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    新加香薷飲對(duì)濕熱環(huán)境下流感病毒性肺炎小鼠治療作用的比較研究

    2016-02-15 06:06:53鄧力聶嬌逄蓬鄭柯陳孝銀
    新中醫(yī) 2016年2期
    關(guān)鍵詞:病毒組香薷利巴韋

    鄧力,聶嬌,逄蓬,鄭柯,陳孝銀

    暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系,廣東 廣州 510632

    新加香薷飲對(duì)濕熱環(huán)境下流感病毒性肺炎小鼠治療作用的比較研究

    鄧力,聶嬌,逄蓬,鄭柯,陳孝銀

    暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系,廣東 廣州 510632

    目的:觀察比較新加香薷飲對(duì)濕熱環(huán)境下流感病毒性肺炎小鼠的治療作用。方法:42只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成6組,正常環(huán)境組每天正常飼養(yǎng),濕熱環(huán)境各組人工氣候箱濕熱環(huán)境中飼養(yǎng)7天。需要病毒攻擊的各組,使用FM1病毒滴鼻。藥物組灌胃治療,利巴韋林用量為0.07 g/(kg·d),新加香薷飲用量為23 mL/(kg·d)。通過(guò)小鼠體重變化、肺部組織HE染色、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn),測(cè)定與比較新加香薷飲對(duì)濕熱環(huán)境下流感病毒性肺炎小鼠治療作用效果與機(jī)制。結(jié)果:濕熱環(huán)境一定程度上能促進(jìn)病毒感染后的炎癥反應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利巴韋林和新加香薷飲在病毒感染后具有抗炎效果,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:濕熱環(huán)境對(duì)于流感病毒性肺炎具有促炎作用。新加香薷飲對(duì)濕熱環(huán)境下流感病毒性肺炎小鼠具有抗病毒作用,且效果優(yōu)于利巴韋林。

    流感病毒性肺炎;濕熱環(huán)境;新加香薷飲;動(dòng)物實(shí)驗(yàn);小鼠

    流感病毒是一種常見(jiàn)呼吸道病原體,能感染大量人群和動(dòng)物。其具有傳播快,侵害廣,變異迅速的特點(diǎn)。研究指出濕邪可以降低細(xì)胞免疫功能,增加機(jī)體對(duì)病原微生物的易感性,導(dǎo)致流感病毒發(fā)生的幾率升高[1]。新加香薷飲由香薷、厚樸、金銀花、連翹、扁豆花等5味藥組成,功能祛濕清熱,化濕和中。臨床上主要用于治療暑濕型感冒、中暑、小兒外感發(fā)熱證等[2~4]。研究證實(shí),新加香薷飲中大多藥物都有抗病毒作用的活性成分[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)濕熱環(huán)境與正常環(huán)境對(duì)Th/Treg 細(xì)胞亞群及其所調(diào)控免疫通路的改變比較,研究新加香薷飲抗病毒作用對(duì)T細(xì)胞免疫平衡的影響。進(jìn)一步探討中藥預(yù)防和治療流感的可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6J小鼠42只,8周齡,雌雄各半,購(gòu)于Jackson實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物于無(wú)特殊病菌的恒定溫度和濕度條件下飼養(yǎng)。

    1.2 藥物及試劑 FM1流感病毒鼠肺適應(yīng)株為暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室提供。新加香薷飲(由香薷、厚樸、連翹、香薷各6 g,金銀花、鮮扁豆花各9 g,共6味中藥組成),所有中藥飲片均購(gòu)于廣州老百姓大藥房,并煎制濃縮成含生藥量6 g/mL,喂藥劑量按照小鼠與人的劑量換算公式進(jìn)行計(jì)算。按每鼠23 mL/天給藥制備相應(yīng)藥物濃度。利巴韋林顆粒:50 mg×18袋,葵花藥業(yè)集團(tuán)(衡水得菲爾有限公司),批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字 H20066463。流式細(xì)胞術(shù)所需CD4-FITC,CD25-APC,IL-17-A-PE和Foxp3-APC熒光標(biāo)記抗體以及CD16/CD32抗體購(gòu)買自ebioscience公司,破膜劑,PMA/Ionomycin,Monensin刺激劑為聯(lián)科生物公司產(chǎn)品,小鼠淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊颰BD公司產(chǎn)品。

