DU20模擬振法對MCAO模型大鼠缺血區(qū)GAP－43表達(dá)的影響

竇思東，黃清豹，陳 艷，許瑞旭，鄢行輝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122）

DU20模擬振法對MCAO模型大鼠缺血區(qū)GAP－43表達(dá)的影響

竇思東，黃清豹，陳 艷，許瑞旭，鄢行輝*

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122）

目的 觀察“百會”（DU20）模擬振法對局灶性腦缺血大鼠（MCAO）模型中生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）表達(dá)的變化，探討其對腦缺血早期結(jié)構(gòu)可塑性的影響。方法 采用大鼠大腦中動脈栓塞法制成MCAO模型，研究缺血后1、7、14 d缺血區(qū)GAP-43的表達(dá)及振法對其影響。結(jié)果 各組大鼠在不同時(shí)間段GAP-43表達(dá)的比較:1）在造模后第1天，空白對照組和假手術(shù)組與其他3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），空白對照組、假手術(shù)組和模型組與電針組、振法組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;2）第7天，模型組與空白對照組和假手術(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組與電針組、振法組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白對照組和假手術(shù)組與電針組、振法組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;3）第14天，模型組與其他3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白對照組和假手術(shù)組與電針組、振法組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;4）在各個(gè)時(shí)段，電針組與振法組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），空白組與假手術(shù)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 “百會”模擬振法可以提高M(jìn)CAO模型大鼠GAP-43在缺血區(qū)的表達(dá)，對加快腦缺血早期結(jié)構(gòu)可塑性具有一定的影響。

腦缺血;穴，百會;模擬振法;GAP-43

近20年來，大腦神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的早期可塑性已成為神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)展重要領(lǐng)域［1］。首先，腦的可塑性的含義是指腦神經(jīng)元之間的突觸、相關(guān)蛋白在通過內(nèi)、外環(huán)境的刺激作用下是可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組和功能改變的。神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）是一種神經(jīng)元特異性磷蛋白，目前的研究表明其是決定神經(jīng)元再生、生長和神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑的內(nèi)在重要因素之一［2］。針灸推拿治療腦缺血療效確切，但其作用機(jī)制特別是對大腦可塑性形成方面的研究有待深入。為此，筆者選擇與大腦早期可塑性關(guān)系密切的GAP-43作為檢測指標(biāo)，觀察模擬振法對MCAO模型大鼠的影響，并探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級健康雄性Sprague Dawley大鼠50只，鼠齡2個(gè)月，體質(zhì)量（300±20）g，分籠飼養(yǎng)于普通級鼠類實(shí)驗(yàn)室，空調(diào)調(diào)節(jié)室溫（18±2）℃、濕度50% ～60%，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食與飲水，飼料為全價(jià)顆粒飼養(yǎng)［3］。根據(jù)《醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》中的隨機(jī)分組表，隨機(jī)分為5組:空白（對照）組、假手術(shù)組、模型組、電針治療組、振法治療組，每組各10只。

1.2 模型制作 采用大腦中動脈栓塞法制成局灶性腦缺血（MCAO）模型［3-5］，具體方法:實(shí)驗(yàn)大鼠以10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中碘酒消毒，乙醇脫碘，在頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露頸總動脈（CCA）與迷走神經(jīng)，注意保護(hù)頸內(nèi)動脈（ICA）神經(jīng)叢，在頸總動脈近心端穿線結(jié)扎，提起頸總動脈（CCA），在距離頸內(nèi)和頸外動脈（ECA）的分叉處遠(yuǎn)端約3 mm處剪一小口，用制備好的魚線沿頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，當(dāng)?shù)竭_(dá)指定長度（18.50±0.50）mm時(shí)結(jié)扎頸內(nèi)動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)端，造成左側(cè)大腦中動脈供血區(qū)永久性局灶性缺血;然后進(jìn)行神經(jīng)血管復(fù)位，創(chuàng)口局部撒少許青霉素（約4～6萬u），逐層縫合組織及皮膚。整個(gè)造模過程中保溫在38℃左右，防止大鼠術(shù)中死亡。術(shù)后，動物放回鼠籠中常規(guī)飼養(yǎng)。模型組與治療組制成局灶性腦缺血模型，假手術(shù)組只進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈分離即縫合。

