星星草PtLIR1基因克隆及其在NaCl脅迫下的表達(dá)分析

周琪 羅春 郭敏 付暢

不利的環(huán)境條件會影響植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致作物的產(chǎn)量降低，大于50％的作物減產(chǎn)是由非生物脅迫引起的［1］，其中日益嚴(yán)重的土壤鹽漬化是主要的影響因素之一。植物耐鹽基因工程是提高植物耐鹽性的重要途徑之一，但其前提基礎(chǔ)是充分了解植物的耐鹽分子機(jī)制，獲得重要的耐鹽工具基因。盡管目前植物耐鹽基因工程取得了很多進(jìn)展［2-6］，分離到一些耐鹽相關(guān)基因，獲得一些耐鹽性得到提高的轉(zhuǎn)基因植物，但是，這些轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性仍然很有限。植物耐鹽機(jī)制研究的不足，有效耐鹽工具基因的缺乏已成為影響植物耐鹽基因工程發(fā)展的主要障礙［7］。鹽生植物星星草（Puccinellia tenuiflora）具有較強(qiáng)的耐鹽能力，擁有豐富的耐鹽基因資源，是研究植物耐鹽分子機(jī)制的良好材料。星星草是禾本科堿矛屬單子葉鹽生草本植物，耐受NaCl的最高濃度可以達(dá)到600mmol/L，耐受Na2CO3的濃度可以達(dá)到200mmol /L［8］，能在pH9-10以上的鹽堿地上生長發(fā)育［9］。

類 光 誘 導(dǎo) 蛋 白 1（Light regulated protein 1，LIR1）基因LIR1與植物的抗逆性密切相關(guān)，LIR1在生長于鹽堿地的星星草根中表達(dá)［10］，在400mmol/L NaHCO3脅迫 6h后于星星草葉中表達(dá)［11］。梁涵等［12］以 100mmol/L NaCl處 理 虎 尾 草（Chloris virgata）后，類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1上調(diào)表達(dá)。在條銹菌CY31侵染早期，類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1在小麥（Triticum aestivum）品種水源11中表達(dá)［13］。這些研究結(jié)果表明，LIR1基因參與植物對多種逆境脅迫的應(yīng)答，可能在植物的耐鹽性中發(fā)揮重要作用。類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1可能協(xié)助光合作用的進(jìn)行或光合作用產(chǎn)物的加工［14］，而可溶性糖的存在是該過程的負(fù)調(diào)控因子［15］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中可溶性糖會抑制類光誘導(dǎo)蛋白1基因的表達(dá)［16］。寒冷脅迫下黑麥草（Lolium perenne）類光誘導(dǎo)蛋白1基因LpLIR1先上調(diào)表達(dá)后下降到本底水平，表達(dá)水平的下降可能與可溶性糖的積累有關(guān)［15］。此外，類光誘導(dǎo)蛋白1基因還可能與蔗糖水平的調(diào)節(jié)有關(guān)［15］。

在前期的研究中，我們從鹽堿地星星草根的消減雜交cDNA文庫中分離到PtLIR1基因的表達(dá)序列標(biāo)簽（expression sequence tag，EST）［10］，表明該基因可能在幫助星星草根抵御鹽堿地逆境的過程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步了解該基因在星星草根中響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，本研究從星星草中克隆PtLIR1基因，分析NaCl脅迫下PtLIR1基因的表達(dá)特性，并對PtLIR1基因表達(dá)與蔗糖水平、可溶性糖水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 以采自肇東鹽堿地的星星草根和溫室培養(yǎng)的星星草幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 主要試劑 pMD19-T Simple載體（大連寶生物工程有限公司），大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109（大連寶生物工程有限公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit （Perfect Real Time）及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（大連寶生物工程有限公司），RNA清潔純化試劑盒（天津原平皓生物技術(shù)有限公司），膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 星星草的培養(yǎng)與處理 以采自肇東鹽堿地的星星草根為材料克隆PtLIR1基因。以溫室培養(yǎng)的星星草幼苗為材料進(jìn)行基因表達(dá)分析。將星星草種子萌發(fā)后種植在盛有草炭土和細(xì)沙（2 1）花盆中，溫室培養(yǎng)8周，以300mmol/L NaCl分別脅迫星星草幼苗0、6、12、24和48h，將根和地上部分開，液氮速凍后于-70℃貯存，用于熒光半定量RT-PCR分析。

