有機磷農(nóng)藥降解菌YC-YH1中mpd和ophc2的克隆及酶學(xué)性質(zhì)分析

賈陽 史延華 任磊 喬鋮 王俊歡 閆艷春

隨著世界人口的增加，對糧食需求的不斷增長。為增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，避免病蟲害造成的損失，各種農(nóng)藥的使用量也在逐漸增長。有機磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides，OPS）是一類非常重要的農(nóng)藥品種，全球已注冊的500多種農(nóng)藥或農(nóng)藥代謝物中，有機磷農(nóng)藥占有很大的比例［1］。目前，世界上有機磷農(nóng)藥種類達150多種，我國生產(chǎn)的有機磷農(nóng)藥品種有20余種，年產(chǎn)量超過10萬t，占我國農(nóng)藥總產(chǎn)量的80％以上［2］。雖然有機磷農(nóng)藥的大量使用提高了作物的產(chǎn)量，但由于有機磷農(nóng)藥的半衰期較長，大量的農(nóng)藥會殘留在水體和土壤環(huán)境中造成嚴重污染［3-5］。水體、土壤及農(nóng)產(chǎn)品中殘留的有機磷農(nóng)藥已對人們的健康安全帶來極大威脅［6-8］。乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。有機磷農(nóng)藥能夠抑制乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）的活性從而使ACh不能降解而大量聚積進而對人體產(chǎn)生毒性［9-11］。有研究表明，長期暴露于低劑量有機磷環(huán)境下會造成機體多部位損傷，癌癥、老年癡呆、帕金森氏綜合癥和糖尿病等疾病都與包括有機磷農(nóng)藥在內(nèi)的環(huán)境污染物有關(guān)［12］。因此，消除環(huán)境中殘留的有機磷農(nóng)藥一直是人們關(guān)注的焦點。

有機磷農(nóng)藥的降解方式主要可分為化學(xué)降解、物理降解和生物降解等［7，13，14］。生物降解是指通過生物的作用將農(nóng)藥分解成小分子無毒的或者低毒的化合物，并且最終降解為水、CO2和礦物質(zhì)的過程。相對于物理、化學(xué)降解技術(shù)，生物降解特別是微生物降解具有高效、操作簡單、成本低、徹底、無二次污染等諸多優(yōu)點，目前對環(huán)境污染物的生物降解已經(jīng)成為研究的熱點［15，16］。

微生物對有機磷農(nóng)藥的降解多是依靠酶促反應(yīng)進行，而利用純化酶對農(nóng)藥尤其是低濃度農(nóng)藥的降解效果遠優(yōu)于利用微生物本身，因為在農(nóng)藥濃度較低的情況下，降解菌會優(yōu)先利用其他碳源而不能有效利用農(nóng)藥作為碳源，而降解酶的專一性高而且不存在碳源的選擇問題，因此降解效果不受碳源影響，于是有機磷降解酶受到越來越多的關(guān)注［17］。到目前為止，國內(nèi)外的學(xué)者們已經(jīng)分離了多種能夠降解有機磷的微生物，并且提取純化了多種有機磷降解酶。1973年，Sethunathan等［18］從水稻田土壤中分離到了第一株能夠降解二嗪農(nóng)和對硫磷的黃桿菌 Flavobacterium sp. ATCC 27551。1982年，Serdar等［19］發(fā)現(xiàn)了能夠降解對硫磷的菌株P(guān)seudomonas diminuta MG。2001年，崔中利等［20］分離到了水解甲基對硫磷的菌株P(guān)lesiomonas sp. Stain M6，并克隆到了mpd基因。2002年，陳亞麗等［21］從農(nóng)藥污染土樣中分離出的一株能徹底降解甲基對硫磷的菌株 Pseudomonas sp. WBC-3。2003年，楚曉娜等［22］從有機磷農(nóng)藥降解菌Pseudomonas sp. WBC-3 中純化了甲基對硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）并對酶性質(zhì)進行了分析。2003年，伍寧豐等［23］從農(nóng)藥廠被污染的土壤中分離到了一株產(chǎn)有機磷水解 酶（Organophosphorus hydrolase，OPH）的 菌 株P(guān)seudomonas pseudoalcaligenes C2-1并對其產(chǎn)生的有機磷降解酶OPHC2進行了分離和純化。

