畢赤酵母GS115中N-乙酰轉移酶在大腸桿菌中的克隆表達與性質研究

朱海峰 吳丹 吳敬

N-乙酰轉移酶（Mpr1）是能夠乙?；彼犷愃莆?-羧酸氮雜環(huán)丁烷（AZC）的一種胞內酶［1］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）∑1278b中的Mpr1可以使AZC乙?；蒒-acetyl AZC，從而防止AZC被誤認為脯氨酸被生物體利用而產生毒性［2］。近年的研究發(fā)現(xiàn)Mpr1酶具有顯著的抗活性氧簇（ROS）氧化脅迫生理功能［2，6］。ROS是一類包含O2·、H2O2和·OH等的小分子物質，是正常細胞的新陳代謝的副產物。ROS化學性質極為活潑，積累后會給細胞造成極大的危害，導致細胞蛋白質發(fā)生解聚與降解［3］；還能同細胞器膜中不飽和脂肪酸發(fā)生反應，導致細胞器功能受損［4］；嚴重時還能造成DNA的斷裂，引起細胞死亡［5］。在合成精氨酸途徑中Mpr1可直接將Δ1-吡咯啉-5-羧酸酯（P5C）或其平衡物谷氨酸-γ-半醛（GSA）乙?；蒒-乙酰GSA，從而減少了通常途徑中的多個轉化步驟，有利于精氨酸快速合成［6］，提高細胞抗ROS的性能。目前研究都集中在來源于S. cerevisiae∑1278b的 Mpr1 基因上［2］。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種應用極為廣泛的真核表達系統(tǒng)，已表達了超過500多種異源蛋白質［7］。由于P. pastoris代謝甲醇的生理特性，在利用甲醇誘導發(fā)酵過程中產生大量的ROS而受到異常強烈的氧化脅迫。P. pastoris中一種N-乙酰轉移酶（Mpr1）具有抗氧化脅迫功能，相關研究尚為空白。研究P. pastoris中的Mpr1抗氧化脅迫機制將有利于進一步優(yōu)化P. pastoris細胞表達功能。本研究將來源于P. pastoris GS115的Mpr1基因在E. coli JM109進行重組表達，并利用響應面分析法對發(fā)酵過程中的誘導培養(yǎng)溫度、IPTG誘導濃度、起始誘導OD進行優(yōu)化，獲得最佳產酶條件；另外，對酶學性質進行初步研究；同時分析Mpr1對原核細胞的生長影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 P. pastoris GS115、E. coli JM109均由本實驗室保藏，PQE30質粒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：分子級蛋白胨5，酵母粉5，NaCl 10。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.34。

1.1.3 酶及其它試劑 限制性內切酶BamH I、Sac I，T4 DNA連接酶、Taq酶及其配套產品、膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒，E. coli感受態(tài)細胞制備試劑盒，酵母基因組提取試劑盒購于大連寶生物公司。DTNB、酵母無氨基基礎氮源培養(yǎng)基購自上海生工。AZC、乙酰輔酶A購自Sigma。蛋白標準分子量以及SDS-PAGE試劑盒購于碧云天生物技術研究所。其它常規(guī)試劑購自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 Mpr1基因的PCR擴增 P. pastoris GS115基因組按照上海生工基因組提取試劑盒操作步驟提取。根據NCBI網站Mpr1基因序列（登錄號：GENban XP_002492064.1）設計引物如下：P1（正向引物）5'-GACGGATCCATGAGTTCTACTCTAGATCCTGA AC-3'；P2（反向引物）5'-AACGAGCTCTTAAGAAA GGTCCGTATCGCATGT-3'，下劃線分別表示BamH I和Sac I酶切位點，以引物P1、P2對P. pastoris GS115基因組PCR擴增獲得Mpr1基因片段。PCR反應體系 50μL ：G+C buffer 10μL，ddH2O 33.5μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5μL， 基 因 組 1μL，正向引物 0.5μL，反向引物 0.5μL，dNTP 4μL。PCR反應條件：94℃預變性4min；98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的產物。