1.3 治療方法 空白組、假手術(shù)組和模型組不加任何干預(yù)措施，治療組在造模成功后的次日分別進(jìn)行電針與振法的治療，取督脈百會穴（定位:當(dāng)頭部正中線與兩耳尖連線的交點(diǎn)處）［6］，持續(xù)時(shí)間為20 min，1次/d，連續(xù)14 d。各組分別在第1天取3只，第7天取3只和第14天取4只，在治療結(jié)束后進(jìn)行免疫組化法對GAP-43表達(dá)的觀察。

模擬振法組:用振動按摩治療儀（JH3450）（浙江省金華市錦輝實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行刺激［7］，用腦立體定位儀將振動儀固定于百會穴處，輕貼皮膚，強(qiáng)度以大鼠頭部輕微抖動為度，輸出峰值電壓4～6 V，刺激頻率50 Hz。

電針組:采用韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（HANSLH202H型）（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司），以1寸毫針（0.3 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)）平刺百會穴0.5寸，采用疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度1 mA，一端電極接在百會穴，一端接在左前肢，強(qiáng)度以頭部和左前肢輕微抖動為度。

1.4 免疫組化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱量大鼠的體質(zhì)量，用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉動物，固定于手術(shù)臺，迅速打開胸腔，將灌注針頭迅速插入左心室并進(jìn)入主動脈，用剪刀在右心耳切口，快速灌注生理鹽水大約250 mL，使灌注液體由此切口流出，以流出液體澄清為度。灌注完后迅速打開顱腔取出完整的腦組織，去掉小腦和低位腦干，在缺血區(qū)做連續(xù)冠狀切片，片厚約2 mm，將組織置于4%多聚甲醛液（4℃）中放入冰箱后固定48 h。再石蠟包埋，切片，片厚約8 μm，裱片于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烘箱烤片2～5 h。

1.5 圖像觀察內(nèi)容及方法 圖像分析GAP-43用光學(xué)顯微鏡（生物顯微鏡，Olympus BS-50型，日本Olympus公司生產(chǎn)，福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）確定GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物它們標(biāo)記的部位。應(yīng)用Motican 5000C+Moticmed數(shù)碼顯微圖像采集與分析系統(tǒng)攝片，Motic Images Advanced 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定梗死周圍區(qū)的吸光值（A值），用A值進(jìn)行比較分析，以避免非特異性染色所造成的誤差，每例標(biāo)本被檢各區(qū)測3張切片，求其平均值。

2 結(jié)果

各組大鼠在不同時(shí)間段生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）表達(dá)的比較，見表1，圖1。

表1 各組大鼠不同腦梗死區(qū)皮質(zhì)GAP-43吸光值（A值）的比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠不同腦梗死區(qū)皮質(zhì)GAP-43吸光值（A值）的比較（±s，n=10）

注:與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 術(shù)后第1天 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天空白組 0.33 ±0.03△△ 0.34±0.04△△ 0.32±0.03△假手術(shù)組 0.42 ±0.05## 0.35 ±0.05## 0.34 ±0.04#模型組 2.80 ±0.23## 2.25 ±0.19## 1.74 ±0.05#電針組 2.33 ±0.18## 1.01 ±0.10#△ 0.42±0.03△振法組 2.43 ±0.17## 1.04 ±0.12#△ 0.37±0.04△

圖1 各組大鼠GAP-43表達(dá)比較直方圖

實(shí)驗(yàn)表明，在大鼠腦缺血后，大鼠大腦內(nèi)神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）表達(dá)明顯提高，第1天假手術(shù)組與其他3組的GAP-43的表達(dá)比較有顯著差異性，從7～14 d，GAP-43表達(dá)逐漸降低，振法組與電針組較模型組有明顯差異。