1.2.2 星星草PtLIR1基因的克隆 以前期研究中分離到的星星草PtLIR1基因的EST序列為信息探針，在NCBI GenBank EST數(shù)據(jù)庫中檢索到星星草PtLIR1基因的EST序列EB104311.1，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該EST序列含有完整的PtLIR1基因的開放讀碼框（ORF），根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對引物（PtLIR1-F1：5'-GTCGACATGCAGGCTGCCACTGGTTTG-3'，劃線部分為Sal I酶切位點(diǎn)；PtLIR1-R1：5'-CCATGGTTA CTCCTTGGAGACTCCCGTCTG-3'，劃線部分為Nco I酶切位點(diǎn)）。采用SDS-苯酚法從鹽堿地星星草根中提取總RNA，經(jīng)DNaseⅠ去除基因組DNA污染以及RNA清潔純化試劑盒純化后，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板以引物PtLIR1-F和PtLIR1-R1對星星草PtLIR1基因的ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PtLIR1基因的 PCR 反應(yīng)體系為：2.5μL 10×PCR緩 沖 液，2μL dNTP（2.5mmol/L），PtLIR1-F（10μmol/L）和 PtLIR1-R1（10μmol/L）各 1μL，2μL cDNA，0.25μL rTaq（5U/μL），加滅菌的去離子水至 25μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性 4min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共 35 個(gè)循環(huán) ；最后72℃ 延伸10min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后將擴(kuò)增片段用膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與到pMD19-T Simple載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。采用Amp抗性和藍(lán)白斑反應(yīng)篩選陽性重組子，送上海生工生物工程公司測序。插入片段的序列與預(yù)期相符，陽性重組質(zhì)粒命名為pT-PtLIR1。

1.2.3 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因的表達(dá)特性分析 分別提取NaCl處理后的星星草根和葉的總RNA，經(jīng)DNA酶消化以及純化后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用核酸蛋白檢測儀定量。采用熒光定量RT-PCR分析NaCl脅迫下PtLIR1基因的表達(dá)變化。取400 ng總RNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為 ：2μL 5×PrimeSctipt Buffer（for Real Time），0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5μL Oligo dT Primer（50μmol/L），0.5μL Random 6 mers（50μmol/L），加滅菌的去離子水至10μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15min，85℃ 15s，4℃保存。以 cDNA為模板，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。引物Pttubulin-F：5'-CGACTTGGCAAAGGTTCAGC-3'和 Pttubulin-R：5'-TCATCGCCCTCATCATCTGC-3'擴(kuò)增Pttubulin基因，用引物PtLIR1-F1和PtLIR1-R1 擴(kuò)增PtLIR1基因。PCR 反 應(yīng) 體 系 為 ：10μL 2× 的 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus），F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）和 Reverse Primer（10μmol/L）各 0.8μL，2μL cDNA，加滅菌的去離子水至20μL。PCR反應(yīng)條件為 ：95℃ 5min ；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共44個(gè)循環(huán)。目的基因的相對含量=2-??CT，其中??CT=? CT樣本 -? CT對照，? CT樣本 = CT樣本 -CT內(nèi)參，? CT對照= CT對照-CT內(nèi)參。PtLIR1基因表達(dá)的器官特異性分析采用半定量RT-PCR方法。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，采用ClustalX1.8軟件進(jìn)行序列比對，用Mega4.0.2軟件生成進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 星星草PtLIR1基因的克隆