1.2.2 重組表達載體的構建 使用膠回收試劑盒回收純化PCR產物，于16℃與pMD18-T載體連接過夜后，轉入E.coli JM109的感受態(tài)細胞中，挑取陽性單克隆菌落于液體LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)8h左右，抽提質粒，酶切驗證后并進行基因測序。測序正確后將pMD18-T-Mpr1經BamH I、Sac I雙酶切之后，將片段純化、回收，質粒PQE30也以同樣的方法酶切并膠回收。T4 ligase連接目的基因和載體，過夜后轉入E.coli JM109的感受態(tài)細胞中，涂布于含有100μg/mL Amp抗性濃度的LB平板，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h左右，抽提質粒，酶切驗證并測序，得到正確的表達載體命名為PQE30-Mpr1，獲得重組菌命名為PQE30-Mpr1-E.coli JM109。

1.2.3 Mpr1酶基因的誘導表達 將構建好的重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109接種到含有Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h后轉接到含Amp的TB培養(yǎng)基，在37℃ 200r/min生長至設定OD后加入IPTG在不同的溫度下誘導表達。發(fā)酵后12000r/min離心5min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH7.5）懸浮菌體，超生破碎菌體，12000r/min離心5min后上清即為重組Mpr1酶的粗酶液。

1.2.4 N-乙酰轉移酶 Mpr1 酶活測定［8］在 30℃條件下將1mL反應液在412nm下測定光吸收的變化。其中TNB的消光系數(shù)為15 570 M-1·cm-1。一個酶活力單位定義為在1min內形成1μmol TNB的量，具體成分包括：Tris-HCl buffer（pH7.5）50mmol/L，800μL ；AZC 5mmol/L，50μL ；acetyl-CoA 0.2mmol/L，50μL ；DTNB 1mmol/L，50μL ；酶 液50μL。

反應計算公式：A = ε b c

其中，ε=15 570 M-1·cm-1，A為吸光度，b為測定物質濃度M（mol/L），c為液層厚度（cm）。

通過測定1min內A的變化算出b的濃度的生成量，計算出酶活。

1.2.5 E. coli細胞內ROS含量測定 用配制的磷酸鈉緩沖溶液將離心的發(fā)酵液樣品稀釋為菌液OD600約0.2（細胞濃度1×107cells/mL）的懸浮液，取1mL菌液加入5μL DCFH-DA溶液，在37℃、50r/min水浴搖床內避光負載30min，然后將樣品放在冰上避光保藏［9］。對照樣品加入5μL不含DCFH-DA的DMSO，相同條件下處理；用流式細胞技術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細胞內活性氧含量。

1.2.6 響應面優(yōu)化實驗 Box及其合作者于20世紀50年代提出的響應面分析法（Response Surface Analysis）被廣泛應用于食品、化工、農業(yè)等多個領域［10，11］。本研究根據正交實驗結果選取3個主要因素進行響應面實驗設計，并用SAS 8.1軟件對實驗數(shù)據進行回歸分析，通過微分方法預測實驗最佳點。

1.2.7 重組Mpr1酶最適反應pH和pH穩(wěn)定性分析

1.2.7.1 Mpr1酶最適反應pH 將純化獲得酶液離心處理，用不同pH值的緩沖液復溶，在30℃下測定重組Mpr1酶活力，將最高的Mpr1酶活為定義為100％，并計算其它樣品的相對活力。

1.2.7.2 Mpr1酶的pH穩(wěn)定性 將離心處理的酶用pH 分 別 為 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的50mmol/L緩沖液復溶，于4℃放置24h，測定其酶活力。

1.2.8 重組Mpr1酶最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性分析

1.2.8.1 Mpr1酶的最適反應溫度 將酶反應體系分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃等溫度下測定酶活力，將最高酶活定義為100％，并計算各樣品的相對活力。

1.2.8.2 Mpr1酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別在4℃、10℃、20℃、30℃和40℃等不同梯度溫度條件下水浴保溫，每隔1h取一次樣，測定殘留酶活。

2 結果

2.1 重組表達載體的的構建

提 取P. pastoris GS115基 因 組DNA，PCR擴增得到基因Mpr1（圖1），將得到cDNA克隆到pMD18-T simple vector。測序結果表明，MPR基因全長627bp，編碼208個氨基酸，與NCBI網站報道的登錄號為GENban XP_002492064.1的P. pastoris GS115的Mpr1編碼的蛋白序列完全一致。

