柵藻Scenedesmus sp.蛋白質(zhì)提取方法優(yōu)化及氨氮與硝態(tài)氮處理下蛋白質(zhì)組表達(dá)差異

賈其坤 梁青 吳后波 王廣華 吳華蓮 李濤 王兵 向文洲

由于存在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾，單純基因?qū)用嫜芯考?xì)胞代謝調(diào)控具有很大的限制性［1］，如高估實際的細(xì)胞調(diào)控過程［2］。而通過蛋白質(zhì)組表達(dá)分析則可以將靜態(tài)的細(xì)胞基因組信息與特定環(huán)境下動態(tài)的細(xì)胞代謝調(diào)控聯(lián)系起來［2］，因此，雙向電泳技術(shù)是在蛋白質(zhì)水平研究基因表達(dá)和代謝調(diào)控最有效的手段之一［3，4］。但如何快速高效地提取細(xì)胞內(nèi)全部蛋白，蛋白沉淀后如何保證其復(fù)溶性，如何提高雙向電泳圖譜分辨率等問題依然限制著這一技術(shù)的發(fā)展［5］。雖然目前有很多方法可以使哺乳動物和組織的蛋白樣品達(dá)到3 000-10 000個蛋白點，但當(dāng)應(yīng)用到微藻時，結(jié)果往往很不理想，出現(xiàn)諸如細(xì)胞破裂不完全、蛋白復(fù)溶度低等問題。如研究者對Synechocystis sp. Strain PCC 6803進(jìn)行實驗時，僅得到不足400個蛋白點［6］。另外，由于不同種的微藻其細(xì)胞生化成分不同（尤其是微藻內(nèi)含有的大量的葉綠素和類胡蘿卜素），而這些成分的差異可能會影響到蛋白的溶解性及提取率［5］，因此雙向電泳蛋白樣品的制備方法因不同的種屬而異。

無論陸生環(huán)境還是水生環(huán)境，對于其中的生物來說，氮都是一個重要的限制條件［7］。與硝態(tài)氮和尿素中的氮元素相比，大多數(shù)微藻更傾向于利用氨態(tài)氮，因為這種形式的氮可以在不需要還原的情況下直接參與細(xì)胞內(nèi)各種代謝途徑［8］。在柵藻中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，氨態(tài)氮培養(yǎng)的微藻的生長速率顯著高于硝態(tài)氮和尿素等其他形式［9］。但高濃度的氨態(tài)氮卻會嚴(yán)重抑制微藻的生長和油脂含量［10，11］，更高濃度的氨態(tài)氮甚至?xí)a(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用［12］。不同種屬的微藻對氨氮的耐受能力差別很大［7］，研究表明，在pH＞8.0的情況下，當(dāng)氨態(tài)氮濃度大于2.0mmol/L時可以顯著抑制柵藻Scenedesmus obliquus的光合速率和生長速率［13］。

本實驗初步探究柵藻Scenedesmus sp.雙向電泳蛋白樣品的制備方法及氨氮毒害作用下該藻蛋白差異表達(dá)情況，為研究氨氮對其的毒害機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 柵藻Scenedesmus sp.為實驗室自行分離保種，經(jīng)18S rRNA和ITS鑒定，為柵藻科柵藻屬的微藻。微藻正常培養(yǎng)使用改進(jìn)的土壤浸出液培養(yǎng)基（Modified soil extract medium，MSE），培養(yǎng)基配方，見表1。

1.1.2 主要儀器 紫外分光光度計（Ultrospec 6300 pro，General Electric）、臺式微量離心機(jī)（5415D、Eppendorf）、光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53）、恒溫培養(yǎng)箱（SHP-250）、水浴培養(yǎng)箱（OLS 200）、超聲細(xì)胞破碎儀Sonics VCX 130-PB、瓊脂糖凝膠電泳儀Bio-Rad JUNYITM、2-DE電泳儀GE Healthcare Ettan DALT six。

表1 MSE微藻培養(yǎng)基配方

1.1.3 主要試劑 丙酮、甲醇、乙醇、磷酸、硫酸銨、冰醋酸和超純水，購自廣州化學(xué)試劑廠；30％的丙烯酰胺、TEMED、SDS、pH6.8/8.8的1.5mol/L Tris-HCl、CHAPS、DTT、APS、TCA、礦物油、考馬斯亮藍(lán)G-250（電泳純）、低熔點瓊脂糖、蛋白酶抑制劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 微藻藻種首先在正常培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，取活化后處于對數(shù)期的微藻藻種以10％的比例接種到正常培養(yǎng)基和氨態(tài)氮培養(yǎng)基上。氨氮培養(yǎng)基的配方與上述MSE培養(yǎng)基一致，但以0.315g/L的NH4Cl代替MSE培養(yǎng)基中的0.5g/L的NaNO3，兩種培養(yǎng)基中的N元素含量一致，為5.88mmol。此濃度的氨態(tài)氮對柵藻可產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。培養(yǎng)條件為24h光照，光照強(qiáng)度為100mmol photon/（m·s），培養(yǎng)溫度控制在（24±1）℃。