目前已報道的有機磷降解菌中只含有一種有機磷降解酶基因，而本研究從一株有機磷農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1中同時克隆到兩種有機磷降解酶基因mpd和ophc2。將兩種基因分別連接到表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行表達，研究了這兩種降解酶各自的酶學(xué)特性及二者聯(lián)合的酶學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 甲基對硫磷（Methyl parathion，純度＞99％）購自上海市農(nóng)藥研究所。對硝基苯酚（p-Nitrophenol）（分析純）購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。4×SDS凝膠上樣緩沖液低分子量標(biāo)準蛋白、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、IPTG、DNA片段純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。氨芐青霉素購自Amresco公司。細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，去離子水1L，121℃滅菌20min。上樣緩 沖 液：Na2HPO4·12H2O 1.78g，NaH2PO4·2H2O 1.38g，NaCl 29.22g，Imidazole 2.0g，去離子水至1L，pH7.4。洗脫緩沖液 ：Na2HPO4·12H2O 1.78g，NaH2PO4·2H2O 1.38g，NaCl 29.22g，Imidazole 34.0g，去離子水至1L，pH7.4。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 本研究所用菌株為本實驗室分離的有機磷降解菌施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）YC-YH1，在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC No. 9624。E.coli BL21（DE3）購自天根生化科技有限公司。質(zhì)粒pET-32a購自Novagen公司。

1.1.3 儀器 AKTA avant 蛋白純化系統(tǒng)配Ni柱（HisTrapTMFF crude 1mL），Tecan infinite 200 酶標(biāo)儀，Bio-Rad（PowerPacTMHV Power Supply）蛋白質(zhì)電泳儀，BRANSON超聲波儀器（DIGITAL SONIFIER 250）。

1.2 方法

1.2.1 mpd和ophc2基因的克隆 根據(jù)施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri YC-YH1全基因組測序結(jié)果，用Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1），引物P1和P2 PCR擴增mpd基因，引物P3和P4 PCR擴增ophc2基因。以YC-YH1菌株基因組DNA為模板，擴增目的基因。PCR 擴增程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 20s，進行30個循環(huán)；72℃延伸10min；10℃保存。擴增產(chǎn)物用DNA片段純化試劑盒純化。

表1 引物名稱及序列

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將純化后的mpd和ophc2用BamHⅠ和SacⅠ酶切，同時酶切載體pET-32a，用DNA片段純化試劑盒回收，用T4 DNA連接酶將酶切后mpd和ophc2分別與pET-32a質(zhì)粒于16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，在含有100mg/L氨芐青霉素的抗性平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進行驗證。

1.2.3 mpd和ophc2基因的表達及蛋白純化 將已驗證正確的E.coli BL21（pET-mpd）和E.coli BL21（pET-ophc2）分別取300μL接種到30mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)后的菌液取4mL接種到400mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達到0.8，加入IPTG至終濃度1mmo/L，在30℃，200r/min下振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)3h。然后5000r/min離心8min收集菌體，用30mL上樣緩沖液懸浮菌體后進行超聲破碎。超聲功率為20％，超聲頻率：超聲3s，暫停5s，共超聲破碎20min。破碎完成后12000r/min離心10min，收集上清液進行純化。

用AKTA avant蛋白純化系統(tǒng)對蛋白進行純化，流速1mL/min，上樣26mL，用洗脫緩沖液進行洗脫，從第4mL開始收集，收集2mL蛋白洗脫液。

1.2.4 純化蛋白的檢測 使用SDS-PAGE對純化的蛋白進行純度測定。配制濃度為12％的分離膠，濃度為5％的濃縮膠，固定染色液為考馬斯亮藍R-250（含異丙醇25％，乙酸10％），脫色液含乙酸10％和乙醇5％。未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后的全細胞蛋白處理方法：lmL菌體細胞沉淀加入20μL4×SDS凝膠上樣緩沖液及60μL H2O，100℃加熱10min以充分裂解細胞，12000r/min離心10min使細胞碎片及DNA等沉淀，取適量溶液上樣。純化的MPH和OPHC2分別取60μL加入20μL 4×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，取適量溶液上樣。