以前期研究中分離到的星星草PtLIR1基因的EST序列為信息探針，從NCBI GenBank EST 數(shù)據(jù)庫中檢索到星星草PtLIR1的EST序列EB104311.1，經(jīng)ORF Finder 軟件分析后發(fā)現(xiàn)該EST中含有PtLIR1基因完整的ORF。根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)一對引物（PtLIR1-F1和PtLIR1-R1），提取并純化鹽堿地星星草根的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，擴(kuò)增PtLIR1基因的ORF（圖1）。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后，經(jīng)測序分析證實(shí)該擴(kuò)增片段與預(yù)期的PtLIR1基因的ORF一致（GenBank登錄號為JN871224）。

圖1 星星草PtLIR1基因ORF擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.2 星星草PtLIR1基因的生物信息學(xué)分析

星星草PtLIR1基因的開放讀碼框長為408bp，編碼135個(gè)氨基酸。BlastX分析表明，PtLIR1基因編碼的氨基酸序列與類光誘導(dǎo)蛋白1的匹配最佳。經(jīng)過ProtParam計(jì)算，PtLIR1的分子量為14.1kD、理論上的等電點(diǎn)值為4.45。在NCBI GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選取黑麥草、二穗短柄草、玉米、短花藥野生稻、粟、馬鈴薯、葡萄、蕪青、擬南芥、小鹽芥、水稻、大豆等植物L(fēng)IR1氨基酸序列，與星星草PtLIR1進(jìn)行了序列一致性比對，結(jié)果（圖2）表明，PtLIR1的氨基酸序列與黑麥草的類光誘導(dǎo)蛋白1的一致性最高，為80％。PtLIR1與水稻、玉米、蕪青、小鹽芥、擬南芥、短花藥野生稻、粟、馬鈴薯、葡萄、二穗短柄草和大豆等植物的LIR1的一致性分別為57％、72％、42％、42％、54％、57％、71％、61％、67％、64％和47％。在相似性比較結(jié)果的基礎(chǔ)上構(gòu)建了LIR1的分子進(jìn)化樹（圖3），在比較的物種中，PtLIR1與黑麥草類光誘導(dǎo)蛋白1的親緣關(guān)系最近。PtLIR1具有光誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域。與其他光誘導(dǎo)蛋白相似，在PtLIR1的56-70和110-124位氨基酸序列中存在兩個(gè)近似重復(fù)序列，形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，在重復(fù)序列內(nèi)半胱氨酸殘基之間的距離高度保守（8個(gè)氨基酸殘基）。PtLIR1的重復(fù)序列與其他植物相似性較高，而重復(fù)序列外的相似性則較低，表明該結(jié)構(gòu)域具有重要功能。

2.3 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因表達(dá)特性分析

2.3.1 NaCl脅迫下星星草PtLIR1基因表達(dá)的器官特異性分析 類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1與植物的抗逆性密切相關(guān)，參與植物對鹽脅迫［13-15］、寒冷脅迫［11］和病害［16］的應(yīng)答反應(yīng)。為了了解鹽脅迫下星星草PtLIR1基因表達(dá)的器官特異性，利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測了PtLIR1基因在星星草根與葉中的表達(dá)（圖4）。無論在非脅迫條件下還是在鹽脅迫條件下，PtLIR1基因在星星草的根與葉中均表達(dá)，PtLIR1基因在鹽堿地星星草根中的表達(dá)量明顯高于PtLIR1在其它條件下星星草根中的表達(dá)量，表明PtLIR1基因可能對星星草根適應(yīng)鹽堿地生境具有特別重要的意義。

2.3.2 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)與體內(nèi)蔗糖水平的相關(guān)性 為了了解星星草根中PtLIR1基因?qū)aCl脅迫的響應(yīng)，以Pttubulin基因作為內(nèi)參基因，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因相對表達(dá)水平的變化（圖5）。NaCl脅迫下PtLIR1基因在星星草根中的表達(dá)水平先下降后上升，在脅迫24h后達(dá)到峰值（為0h的2.4倍），隨后又下降。PtLIR1基因在NaCl脅迫24h時(shí)上調(diào)表達(dá)，表明PtLIR1基因在脅迫晚期（12-48h）參與星星草根對NaCl脅迫的應(yīng)答，并可能對幫助星星草根抵御鹽堿地逆境中的NaCl脅迫具有重要作用。

