/ml的ASMq-TF；③陽(yáng)性對(duì)照組：加入濃度為250μg/ml的5-FU氟尿嘧啶（5-FU）。每組設(shè) 3個(gè)平行復(fù)孔，以便觀察與檢測(cè)。各組于加藥48h后進(jìn)行觀察及實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)ASMq-TF、5-FU對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用：對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，HFs經(jīng)傳代后以5×103個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，并加入200μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后用無(wú)血清的DMEM饑餓過(guò)夜進(jìn)行均一化處理；根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，加藥干預(yù)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。連續(xù)檢測(cè)加藥后第1天至第11天同一時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞增殖情況，于檢測(cè)前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后用酶標(biāo)儀讀取各孔在490nm處光波波長(zhǎng)的吸光值（OD值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，后繪制各組的HFs的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：將HFs以5×104個(gè)接種在60mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)預(yù)設(shè)方法干預(yù)24h后應(yīng)用Trizol（美國(guó)TriPure Isolation Reagent公司）液裂解細(xì)胞，后經(jīng)氯仿、異丙醇進(jìn)一步提取經(jīng)過(guò)處理的成纖維細(xì)胞總mRNA，用紫外分光光度儀分別測(cè)定波長(zhǎng)為260nm和280nm的光密度值，確定RNA含量和純度。相關(guān)引物設(shè)計(jì)如下（詳見(jiàn)表2），用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行cDNA的合成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，而后對(duì)凝膠進(jìn)行圖像的采集，用Photoshop讀取灰度值。

1.3.4 Western blot檢測(cè)Smad7及膠原的表達(dá)：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以2×105個(gè)接種于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，加入不同藥物培養(yǎng)后，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo公司）對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量，后對(duì)蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），在將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國(guó)Roche公司）上并用5%的脫脂奶粉封閉，相關(guān)一抗如下：Collagen I、SMAD7、GAPDH（美國(guó)Santa Cruz公司），用BCA蛋白定量分析試劑盒（美國(guó)Pierce公司）對(duì)一抗孵育后的PVDF膜進(jìn)行二抗孵育及化學(xué)顯色，最后用Quantity One軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）采集圖像，用Photoshop讀取灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 11.5，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2　結(jié)果

2.1 CCK-8檢測(cè)HFs的增殖活性

圖1　CCK8法檢測(cè)不同處理組HFs的增殖情況

圖2　RT-PCR檢測(cè)CollagenⅠmRNA表達(dá)情況

圖3　RT-PCR檢測(cè)SMAD7 mRNA表達(dá)情況

見(jiàn)圖1，可以看出：與空白對(duì)照組相比，不同濃度ASMq-TF組及5-Fu組的HFs增殖活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組OD值在第10天達(dá)到檢測(cè)上限值3.5，隨著實(shí)驗(yàn)組藥物濃度增加，對(duì)HFs的抑制作用增強(qiáng)，在320～400μg/ml濃度間具有藥物濃度依賴性?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞總數(shù)在第10天達(dá)到平臺(tái)期，320μg/ml ASMq-TF組在第10天達(dá)到平臺(tái)期，但其細(xì)胞總數(shù)較空白對(duì)照組少。340μg/mlASMq-TF組細(xì)胞數(shù)在第7天開(kāi)始下降，360μg/mlASMq-TF組在第6天開(kāi)始有所減少，380μg/mlASMq-TF組在第 5天即開(kāi)始減少；400μg/mlASMq-TF組在第3d即開(kāi)始減少；5-Fu組在第2天開(kāi)始減少。實(shí)驗(yàn)表明，ASMq-TF和5-Fu作用類似，對(duì)HFs具有增殖抑制作用，這一抑制作用表現(xiàn)出濃度時(shí)間依賴性（P＜0.05），和空白對(duì)照組相比，ASMq-TF濃度為340～380μg/ml時(shí)抑制作用較明顯（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR檢測(cè)各預(yù)設(shè)組HFs相關(guān)mRNA水平變化

見(jiàn)圖2、3。圖2及圖3表明：實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組相比，ASMq-TF能抑制CollagenⅠmRNA水平的表達(dá)、促進(jìn)SMAD7 mRNA的表達(dá)，且都具有濃度依賴性（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組表明：本實(shí)驗(yàn)中ASMq-TF和5-Fu在CollagenⅠmRNA的表達(dá)水平上表現(xiàn)出相似的抑制作用，同時(shí)兩者對(duì)SMAD7 mRNA的表達(dá)都具有促進(jìn)作用。

2.3 Western blot檢測(cè)不同處理組相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

見(jiàn)圖4、5。如圖4所示：和空白對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組ASMq-TF表現(xiàn)出和陽(yáng)性對(duì)照組類似的抑制HFs CollagenⅠ蛋白表達(dá)的作用（P＜0.05）。相對(duì)于空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中ASMq-TF能夠上調(diào)HFs SMAD7蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05），且具有濃度依賴性；陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)組類似的作用（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖4　Western blot檢測(cè)各組CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況

圖5　Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組SMAD7蛋白表達(dá)情況

3　討論

HS是一種以成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度表達(dá)為特點(diǎn)的一種常見(jiàn)皮膚疾病，嚴(yán)重影響患者的美觀甚至心理健康，而目前臨床上尚沒(méi)有單一的藥物能夠完全防治瘢痕的增生[15]。筆者的實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究ASMq-TF對(duì)于HFs的作用，從而為防治增生性瘢痕提出一種新的方法或途徑。