圖1 PCR產物電泳圖

將pMD18-T simple vector和表達載體PQE30分別進行BamH I、Sac I雙酶切之后，膠回收、連接、轉化E.coli JM109，挑取單克隆培養(yǎng)過夜后，抽提質粒，經雙酶切得到大小約為3 460bp和627bp的DNA片段（圖2），獲得的重組質粒PQE30-Mpr1，獲得重組菌命名為PQE30-Mpr1-E.coli JM109。

圖2 重組質粒PQE30-Mpr1酶切電泳驗證

將重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109接種到含Amp的LB培養(yǎng)基中，轉接TB培養(yǎng)基誘導24h后破壁胞內上清酶活為462 mU/mL，攜帶空載體的對照菌PQE30-E.coli JM109未檢測到酶活。SDS-PAGE（圖3）顯示，23kD處有可溶性目的蛋白條帶。

圖3 重組菌發(fā)酵產Mpr1酶SDS-PAGE圖

2.2 響應面分析法優(yōu)化重組菌株發(fā)酵條件

根據Box-Bchnken的中心組合設計原理［10］，設計了三因素三水平的響應面分析實驗，共有15個試驗點，以發(fā)酵溫度，IPTG含量和誘導起始OD為自變量，以發(fā)酵液酶活為響應值，實驗因素與水平的選取，見表1。

表1 因素與水平取值表

15個實驗點可分為兩類：一是析因點，自變量取值在x1，x2，x3所構成的三維頂點，共12個析因點；二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復3次，以估計實驗誤差，每次實驗得到的酶活，見表2。

以發(fā)酵液酶活產量為響應值，運用SAS程序進行回歸擬合后，各實驗因子對響應值的影響可用下列函數(shù)表示：Y1=604.67-38.13X1+7.12X2+7.75X3-2.75X1X2-0.5X1X3+1X2X3--32.21X32。運用SAS程序對回歸方程進行方差分析，結果（表3）顯示，所做模型和3個因素的“Prob＞F”值遠小于0.05，說明所做的回歸方程模型及3個影響因素的結果是顯著的。根據R2=0.983 7能解釋98.37％的發(fā)酵酶活變化水平。因此回歸方程為重組E. coli發(fā)酵產Mpr1酶提供了一個適合的模型。計算得到的RSA（圖4）顯示，在3種因素中對發(fā)酵酶活影響由大到小分別是誘導溫度＞IPTG濃度＞起始誘導生物量，說明溫度是影響重組E. coli誘導產酶最關鍵因素。經RSA擬合后可看到擬合模型具有真實的最大值。

表2 響應面分析實驗安排與發(fā)酵酶活產量

表3 回歸方程的方差分析

經過模型計算預測得到最大發(fā)酵酶活產量為611.7，其中3個因素的最佳值分別是誘導溫度在30℃，起始誘導生物量OD為4.5，IPTG濃度控制在0.4mmol/mL。為了證實預測的結果，用以上得到的最優(yōu)配方重復實驗3次，平均發(fā)酵酶活為（610.3±9.5）mU/mL，與預測值611.7良好的擬合性證實了模型的有效性，回歸方程為搖瓶發(fā)酵產Mpr1酶提供了一個合適的模型。

圖4 重組Mpr1酶活與誘導溫度（A）、起始誘導生物量（B）和IPTG濃度（C）的關系

2.3 重組Mpr1酶酶學性質初步研究

將細胞高壓破碎后離心收集上清液，通過硫酸銨沉淀、透析、DEAE陰離子交換層析獲得純化的Mpr1酶，進行了酶學性質初步研究。

2.3.1 重組Mpr1酶的最適反應pH和pH穩(wěn)定性

重組Mpr1酶反應的最適pH的研究結果（圖5-A）顯示，pH在7-7.5酶活性最高。考察重組Mpr1酶的pH穩(wěn)定性，將其置于pH3.0-9.0的緩沖體系中4℃保溫24h后，測定殘留酶活。結果（圖5-B）顯示，重組Mpr1酶的pH穩(wěn)定范圍為6.5-8.0，在此范圍內保溫24h，重組Mpr1酶活約保持在90％以上，在pH4.0-6.5范圍內保溫24h，酶活可保持在50％以上，而當pH＞8.0和pH＜4.0時，Mpr1酶穩(wěn)定性很差。