1.2.5 酶的活性測定 取1μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，1μL酶液，加入到98μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中 混 勻，28℃反應(yīng)2min，然后用酶標(biāo)儀檢測溶液在405nm下的吸光度值。

有機磷降解酶的一個活性單位（U）定義為：在28℃條件下，每分鐘降解1μmol甲基對硫磷所需酶量。在甲基對硫磷的降解過程中，甲基對硫磷的消耗量與其降解產(chǎn)物對硝基苯酚的生成量之間為1 1的關(guān)系，所以本研究通過檢測產(chǎn)生的對硝基苯酚的量而得到甲基對硫磷被降解的量。

②建設(shè)農(nóng)田過濾帶。選擇設(shè)施農(nóng)業(yè)大棚區(qū)北側(cè)的1號渠，沿渠道北側(cè)布置600 m的農(nóng)田過濾帶，采用截流溝、植被過濾帶等6種不同的配置模式（見表1），降低農(nóng)田徑流污染物濃度，減少入河污染物。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)的測定 分別以純化的MPH、OPHC2以及二者按1 1比例混合的混合酶為材料，在不同溫度、pH及不同金屬離子下檢測酶對甲基對硫磷的降解效率，測定了其最適反應(yīng)溫度、最適pH及金屬離子對酶活性的影響。

取4μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，1μL 酶液，加入到 995μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混勻，在不同溫度（20、30、40、50、60、70和80℃）下保溫30min，檢測溶液在405nm下的吸光度值；在不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11和12）下進行酶促反應(yīng)，測定了其最適pH，取0.5μL酶液，1μL甲醇配制的濃度為1×104mg/L的甲基對硫磷母液，加入到98.5μL Tris-HCl（50mmol/L，pH9.0）中混勻，28℃反應(yīng)30min后檢測405nm下的吸光度值；在酶促反應(yīng)體系中分別加入不同金屬離子及化學(xué)試劑，各種化合物的終濃度為1mmol/L，28℃下反應(yīng)30min后檢測405nm下的吸光度值，以研究不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶反應(yīng)的影響。

1.2.7 降解甲基對硫磷的動力學(xué)分析 將不同濃度的甲基對硫磷（25、50、100、200和400mg/L）作為底物，加入到50mmol/L Tris-HCl（pH9.0）緩沖液體系中，在28℃下測酶反應(yīng)速度，按雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）求Km和Vm。

1.2.8 MPH和OPHC2的比較分析 對幾種常見的有機磷農(nóng)藥降解酶基因基因進行分析，用MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用Swiss-PdbViewer 4.1.0對MPH和OPHC2蛋白結(jié)構(gòu)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得與重組質(zhì)粒的驗證

以Pseudomonas stutzeri YC-YH1的基因組DNA為模板，擴增獲得兩個目的基因，其大小與基因組測序基因大小一致（圖1-A）。將擴增獲得的mpd和ophc2基因片段純化后，用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，與載體pET-32a連接并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），在含有100mg/L氨芐青霉素抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗證，并分別以pET-mpd和pET-ophc2為模板進行PCR驗證，與預(yù)測結(jié)果相符（圖1-B、圖 1-C）。

