魚配合飼料中氯霉素殘留量的檢測方法

羅靳

摘要：研究了一種相比于GB/T 21108-2007《飼料中氯霉素的測定 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》前處理步驟相對簡單的方法測定魚配合飼料，采用內(nèi)標(biāo)法定量，添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg四個濃度，回收率在90.2%～119.9%。氯霉素在0.1～20.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.999，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<6%，滿足GB/T 27404-2008以及GB/T 21108-2007對回收率和精密度的所有要求。通過計算得到方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，方法定量限（LOQ）為0.006 μg/kg。

關(guān)鍵詞：氯霉素檢測，魚配合飼料，檢測方法研究，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

氯霉素屬廣譜抗生素，它通過與核糖體的50S亞單位結(jié)合，而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抑制作用，對立克次體、衣原體也有抑制作用。因其效高價廉，曾在水產(chǎn)、畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用。但氯霉素有較強的毒副作用和毒性，長期應(yīng)用可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥。如果氯霉素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，對人類的健康造成危害。目前檢測飼料中氯霉素的方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[1-3]、液相色譜-質(zhì)譜法[4-6]和酶聯(lián)免疫法[7-8]。本實驗參考GB/T 20756-2006等方法[5-6，9-10]研究出一種前處理步驟相對簡單的液相-質(zhì)譜法用于檢測魚配合飼料，降低了不確定度，并且縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

1材料與方法

1.1主要試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品均購自Dr.Ehrenstorfer Gmb公司，純度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素（chloramphenicol-D5）購自Dr.Ehrenstorfer GmbH Lot No.30417AC 100 μg/mL。乙酸乙酯，F(xiàn)isher ，色譜純；正己烷，沃凱，色譜純；實驗用水為Mili-Q制得的電導(dǎo)率18.2Ω的超純水。

1.2主要儀器

IKA分析研磨機；湘儀離心機TDAA-WS；0.22 μm微孔濾膜；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；日立高速冷凍離心機 HITACHI CF16RXⅡ；HPLC system：Agilent 1200 series，Agilent 6410 LC/MS/MS Agilent6410a 串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent。

1.3試驗部分

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[9]準(zhǔn)確稱取10.00 g氯霉素，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶，得到100 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確吸取 1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液乙腈定容至100 mL，得到1 μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確吸取1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液，純水定容50 mL，得到20 ng/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

準(zhǔn)確吸取100 μg/mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液 100 μL乙腈定容至10 mL，得到1 μg/mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液 ；準(zhǔn)確吸取1 mL氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液純水定容50 mL，得到20 ng/mL氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2樣品前處理魚配合飼料樣品用IKA分析研磨機磨成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取5.00 g±0.001 g于50 mL具塞離心管中，加入20 ng/mL氘代氯霉素250 μL，加入15 mL乙酸乙酯，混勻，振搖15 min，4 000r/min離心8 min，取出上清，再用15 mL乙酸乙酯重新提取一次，合并上清，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，5 mL水溶解，10 mL正己烷除脂兩次，靜止分層，取下層水相12 000 r/min 4 ℃冷凍離心后過0.22 μm水相有機相串聯(lián)濾膜，得到樣品用于液相串聯(lián)質(zhì)譜儀器測定。

1.3.3液質(zhì)聯(lián)用儀分析條件[10]

1.3.3.1色譜條件 色譜柱ZORBAX SB-C18，150 mm×2.1 mm（i.d.），5 μm Agilent，進樣量為20 μL；柱溫30 ℃；流動相為A去離子水、B乙腈；梯度洗脫條件見表1。

1.3.3.2質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子掃描，Capillary：4 000 V，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測，干燥氣N2，干燥氣溫度350 ℃，霧化氣壓力35psi，優(yōu)化質(zhì)譜條件見表2，氯霉素及氘代氯霉素的MRM色譜圖和其定性定量離子質(zhì)譜圖見圖1、圖2。

1.4線性范圍、檢出限和定量限

配制9個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液中氯霉素為0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，氘代氯霉素的質(zhì)量濃度為1.0 ng/mL，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的比值（氯霉素峰面積/氘代氯霉素-D5面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白配合飼料中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品以信噪比（S/N）≥3時的含量定為方法的檢出限（LOD）；以信噪比（S/N）≥10時的含量定為方法的檢量限（LOQ）。

1.5回收率的測定

選取陰性魚配合飼料樣品，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加水平為0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg，氘代氯霉素 1.0 μg/kg，每個添加水平9次平行。

2試驗結(jié)果

2.1線性范圍、檢出限和定量限

針對不同的添加濃度選擇相應(yīng)的濃度擬合成兩條曲線，進行數(shù)據(jù)分析。針對添加濃度為0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、1.0 μg/kg，選擇CAP濃度為0.0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL擬合成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=0.841 966x+0.011 336，R2=0.999 807 50。針對添加濃度為5.0 μg/kg，選擇CAP濃度為0.0 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL擬合成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程y=0.902 543 x-0.007 240 3，R2=0.999 840 61。數(shù)據(jù)顯示CAP在0.1～20.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.999。根據(jù)添加量為0.5 ng/mL的9個樣品152定量離子的最低信噪比和計算公式3C/（S/N），計算理論方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，理論方法定量限為（LOQ）為0.006 μg/kg。

2.2回收率和精密度

針對不同添加量，其回收率和RSD見表3。

所有數(shù)據(jù)都滿足GB/T 27404-2008[11]以及GB/T 21108-2007[4]對回收率和精密度的所有要求。

2.3實際樣品的檢測

利用該方法對12個魚配合飼料樣品進行檢測，均為未檢出。

3討論

3.1前處理方法的優(yōu)化

GB/T 21108-2007方法中包括提取—液-液分配凈化—濃縮—溶解—SPE柱凈化—濃縮—溶解，步驟繁瑣，導(dǎo)致回收率偏低，不確定度增加，且效率降低。而本實驗方法只包括提取—濃縮—溶解—除脂四個簡單步驟，整個過程幾乎無損耗，大大提高了回收率，降低了不確定度，并且縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

3.2雜質(zhì)峰的去除及除脂方法優(yōu)化

本實驗還嘗試將乙酸乙酯提取后的上清液直接進行液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果有雜峰干擾，于是濃縮后加入10 mL正己烷除脂，結(jié)果證明雜峰已去除，但是樣品本身還殘留有魚飼料的黃色，正己烷再次除脂一次，樣品已經(jīng)變成清亮白色，液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測得到單一目的峰，峰形尖銳，無雜峰或拖尾現(xiàn)象。見圖1。

3.3方法檢出限和定量限

雖然根據(jù)計算得到方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，相比于GB/T 201108-2007方法的最低檢測濃度5 μg/kg縮小了2 500倍，但它只是理論值，若將0.002 μg/kg添加到飼料中，采用這種方法檢測在回收率和精密度方面是否符合要求將有待于進一步的實驗進行驗證。但是本實驗的最低添加量0.1 μg/kg在回收率和精密度方面都符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，并且相比于GB/T 201108-2007方法的最低檢測濃度縮小了50倍。

4結(jié)語

本文研究了一種相對于GB/T 21108-2007前處理步驟簡單的方法測定魚配合飼料，采用內(nèi)標(biāo)法定量，省略了液-液分配凈化—濃縮—溶解—SPE柱凈化步驟，相應(yīng)地降低了不確定度，同時提高了檢測效率。

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（收稿日期：2015-06-15）