AMSq是維吾爾醫(yī)藥的重要組成部分，由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青蘭子、黑種草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、羅勒子、蜀葵子、茴芹果、駱駝蓬子等13味維藥調(diào)制而成。隨著維吾爾醫(yī)學(xué)對(duì)藥理學(xué)和藥效學(xué)的不斷研究，ASMq已逐漸得到了越來(lái)越多的關(guān)注，有研究表明，ASMq-TF對(duì)肝癌、淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用；并可以轉(zhuǎn)逆肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu多藥耐藥性，從而抑制癌細(xì)胞的增生[12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)離體成纖維體細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)ASMq-TF能夠顯著抑制HFs的增殖，增加SMAD7的表達(dá)及顯著降低I型膠原的合成。

SMAD7是一種抑制型蛋白，它能夠阻止SMAD2及SMAD3的磷酸化，進(jìn)而抑制HFs增殖及降低CollagenⅠ的合成[16]。在目前的研究中筆者發(fā)現(xiàn)ASMq-TF能夠明顯增加HFs中SMAD7的表達(dá)，提示部分阻斷TGF-β/SMAD通路可能是ASMq-TF的作用機(jī)制之一，然而具體機(jī)制尚有待于更深一步的研究。

［1］Daniel Harper，Alistair Young，Clare-Ellen McNaught.The physiology of wound healing［J］.Surgery，2014，32（9）：445-450.

［2］Kaur IP，Sandhu SK，Deol PK，et al.Material Couture for Wound Healing and Regeneration：an Overview［J］.Current Pharmaceutical Design，2015，21（12）：1556-1574.

［3］Falanga V1.Wound healing and its impairment in the diabetic foot［J］.Lancet，2005，366（9498）：1736-1743.

［4］Velnar T1，Bailey T，Smrkolj V.The wound healing process：an overview of the cellular and molecular mechanisms［J］.JInt Med Res，2009，37（5）：1528-1542.

［5］Tredget EE，Levi B，Donelan MB.Biology and principles of scar managementandburnreconstruction［J］.Surgical Clinics of NorthAmerica，2014，94（4）：793-815.

［6］Wolfram D1，Tzankov A，Pülzl P，et al.Hypertrophic scars and keloids--a review of their pathophysiology，risk factors，and therapeutic management［J］.Dermatol Surg，2009，35（2）：171-81.

［7］Wolfram D，Tzankov A，Pulzl P，et al.Hypertrophic scars and keloids--a review of their pathophysiology，risk factors，and therapeutic management［J］.Dermatol Surg，2009，35（2）：171-181.

［8］高偉成，杜金，馬娟，等.維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)兔耳增生性瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.新疆醫(yī)學(xué)，2012，42（9）：11-14.

［9］木拉提·克扎衣別克，阿不都熱依木·玉蘇甫，哈木拉提·吾甫爾，等.異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮和總酚的含量測(cè)定［J］.李時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（3）：519-522.

［10］高偉成，王虎軍，喬星，等.異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的影響［J］.中華整形外科雜志，2013，29（6）：418-421.

［11］瑪依努爾·艾力，哈木拉提·吾甫爾，維吾爾藥異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥性的作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（9）：31-33.

［12］田偉，趙永青，彭海平，等.水杉總黃酮對(duì)IGF1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12（4）：286-288.

［13］包俊萍，金明，楊雨民.廣棗總黃酮對(duì)體外培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞I、III型膠原mRNA及蛋白表達(dá)的影響［J］.醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（1）：136-141.

［14］Stipcevic T1，Piljac J，Vanden Berghe D.Effect of Different Flavonoids on Collagen Synthesis in Human Fibroblasts［J］. Plant Foods for Human Nutrition，2006，61（1）：29-34.

［15］Nguyen TT，Moon YH，Ryu YB，et al.The influence of flavonoid compounds on the in vitro inhibition study of a human fibroblast collagenase catalytic domain expressed in E.Coli［J］.Enzyme Microb Technol，2013，52（1）：26-31.

［16］Yang Y，Gao X，Wang X，et al.Total Flavonoids of Fructus Chorspondiatis inhibits collagen synthesis of cultured rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin II：Correlated with NO/cGMP signaling pathway［J］.Eur J Pharm Sci，2012，47（1）：75-83.

編輯/張惠娟

Effects of total flavone of abnormal savda munziq on the proliferation and collagen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts

LI Jia-fu，ZHU Rui-xiang，XU Yan-wen，QIAN-Xuan，MA Shao-lin
（Department of Burns and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To evaluate in vitro effect of Abnormal savda munziq-total flavonoids on the proliferation and collagen synthesis of human hypertrophic scar fibroblasts（HFs）.Methods HFs was cultured in vitro and treated with different concentrations of ASMq-TF.Then，the cell proliferation was detected by CCK-8.The expression of collagen was detected by RT-PCR and Western blot.Results ASMq-TF can inhibit the proliferation of HFs and inhibit the expression of collagen proteinⅠ. Conclusion The results of this experiment showed that ASMq-TF inhibited the proliferation of HFs by promoting SMAD7 synthesis and reducing Collagen secretionⅠ.

Abnormal savda munziq-total flavonoids；hypertrophic scar；fibroblasts；in vitro；collagen；proliferation

R619+.6

A

1008-6455（2015）23-0031-05

國(guó)家自然科學(xué)基金，維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕機(jī)制研究（項(xiàng)目編號(hào)：81260291）

馬少林，主任，教授，博士研究生導(dǎo)師；研究方向：增生性瘢痕防治，組織器官缺損修復(fù)再造；通信地址：新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市鯉魚(yú)山路137號(hào)，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，郵編：830054

2015-09-18

2015-11-27