2.2 酶蛋白MPH和OPHC2的純化

將未進行誘導(dǎo)的全細胞蛋白、誘導(dǎo)后的全細胞蛋白及純化后的MPH和OPHC2蛋白同時進行SDSPAGE電泳，結(jié)果證明純化后的酶為單一條帶（圖2）。對純化的酶進行蛋白定量，得到MPH濃度為1.012mg/mL，OPHC2濃度為1.028 9mg/mL。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 MPH酶和OPHC2酶反應(yīng)最適溫度 溫度對酶活力有重要影響，太高的溫度會使得蛋白變性，從而使酶失活，太低的溫度又會降低酶的活性，因此只有在最適溫度下純化酶才能發(fā)揮出最高活性。MPH酶在不同溫度下具有不同的活性，MPH對甲基對硫磷的最適反應(yīng)溫度為40℃左右。溫度低于40℃時，酶的活性隨著溫度的升高而逐步上升，但超過40℃酶活力迅速下降，到80℃時酶已經(jīng)失活。結(jié)果表明此酶在室溫下有較高的活性，但耐熱能力較差，高溫時降解能力明顯較弱。OPHC2酶的最適反應(yīng)溫度為30℃左右。在20-30℃的溫度范圍內(nèi)，酶的活力沒有明顯的變化，超過30℃以后，酶的活力開始下降，當(dāng)超過40℃后，酶活力會急劇下降，在50℃時只有室溫時的60％?；旌厦傅淖钸m溫度也在30℃左右，混合酶在室溫時有較高的酶活，溫度上升到50℃時，酶活力下降到60％，這與單一純化酶相類似（圖3）。

圖1 PCR擴增結(jié)果及重組質(zhì)粒驗證結(jié)果

圖2 MPH及OPHC2純化過程SDS-PAGE圖

圖3 溫度對酶反應(yīng)的影響

圖4 pH對酶反應(yīng)的影響

2.3.3 MPH、OPHC2及混合酶的動力學(xué)參數(shù) 以甲基對硫磷為底物，分別測定MPH、OPHC2及混合酶的動力學(xué)參數(shù)，利用雙倒數(shù)作圖法，求取Km和Vm值，結(jié)果見表2。

表2 MPH、OPHC2及混合酶的動力學(xué)參數(shù)

2.3.4 金屬離子及有機試劑對酶活的影響 不同的金屬離子和有機試劑會對酶組分產(chǎn)生不同的影響，從而促進或抑制酶的作用。由表3可以看出，有機試劑SDS和EDTA對酶活的影響最大，是MPH和OPHC2的強變性劑。SDS是一種表面活性劑，它是兩親性分子，會使蛋白質(zhì)變性，所以加入后酶會失活；EDTA是一種絡(luò)合劑，可與金屬離子形成絡(luò)合物，MPH和OPHC2均金屬酶，加入EDTA會與酶活性中心的金屬離子螯合，從而降低了酶的活性。不同的金屬離子會對酶的活性產(chǎn)生不同的影響。Co2+對MPH的活性有一定促進作用，但同時會對OPHC2的活性產(chǎn)生抑制作用。其他各種金屬離子對MPH和OPHC2均表現(xiàn)出抑制作用，其中Zn2+的抑制作用最強。已有文獻報道，MPH活性中心的金屬離子為Zn2+，晶體狀態(tài)時每個活性中心的一個Zn2+可被Cd2+取代。OPHC2的活性中心有Zn2+還可能有Co2+或者Fe2+。加入Zn2+可能使得Zn2+過量從而對酶的活性產(chǎn)生強烈抑制。混合酶活性相對穩(wěn)定，受各種金屬離子的影響較小，能夠降低添加的金屬離子對酶活力的抑制作用。

2.4 MPH與OPHC2的比較分析

對常見的幾種有機磷農(nóng)藥降解酶基因進行比較分析，用MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖5）?？梢妋pd和ophc2相似性較高，親緣關(guān)系較近。

MPH與OPHC2都屬于β-內(nèi)酰胺酶，屬于典型的β/α（TIM）折疊桶結(jié)構(gòu)，活性位點均有兩個金屬離子，其催化機制也類似。MPH 的晶體結(jié)構(gòu)為同源二聚體，包含A，B兩條鏈；OPHC2的晶體結(jié)構(gòu)有A、B、C、D和E 5條鏈，其中包括兩個二聚體和一個單體（圖6）。MPH每個單體中含有45個氫鍵和8個鹽橋。OPHC2單體的N端與另一單體相互作用，單體間相互作用強烈，有29個氫鍵和15個鹽橋，涉及61個氨基酸殘基。同時OPHC2的每個單體還有一個二硫鍵（Cys110-Cys146），可能使OPHC2有更好的熱穩(wěn)定性。