2.3.2 重組Mpr1酶的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性在不同溫度條件下進行酶促反應，測定Mpr1酶酶活力。結果（圖6-A）顯示，重組Mpr1酶在30℃時酶活最高，而當溫度繼續(xù)上升后，Mpr1酶活力逐漸下降，可能是由于高溫造成了酶蛋白逐漸變性。將重組Mpr1酶分別在不同溫度條件下水浴保溫，考察其熱穩(wěn)定性。結果（圖6-B）顯示，重組Mpr1酶在4-20℃之間，保溫3h Mpr1酶的表現(xiàn)相對穩(wěn)定，在30℃保溫3h，酶活殘留50％左右，而在40℃下保溫2h剩余活性不足40％，表明重組Mpr1酶在低溫條件下具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 Mpr1酶反應的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）

2.4 表達Mpr1對E.coli JM109生長影響的初步研究

Momura等［12］在研究來源于 S. cerevisiae細胞∑1278b和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的N-乙酰轉移酶時，發(fā)現(xiàn)將上述來源的N-乙酰轉移酶在重組E. coli中實現(xiàn)異源表達后，重組E.coli同時還具有了抗AZC的活性。在利用重組E.coli胞內表達P. pastoris來源Mpr1時發(fā)現(xiàn)重組菌的生長狀況要好于對照菌（圖7），在發(fā)酵24h后重組菌的細胞OD達到14左右，而對照菌OD僅為9?；贛pr1具有顯著的抗氧化脅迫的功能，又測定了E. coli胞內ROS水平，結果（表4）發(fā)現(xiàn)重組菌胞內ROS含量顯著低于對照菌。這可能是重組E. coli表達Mpr1時，Mpr1酶使其抗氧化脅迫能力得到增強，從而改善細胞生長環(huán)境，因而生長速度明顯高于對照組。

圖6 Mpr1酶的最適反應溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）

圖7 PQE30-E.coli JM109菌株和PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株細胞生長情況比較

表4 PQE30-E.coli JM109菌株和PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株細胞內ROS含量分析

3 討論

目前國外研究報道均集中于S. cerevisiae的Mpr1。P. pastoris應用廣泛，但是其在誘導的過程中受到的氧化脅迫嚴重影響其外源蛋白的表達性能，有關P. pastoris MPR1基因的研究目前尚屬空白。由于MPR1基因較為廣泛的分布于生物細胞中［13］，而所有的生物細胞都會受到ROS的影響，因此研究MPR1的表達調控也是抗氧化脅迫機制的共性問題之一。但是，畢赤酵母Mpr1在酵母內表達量很低，無法滿足研究的需求，需要通過基因工程手段提高Mpr1酶的表達量。本實驗在E.coli JM109中成功實現(xiàn)胞內表達來源于P. pastoris GS115的Mpr1酶。通過研究酶學性質，P. pastoris Mpr1和S. cerevisiae Mpr1相比較具有較大區(qū)別。Michiyo等［12］研究同樣在E. coli中表達的S. cerevisiae細胞∑1278b中Mpr1酶時，發(fā)現(xiàn)其最適反應pH范圍在8.5-9.0?？梢妬碓从赑. pastoris的Mpr1酶更適合于在偏中性的環(huán)境下發(fā)揮酶功能。Iinoya等［8］發(fā)現(xiàn)S. cerevisiae Mpr1酶在50℃條件下半衰期為8.2min，相比之下本研究中P. pastoris Mpr1在40℃下半衰期為1h左右，可見P.pastoris來源Mpr1較S. cerevisiae來源的Mpr1更加穩(wěn)定。經NCBI網站blast比對分析發(fā)現(xiàn)，兩種同工酶的同源性僅為47％。鑒于P. pastoris具有極強的抗氧化脅迫能力，其Mpr1酶可能在抗氧化脅功能上存在特殊性，或者還存在有不同的生理功能，需要進一步實驗來明確P. pastoris中Mpr1的生理功能。