    1.3 動(dòng)物分組 將42只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成6組:正常環(huán)境組,濕熱環(huán)境組,正常環(huán)境+病毒組,濕熱環(huán)境+病毒組,濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組,濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組。

    1.4 干預(yù)方法 ①正常環(huán)境組每天正常飼養(yǎng),期間自由飲食。②濕熱環(huán)境各組在人工氣候箱濕熱環(huán)境中飼養(yǎng)7天,設(shè)定人工氣候箱條件[溫度:(33±1)℃,濕度:90%,光照度:3000Lx],每天將小鼠放入人工氣候箱內(nèi)12 h,其余時(shí)間置于正常室內(nèi)環(huán)境進(jìn)行飼養(yǎng),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,期間自由飲食;需要病毒攻擊各組,使用FM1病毒經(jīng)乙醚輕度麻醉后進(jìn)行滴鼻,每鼠每50 μL,連續(xù)4天。藥物均在病毒攻擊后48 h開(kāi)始給藥。共給藥5天,每天2次,每次0.2 mL灌胃給藥。③陽(yáng)性藥物利巴韋林,用量為70 mg/kg,病毒感染后48 h給藥。每天2次,每次0.2 mL。④中藥復(fù)方新加香薷飲,用量為20 g/ (kg·d)(含生藥量),病毒感染后48 h灌胃給藥,每天2次,每次0.2 mL。

    2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    干預(yù)結(jié)束后斷頸處死小鼠,解剖摘取氣管、脾和肺進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

    2.1 肺指數(shù) 藥物治療4天后,在小鼠處死前禁食禁水8 h,稱量體重。打開(kāi)胸腔后摘取全肺稱重,按下列公式逐個(gè)計(jì)算,肺指數(shù)=(小鼠肺重/小鼠體重)×100%。

    2.2 肺部組織的光鏡標(biāo)本制備與HE染色 取右肺經(jīng)常規(guī)多聚甲醛固定乙醇梯度脫水后,包埋,切片。在脫蠟和水化后,Harris蘇木精液浸泡3~5 min,自來(lái)水沖洗后于75%鹽酸乙醇中分化數(shù)秒,繼續(xù)沖洗待細(xì)胞核呈藍(lán)色,0.5%伊紅水溶液1~2 min,脫水透明后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu),通過(guò)自動(dòng)成像系統(tǒng)采集圖像。

    2.3 淋巴細(xì)胞分離和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 無(wú)菌取小鼠脾臟組織,制作成單細(xì)胞懸液,使用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,細(xì)胞洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作,上機(jī)檢測(cè)。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    4 結(jié)果

    4.1 各組小鼠一般情況比較 正常小鼠行動(dòng)活躍,毛發(fā)柔順有光澤。濕熱造模后,小鼠精神萎靡,蜷縮,聳毛,呼吸急促,活動(dòng)、飲食飲水量均減少,體重減輕。病毒感染造模后小鼠活動(dòng)度減少,精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,喜歡扎堆,蜷縮,飲食和飲水減少。8周齡小鼠平均體重(21.01±0.89)g。7天后,正常環(huán)境組小鼠體重稍有增加,為(22.16±1.53)g,與7天前比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但7天后正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組小鼠體重下降明顯,分別為(15.37± 2.12)g、(15.77±2.91)g,正常環(huán)境+病毒組與正常環(huán)境組,濕熱環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境組小鼠體重兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物治療后,小鼠精神恢復(fù),毛發(fā)柔順及其他各項(xiàng)表征大致恢復(fù)至正常狀態(tài)。7天后濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組,濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組小鼠體重分別為(17.03±2.40)g與(16.97±1.73)g,但該2組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    4.2 肺指數(shù)檢測(cè) 正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組小鼠肺組織的體積和重量均高于正常環(huán)境組與濕熱環(huán)境組,而正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組小鼠體重較正常環(huán)境組減輕,故采用肺組織與體重的比值即肺指數(shù)來(lái)分析更準(zhǔn)確,肺指數(shù)升高代表肺部滲出更嚴(yán)重。FM1病毒感染4天后濕熱環(huán)境+病毒組小鼠的肺指數(shù)為1.48±0.3,相較于濕熱環(huán)境組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組肺指數(shù)為1.12±0.4,相較于濕熱環(huán)境+病毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    4.3 肺組織病理學(xué)改變 正常環(huán)境組與濕熱環(huán)境組小鼠肺泡大小較一致,支氣管上皮完整,外周未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組、濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整,肺泡間隔較薄,肺泡壁和細(xì)支氣管壁單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量減少,腔內(nèi)無(wú)滲出。正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、細(xì)支氣管等正常的組織結(jié)構(gòu)扭曲、紊亂程度更為嚴(yán)重,支氣管壁上皮明顯脫落,結(jié)締組織增生,肺間質(zhì)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),肺部血管內(nèi)充血嚴(yán)重,支氣管腔內(nèi)可見(jiàn)滲出物,見(jiàn)圖 1。