MPH每個單體通過 Asp151、His152、His302、His147、His149、His234和 Asp255與兩個金屬離子相連，一個H2O分子橋與兩個金屬離子相連，還有一個H2O分子只與一個金屬離子配位。OPHC2單體中的兩個金屬離子α和β，His294、His144、Asp143、Asp247與α 金 屬 離 子 作 用，His226、His139、His141 還有一個H2O分子與β離子作用。

表3 不同金屬離子及有機試劑對酶解反應(yīng)的影響

圖6 MPH與OPHC2三維結(jié)構(gòu)圖

用Swiss-PdbViewer 4.1.0對MPH和OPHC2的單體進行分析（圖7），其三維結(jié)構(gòu)相似性很高，與之前的報道一致。由圖7中可以看到，MPH的Gln173-Phe178，Gln182-Asp186，Phe196-Ala210形 成 3個α螺旋，Lys214-Phe216形成β折疊，此段區(qū)域在OPHC2中不存在，可能會對酶的性質(zhì)有一定影響。

A：MPH單體；B：OPHC2單體；C：MPH單體與OPHC2單體重疊比較

3 討論

本研究將來源于施氏假單胞菌YC-YH1的mpd和ophc2基因克隆到大腸桿菌中，并成功進行了誘導(dǎo)表達，得到了有功能活性的蛋白，通過親和層析的方法對蛋白進行純化，得到了高純度高濃度的目的蛋白，對單一純化酶和混合酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了初步研究。

楚曉娜等［22］報道其純化的的MPH在pH9-12范圍內(nèi)能夠表現(xiàn)出較高的活力水平，最高活力的反應(yīng)溫度為40℃。在本研究中純化的MPH的最適反應(yīng)溫度也為40℃，最適pH為9，在pH9-12范圍酶活力同樣較高。伍寧豐等對純化的OPHC2進行酶學(xué)性質(zhì)分析，其降解甲基對硫磷的最適溫度為65℃，最適pH為9［24］，本研究中純化的OPHC2最適反應(yīng)溫度為30℃，更加接近自然環(huán)境溫度，最適pH為10，在pH8-12范圍內(nèi)酶活一直較高，具有較好的pH適應(yīng)性。MPH和OPHC2組成的混合酶在30-40℃范圍內(nèi)具有很高的酶活性，在pH9-10范圍內(nèi)其活力仍保持在最高水平?？梢钥闯龌旌厦改軌蚋玫剡m應(yīng)小范圍內(nèi)溫度和pH的變化，使酶活力保持在最高水平。不同金屬離子及化學(xué)試劑對兩種酶的的活性都有一定影響，很多金屬離子都會降低酶的活性，SDS和EDTA會使酶完全失活。比較二者對底物甲基對硫磷的降解效率發(fā)現(xiàn)，MPH對甲基對硫磷的親和力高于OPHC2，而OPHC2對甲基對硫磷的降解最大速率高于MPH。混合酶對甲基對硫磷親和力雖然降低，但最大反應(yīng)速率明顯升高。

MPH與OPHC2酶性質(zhì)相似，OPHC2的結(jié)構(gòu)表明其更強的熱穩(wěn)定性［25］。通過對酶性質(zhì)的研究，可以根據(jù)其特點定向?qū)γ高M行改造，提高降解效率和穩(wěn)定性。酶工程正在迅速發(fā)展，也逐漸應(yīng)用到人們的生活中。利用酶的進化和改造，使其應(yīng)用到解決農(nóng)藥污染和環(huán)境防治中具有十分重要的意義。

4 結(jié)論

株有機磷降解菌施氏假單胞菌 Pseudomonas stetzeri YC-YH1中產(chǎn)生的兩種降解酶MPH和OPHC2性質(zhì)相似，共同作用時混合酶比單一的降解酶具有更好的溫度和pH適應(yīng)性，對金屬離子和有機試劑的抑制作用也具有較強的抗性，同時最高反應(yīng)速率也顯著增大。

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