圖3 植物L(fēng)IR1氨基酸序列的分子進(jìn)化樹

圖4 星星草PtLIR1基因表達(dá)的器官特異性分析

蔗糖的積累是植物抵御逆境脅迫的機(jī)制之一，而類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1可能參與對蔗糖水平的調(diào)節(jié)［11］。LIR1基因可能通過調(diào)節(jié)蔗糖水平參與植物對鹽脅迫的應(yīng)答。NaCl脅迫下星星草根中的蔗糖水平在脅迫6h后上升，在24h后達(dá)到峰值（圖5），表明蔗糖的積累是星星草根響應(yīng)鹽脅迫的策略之一。在NaCl脅迫早期（0-12h），PtLIR1基因的表達(dá)與蔗糖水平的變化趨勢相反，而在脅迫晚期（12-48h），PtLIR1基因的表達(dá)與蔗糖水平的變化趨勢一致。結(jié)果表明，在NaCl脅迫晚期，PtLIR1基因的表達(dá)與蔗糖水平的變化具有正相關(guān)性，可能是參與調(diào)節(jié)蔗糖水平的主要基因，而在脅迫早期，其他蔗糖代謝調(diào)節(jié)基因可能在蔗糖水平的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用。

圖5 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)與蔗糖含量的相關(guān)性

2.3.3 NaCl脅迫下可溶性糖與星星草根中PtLIR1基因表達(dá)的相關(guān)性 可溶性糖的積累也是植物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制之一。在擬南芥（A. thaliana）和黑麥草（L. perenne）中都發(fā)現(xiàn)了類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1的表達(dá)會受到可溶性糖的抑制［11，12］。鹽脅迫下星星草根中LIR1的表達(dá)可能也受到可溶性糖的調(diào)節(jié)。NaCl脅迫下，星星草根中可溶性糖的水平在脅迫6h后達(dá)到峰值，但隨后呈現(xiàn)下降的變化趨勢（圖6），表明可溶性糖的積累是星星草根響應(yīng)早期鹽脅迫的策略之一。在NaCl脅迫早期（0-12h），PtLIR1基因的表達(dá)與可溶性糖水平的變化趨勢相反。而在脅迫晚期（12-48h），PtLIR1基因的表達(dá)與可溶性糖水平的變化趨勢一致，但可溶性糖的水平低于脅迫早期（0-12h）（圖6）。結(jié)果表明，在NaCl脅迫早期星星草根中可溶性糖的積累與PtLIR1基因的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)，這與擬南芥（Arabidopsis thaliana）類光誘導(dǎo)蛋白1基因的表達(dá)受到可溶性糖抑制的研究結(jié)果相一致［16］，星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)可能受到可溶性糖積累的負(fù)調(diào)控。但在脅迫晚期（12-48h），低于早期的可溶性糖水平與PtLIR1基因的表達(dá)未呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。

圖6 NaCl脅迫下星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)與可溶性糖含量的相關(guān)性

3 討論

鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的重要環(huán)境因子之一。植物具有一定的調(diào)節(jié)離子平衡、滲透平衡以及氧化還原平衡的能力，可以在一定程度上適應(yīng)鹽脅迫逆境。鹽脅迫下可溶性糖和蔗糖的積累是植物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制之一［17，18］。可溶性糖是重要的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是合成其它有機(jī)物質(zhì)的碳架與能量來源。蔗糖可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)滲透平衡，可以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的分子結(jié)構(gòu)，是植物生長發(fā)育的重要碳源和能源，此外還具有信號功能，可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)［18］。可溶性糖和蔗糖代謝水平常被用來衡量逆境脅迫的程度以及植物對逆境脅迫的適應(yīng)性。