    圖1 各組肺組織病理學(xué)變化 (HE,20×)

    4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 提取淋巴細(xì)胞,依據(jù)前向角散射(FSC)和側(cè)向角散射(SSC),對(duì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)行分離,根據(jù)各種激發(fā)熒光分別設(shè)門。設(shè)門完成后,分別對(duì)Th17和Treg所占比例進(jìn)行分析,見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)顯示,正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組Th1和Th17表達(dá)量上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且濕熱環(huán)境+病毒組變化更為明顯,與正常環(huán)境+病毒組比較,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。經(jīng)過(guò)治療后,濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組與濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組Th1、Th2、Th17、Treg相較于濕熱環(huán)境+病毒組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。濕熱環(huán)境+病毒感染+利巴韋林治療組與濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組之間表達(dá)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 Th17和Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例() %

    表1 Th17和Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例() %

    與正常環(huán)境組比較,①P<0.05;與濕熱環(huán)境組比較,②P<0.05;與濕熱環(huán)境+病毒組比較,③P<0.05

    組別正常環(huán)境組濕熱環(huán)境組正常環(huán)境+病毒組濕熱環(huán)境+病毒組濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組T h 1 2 3 . 0 ± 1 . 3 1 1 7 . 0 8 ± 3 . 8 0 3 9 . 0 1 ± 0 . 7 5①③4 5 . 4 5 ± 8 . 2 4②2 8 . 7 4 ± 0 . 7 5②③2 7 . 0 8 ± 3 . 8 0②③T h 2 2 . 4 ± 0 . 5 4 5 . 2 0 ± 0 . 0 5 3 . 0 2 ± 0 . 3 0①1 . 9 3 ± 0 . 4 4②5 . 5 5 ± 1 . 6 6②③5 . 2 0 ± 0 . 1 3②③T h 1 7 1 . 5 5 ± 0 . 2 7 1 . 6 2 ± 0 . 3 4 4 . 6 1 ± 0 . 6 5①③5 . 0 2 ± 0 . 3 5②2 . 9 3 ± 0 . 4 4②③2 . 5 9 ± 0 . 4 2②③T r e g 5 . 4 4 ± 0 . 7 7 6 . 3 ± 0 . 8 1 2 . 8 7 ± 0 . 8 8①2 . 1 2 ± 0 . 7 7②4 . 0 4 ± 0 . 8 0②③4 . 5 4 ± 1 . 3 4②③

    4.5 Th1/Th2和Th17/Treg比值數(shù)據(jù)情況 見(jiàn)圖2。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,與正常環(huán)境組與濕熱環(huán)境組比較,Th1與Th17細(xì)胞的數(shù)量在正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組中呈現(xiàn)升高趨勢(shì),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Th2和Treg的表達(dá)量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),因此,與正常環(huán)境組及濕熱環(huán)境組比較,正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組中的Th1/Th2的比例呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。濕熱環(huán)境+病毒+利巴韋林治療組與濕熱環(huán)境+病毒+新加香薷飲治療組,相較于濕熱環(huán)境+病毒組,Th1和Th2都呈現(xiàn)出降低趨勢(shì),且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Th17和Treg的變化一致,都呈現(xiàn)出上升趨勢(shì),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖2 Th1/Th2和Th17/Treg比值數(shù)據(jù)