3 討論

振法是中醫(yī)推拿的特色手法之一，具有活血祛瘀，通經(jīng)活絡(luò)的作用，是一種臨床應(yīng)用相當(dāng)廣泛的推拿手法［8］。竇思東等［9］研究認(rèn)為“百會”穴模擬振法能有效改善受損腦組織及神經(jīng)細(xì)胞的的電生理活動，從而促進(jìn)腦部的血液循環(huán)，改善大腦功能的恢復(fù)。韓廣順［10］認(rèn)為通過振法能有效的促進(jìn)大腦神經(jīng)血管舒縮功能失調(diào)的恢復(fù)，進(jìn)而改善腦部的供血。國外研究［11］表明，通過振法能促進(jìn)腦缺血大鼠大腦內(nèi)的NMDA受體、分裂素活化蛋白激酶及一氧化氮合酶神經(jīng)元的表達(dá)等相關(guān)蛋白因子產(chǎn)生影響，從而促進(jìn)了腦的早期結(jié)構(gòu)可塑性。

神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）是一種神經(jīng)元特異性磷蛋白，通過目前的研究表明其是決定神經(jīng)元再生、生長和神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑的內(nèi)在重要因素之一，研究［2］報(bào)道，在損傷神經(jīng)元內(nèi)，GAP-43的表達(dá)影響著神經(jīng)細(xì)胞的再生能力，提示在腦缺血后的一定時(shí)期梗死灶周圍有反應(yīng)性的神經(jīng)結(jié)構(gòu)重組表現(xiàn)。研究［12］表明GAP-43與神經(jīng)再生密切相關(guān)，被認(rèn)為是神經(jīng)元生長發(fā)育、重組和可塑性的分子標(biāo)記物;同時(shí)以GAP-43表達(dá)的升高來提示損傷程度，是大腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性研究的重要指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)證明模擬振法能有效的激發(fā)病變區(qū)域受損傷、冬眠或頓挫導(dǎo)致營養(yǎng)缺失的腦神經(jīng)細(xì)胞，使其病變區(qū)域腦血流灌注或腦缺血再灌注增高，提高損傷區(qū)域神經(jīng)GAP-43的表達(dá)，加快修復(fù)大腦損傷的神經(jīng)和結(jié)構(gòu)功能，進(jìn)一步促進(jìn)大腦早期腦結(jié)構(gòu)功能的恢復(fù)。

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DU20 vibration method on expression of GAP-43 in ischemic of MCAO rats

DOU Sidong，HUANG Qingbao，CHEN Yan，XU Ruixu，YAN Xinghui*
（Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China）

ObjectiveTo observe the DU20 vibration method in rats with focal cerebral ischemia（MCAO）changes of growth associated protein-43（GAP-43）expression in the model，and discusses the effects of structural plasticity early on cerebral ischemia.MethodsUsing the legal system into MCAO rat model of middle cerebral artery occlusion，ischemia after 1 days，days and 14 days in ischemic area of the expression of GAP-43 and the effects of vibration method.ResultsAll the rats at different time periods of GAP-43 expression in comparison:first days after modeling，control group and sham operation group and the other three groups hadsignificant difference（P ＜0.01），the blank group，sham operation group and model group and the electroacupuncture group，no vibration method significant difference（P ＞0.05）;the seventh day，model group and blank group and sham operation group have significant difference（P ＜0.01），there are obvious differences in the model group and the（JA08113 electroacupuncture group，vibration method group（P ＜0.05），control group and sham operation group and the electroacupuncture group were significantly，vibration method the difference（P ＜0.05）;the fourteenth day，the model group and the other three groups had significant difference（P ＜0.05），control group and sham operation group and electroacupuncture group，vibration method groups had no significant difference（P ＞0.05）;in each period，the electro acupuncture group and the vibration method group had no significant difference（P ＞0.05）.No blank group and sham operation group were significantly different（P ＞0.05）.Conclusion“Baihui”vibration method can improve the rat MCAO model GAP-43 expression in the ischemic area，to accelerate structural plasticity of early cerebral ischemia has some influence.

cerebral ischemia;point，Baihui，DU20;simulation method of vibration;GAP-43

R245.3

A

2095－6258（2015）04－0680－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.04.007

福建省教育廳資助課題項(xiàng)目“振法對腦缺血大鼠SEP和早期結(jié)構(gòu)可塑性影響的研究”（JA08113）。

竇思東（1960－），男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事針灸推拿的基礎(chǔ)與臨床研究。

鄢行輝，男，教授，電話－13328218821，電子信箱－13328218821@163.com

2014－12－15）