為了獲得Mpr1酶的最佳發(fā)酵條件，采用RSA方法分別從誘導溫度、IPTG誘導濃度、起始誘導OD進行發(fā)酵優(yōu)化，最終酶活達到（610.3±9.5）mU/mL。優(yōu)化發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度對發(fā)酵水平的影響最大，其次是IPTG濃度和起始誘導OD。由于在利用E.coli異源表達時溫度越高，蛋白表達越容易形成包涵體，因而發(fā)酵溫度是影響蛋白表達的重要因素。較低發(fā)酵溫度有利于細胞控制自身的合成蛋白質的速率，從而表達更多具有正常生理功能的蛋白質。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株的生長情況顯著好于PQE30-E.coli JM109菌株，經分析各自胞內ROS 水平，認為是重組菌中所表達的Mpr1使其獲得更高的抗氧化脅迫能力，從而具有更強的生長能力。鑒于P. pastoris的生理特殊性，后續(xù)研究可通過構建酵母Mpr1缺失突變體和過表達突變體，研究Mpr1在P. pastoris中的抗氧化脅迫調控規(guī)律，在分子水平闡明其抗ROS氧化脅迫的調控機制。

4 結論

構建了重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109，采用RSA方法從誘導溫度、IPTG誘導濃度、起始誘導OD分別對其進行發(fā)酵優(yōu)化，獲得最佳誘導發(fā)酵條件為：30℃，起始誘導OD=4.5，0.4mmol IPTG誘導24h后，Mpr1酶活達到（610.3±9.5）mU/mL。酶學性質初步研究結果表明，Mpr1酶的最適反應pH范圍為7.0-7.5，最適反應溫度是30℃。此外，對比重組菌和對照菌在同樣條件下培養(yǎng)，重組菌生物量顯著高于對照菌，胞內ROS含量較低，說明將Mpr1酶在E.coli JM109中表達之后，提高了其抗ROS脅迫能力，促進了細胞的生長。

［1］Takagi H, Shichiri M, Takemura M, et al. Saccharomyces cerevisiae_1278b has novel genes of the N-acetyltransferase gene superfamily required for L-proline analogue resistance［J］. J Bacteriol, 2000,182：4249-4256.

［2］Shichiri M, Hoshikawa C, Nakamori S, et al. A novel acetyltransferase found in Saccharomyces cerevisiae_1278b that detoxifies a proline analogue, azetidine-2-carboxylic acid［J］. J Biol Chem,2001, 276：41998-42002.

［3］Gebicki S, Gill KH, Dean RT, et al. Action of peroxidases on protein hydroperoxides［J］. Redox Rep, 2002, 7：235-242.

［4］Poljak A, Dawes IW, Ingelse BA, et al. Oxidative damage to proteins in yeast cells exposed to adaptive levels of H2O2［J］. Redox Rep,2003, 8：371-377.

［5］Lee J, Romeo A, Kosman DJ. Transcriptional remodeling and G1 arrest in dioxygen stress in Saccharomyces cerevisiae［J］. J Biol Chem, 1996, 271：24885-24893.

［6］Sasano Y, Takahashi S, Shima J, et al. Antioxidant N-acetyltransferase Mpr1/2 of industrial baker’s yeast enhances fermentation ability after air-drying stress in bread dough［J］. International Journal of Food Microbiology, 2010, 138：181-185.

［7］Cos O, Ramon R, Montesinos JL, et al. Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophie yeast Pichia pastoris under different promoters：a review［J］. Microb Cell Fact, 2006, 5：17.

［8］Iinoya K, Kotani T, Sasano Y, et al. Engineering of the yeast antioxidant enzyme Mpr1 for enhanced activity and stability［J］. Biotechnol Bioeng, 2009, 103：341-352.

［9］肖安風, 周祥山, 周利, 張元興. 流式 細胞術檢測畢赤酵母發(fā)酵過程中胞內活性氧水平［J］. 生物工程學報, 2006, 22（2）：273-277.

［10］Thompson DR. Response surface experimentation［J］. J Food Proc Pres, 1982（6）：155.

［11］葛宇, 許時嬰, 王璋. 響應面優(yōu)化冰淇淋復配穩(wěn)定劑配方研究［J］. 食品科學 , 1995, 16（11）：5-9.

［12］Michiyo N, Shigeru N, Hiroshi T. Characterization of novel acetyltransferases found in budding and fission yeasts that detoxify a proline analogue, azetidine-2-carboxylic acid［J］. J Biochem,2003, 133：67-74.

［13］Masaru W, Kae O, Michihiko K, et al. Distribution of L-azetidine-2-carboxylate N-acetyltransferase in yeast［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72：582-586.