    5 討論

    初始CD4+T細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)下,表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子,分化成為功能及表型不同的效應(yīng)性Th細(xì)胞(Th1、Th2和Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)[6]。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子,參與細(xì)胞免疫;在流感病毒感染后,Th1細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子,IFN-γ可干擾病毒復(fù)制,可特異性殺傷病毒感染細(xì)胞,表現(xiàn)為急性一過(guò)性炎性反應(yīng)[7]。TNF-α作為重要的致炎細(xì)胞因子,其在流感病毒感染過(guò)程中對(duì)肺臟具有強(qiáng)烈的毒性[7~8]。IL-3可誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生抗體以中和病毒,還可促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,起到清除病毒的作用[9]。而Th2細(xì)胞主要分泌v IL-4、IL-5和IL-10等細(xì)胞因子,介導(dǎo)體液免疫,Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間存在動(dòng)態(tài)平衡。Th17與Treg細(xì)胞的分化相互抑制,在功能上也呈負(fù)性調(diào)節(jié),IL17在感染和損傷早期可有效介導(dǎo)促炎癥反應(yīng),在病毒感染早期,包括IL-17在內(nèi)的多種細(xì)胞/趨化因子都會(huì)升高,說(shuō)明IL-17在流感病毒早期感染階段起到了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[10]。而Treg作為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的免疫特征,主要介導(dǎo)免疫抑制反應(yīng),通過(guò)T細(xì)胞受體信號(hào)刺激活化后引起輔助性T細(xì)胞Th1/Th2的漂移,進(jìn)而影響炎癥結(jié)局[11]。因而二者的平衡關(guān)系主要是調(diào)控機(jī)體的炎性反應(yīng)。

    前期研究發(fā)現(xiàn),濕邪環(huán)境能夠抑制TLR7和RLRs信號(hào)通路的活化,下調(diào)Th1/Th2和Th17/Treg的比例,導(dǎo)致促炎作用增強(qiáng)而機(jī)體免疫抑制功能受到抑制,致使無(wú)法啟動(dòng)正常免疫應(yīng)答,使得濕邪致病纏綿難愈[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組的Th1和Th17表達(dá)量上升,而濕熱環(huán)境+病毒組變化更為明顯,與正常環(huán)境+病毒組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而濕熱環(huán)境+病毒組Th2、Treg與濕熱環(huán)境組比較,升高明顯。比較Th1/Th2、Th17/Treg比值發(fā)現(xiàn),正常環(huán)境+病毒組與濕熱環(huán)境+病毒組的Th1/Th2和Th17/Treg比值呈現(xiàn)升高趨勢(shì),提示病毒感染導(dǎo)致向Th1和Th17的方向轉(zhuǎn)化,且濕熱環(huán)境+病毒組比值更高,提示濕熱合并病毒感染促使機(jī)體炎性反應(yīng)增強(qiáng),而抑制炎性的功能減弱。

    新加香薷飲、利巴韋林對(duì)小鼠流感病毒性肺炎顯示出了非常好的治療作用,與濕熱環(huán)境+病毒組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但臨床上患者感染病毒多是出現(xiàn)了肺炎癥狀后才治療,盡管利巴韋林對(duì)病毒擴(kuò)增具有明顯的抑制效果,但是在流感病毒感染后,病毒已經(jīng)不是疾病的主要原因,所以直接抑制病毒擴(kuò)增往往不能奏效。新加香薷飲作為中醫(yī)治療外感的三大經(jīng)典方藥,經(jīng)大量臨床驗(yàn)證顯示出,其具有良好的抗病毒作用[3,5,13]。病理切片顯示新加香薷飲組的肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整,病變相較于病毒組更輕,提示新加香薷飲能通過(guò)病毒所致的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制起治療作用。

    綜上所述,我們認(rèn)為,濕熱環(huán)境對(duì)小鼠病毒感染后免疫識(shí)別具有影響,在一定程度上能促進(jìn)病毒感染后的炎癥反應(yīng)。在新加香薷飲復(fù)方體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們認(rèn)為其在病毒感染后的抗炎效果與對(duì)甲流病毒引起的肺炎的治療效果優(yōu)于利巴韋林組。但新加香薷飲復(fù)方抗流感病毒機(jī)制仍不十分明確,有待進(jìn)一步研究。

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    [13]盛丹,黎敬波,楊子峰,等.不同治法體內(nèi)抗甲 3 (H-3N-2)亞型流感病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].河南中醫(yī),2007,27(2):25-27.

    (責(zé)任編輯:劉淑婷)

    R285.5

    A

    0256-7415(2016)02-0235-04

    10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.091

    2015-10-20

    廣州市科技計(jì)劃(2014J4100106);廣東省科技計(jì)劃(2014A020212221);廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013434);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473557)

    鄧力(1990-),男,博士研究生,研究方向:中醫(yī)外感病因?qū)W研究。

    陳孝銀,E-mail:tchenxiaoyin@jnu.edu.cn。

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