類光誘導(dǎo)蛋白1基因LIR1與植物的抗逆性密切相關(guān)，參與植物對鹽脅迫、寒冷脅迫和病害脅迫的應(yīng)答［10-13］。該基因可能協(xié)助光合作用的進(jìn)行或光合作用產(chǎn)物的加工［14］。LIR1基因在鹽堿地星星草根中表達(dá)［10］，在400mmol/L NaHCO3脅迫6h后在星星草葉中上調(diào)表達(dá)［11］，在100mmol/L NaCl處理后在虎尾草中上調(diào)表達(dá)［12］。因此，LIR1基因可能在植物對鹽脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)在NaCl脅迫晚期，星星草根中的PtLIR1基因響應(yīng)鹽脅迫上調(diào)表達(dá)。由于類光誘導(dǎo)蛋白1基因可能與蔗糖水平的調(diào)節(jié)有關(guān)［15］，因此LIR1基因可能通過調(diào)節(jié)蔗糖水平參與植物對鹽脅迫的應(yīng)答。在NaCl脅迫晚期，星星草根中的蔗糖積累至最高水平，PtLIR1基因的表達(dá)水平與蔗糖水平的變化趨勢一致，說明在鹽脅迫晚期PtLIR1基因可能是調(diào)節(jié)蔗糖水平的主要基因。鹽脅迫下PtLIR1基因可能通過調(diào)節(jié)蔗糖水平，以使蔗糖行使?jié)B透調(diào)節(jié)、保護(hù)分子結(jié)構(gòu)，提供碳源和能量，以及通過信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的功能從而響應(yīng)鹽脅迫。植物L(fēng)IR1基因的表達(dá)會受到可溶性糖的抑制［15，16］。植物在抵御寒冷脅迫的過程中往往伴隨著可溶性糖的積累，黑麥草類光誘導(dǎo)蛋白1基因LpLIR1在寒冷脅迫下先上調(diào)表達(dá)，然后下降到本底水平，表達(dá)水平的下降可能與可溶性糖的積累有關(guān)［15］。在NaCl脅迫早期，星星草根中的可溶性糖迅速積累響應(yīng)鹽脅迫，星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)水平與蔗糖和可溶性糖積累的水平均呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。一方面提示我們，在鹽脅迫早期可溶性糖的積累可能對PtLIR1基因的表達(dá)產(chǎn)生了負(fù)調(diào)控；另一方面也說明，在NaCl脅迫早期蔗糖合成酶（sucrosesynthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphatesynthase，SPS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（invertase，Ivr）等其他蔗糖代謝相關(guān)酶基因可能在蔗糖水平的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了更主要的作用。我們在前期的研究［13］和本研究中都發(fā)現(xiàn)了鹽堿地星星草根中PtLIR1基因的高水平表達(dá)，這提示PtLIR1基因的表達(dá)對星星草根適應(yīng)鹽堿地逆境的重要性，以及蔗糖在此過程中可能執(zhí)行的重要功能。綜合文獻(xiàn)內(nèi)容和我們的研究結(jié)果，將PtLIR1基因在星星草根逆境脅迫應(yīng)答中的可能發(fā)揮的作用總結(jié)如圖7所示。為了深入了解PtLIR1基因在鹽脅迫應(yīng)答中的作用，將通過進(jìn)一步的研究明確PtLIR1基因是否通過調(diào)節(jié)蔗糖水平幫助星星草抵御鹽脅迫逆境，以及可溶性糖是否對PtLIR1基因具有負(fù)調(diào)控作用。

圖7 PtLIR1基因在星星草根逆境脅迫應(yīng)答中的作用

4 結(jié)論

類光誘導(dǎo)蛋白1基因PtLIR1參與與星星草根對鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。在鹽脅迫早期，星星草根中PtLIR1基因的表達(dá)水平與可溶性糖水平的變化趨勢相反，可溶性糖的積累與PtLIR1基因的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，但蔗糖卻迅速積累，其他蔗糖代謝相關(guān)基因可能在蔗糖水平的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用。在鹽脅迫晚期，星星草根中的PtLIR1基因響應(yīng)鹽脅迫上調(diào)表達(dá)，蔗糖積累水平進(jìn)一步上升，PtLIR1基因的表達(dá)水平與蔗糖水平的變化趨勢一致，在鹽脅迫晚期PtLIR1基因可能是參與調(diào)節(jié)蔗糖水平的主要基因。

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