1.2.2 細(xì)胞破碎方法 目前常用的細(xì)胞破碎提取全細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法主要有兩種，超聲細(xì)胞破碎法和液氮研磨破碎法。本實驗使用兩種方法進(jìn)行細(xì)胞破碎并通過顯微鏡觀察細(xì)胞破碎情況。

液氮研磨時首先將研缽用液氮預(yù)冷，然后取適量-80℃凍存的藻泥，加入液氮充分研磨15min，研磨后的藻粉加入1.5mL裂解液，裂解液配方如下：8mol尿素，4％ CHAPS，65mmol DTT和蛋白酶抑制劑。渦旋震蕩20-30min使其充分裂解。超聲細(xì)胞破碎時為防止超聲過程中起熱，操作需在冰上進(jìn)行，藻泥中加入1.5mL裂解液，超聲震蕩10min，每超聲5 s停止10 s以防止起熱和起泡。

細(xì)胞破碎后，12000 ×g 4℃離心10min將未破碎的細(xì)胞和破碎細(xì)胞的殘渣去除，蛋白質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)多糖、脂質(zhì)、細(xì)胞器，細(xì)胞質(zhì)等其他細(xì)胞內(nèi)容物共同存在于上清中，主要通過兩種方法進(jìn)行蛋白純化：TCA丙酮沉淀法和丙酮沉淀法。其中TCA丙酮沉淀法的主要步驟如下：

（1）向上清液中加入4倍體積預(yù)冷的10％ TCA-丙酮溶液（20mmol DTT），于-20℃自然沉淀30min，8 000×g -4℃離心 10min。

（2）去上清，加入30mL預(yù)冷的80％丙酮（水）溶液（20mmol DTT），用槍吹打沉淀，盡量分散，-20℃沉淀30min后同樣條件離心10min。

（3）依次用90％丙酮（20mmol DTT）和純丙酮（20mmol DTT）重復(fù)步驟（2）。

（4）去上清，沉淀在冰上瀝干，用濾紙擦拭試管內(nèi)壁，盡量擦去殘留的丙酮溶液。

（5）加入1.5-2mL復(fù)溶液，震蕩器上充分震蕩溶解20min，-20℃?zhèn)溆?。?fù)溶液配方與裂解液相同。

丙酮沉淀法步驟（1）中使用的為純丙酮溶液（20mmol DTT）而非10％的TCA-丙酮，其他步驟與上述TCA-丙酮沉淀法一致。

1.2.3 蛋白濃度及純度測定 提取的蛋白質(zhì)樣品在雙向電泳開始前需要對其進(jìn)行蛋白定量和蛋白豐度檢驗。蛋白質(zhì)定量使用非干擾型蛋白質(zhì)定量試劑盒，一般認(rèn)為當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度介于4-10mg/mL時較適合進(jìn)行雙向電泳實驗。同時SDS-PAGE膠可以初步檢測所提蛋白的豐度，一般提取成功的蛋白樣品條帶清晰豐富；而蛋白種類較少則會導(dǎo)致SDS-PAGE膠條帶較少，多是由于提取方法不當(dāng)、細(xì)胞破碎不夠完全或提取過程中蛋白降解等原因造成的。因此，在雙向電泳前進(jìn)行SDS-PAGE膠檢驗是非常必要的。電泳結(jié)束后拆除電泳裝置，將膠塊放在方盒中，加入考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色1h，加入雙蒸水進(jìn)行搖床震蕩脫色。在Image Scanner III掃描儀上掃描觀察。1.2.4 雙向電泳及差異蛋白點的檢測分析 取出蛋白樣品，加入水化液至350mL，蛋白樣品與上樣緩沖液的比例以蛋白樣品的含量而定。本實驗使用的是pH4-7，17cm的膠條，一般要求蛋白總量在800-1000mg之間。在水化槽中加入適量的礦物油以覆蓋膠條防止水分揮發(fā)。被動水化16h后進(jìn)行等電聚焦電泳，等點聚焦結(jié)束后，取出膠條，依次在DTT-平衡緩沖液和碘乙酰胺-平衡緩沖液中分別平衡15min，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，用超純水清洗后經(jīng)固定液固定1h，然后考馬斯亮藍(lán)G-250染色1h，最后超純水脫色，在Image Scanner III掃描儀上掃描觀察。

應(yīng)用Melanie version 7.0 software（Swiss Institute of Bioinformatics）對凝膠進(jìn)行分析，對差異蛋白進(jìn)行挖取，應(yīng)用MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到其蛋白種類和功能及其他信息。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞破碎方法的比較

經(jīng)液氮研磨，藻細(xì)胞破碎較完全（圖1-A），完整細(xì)胞較少，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，視野中充斥大量的細(xì)胞碎片和殘渣；而經(jīng)超聲細(xì)胞破碎儀處理的樣品（圖1-B），細(xì)胞破碎率明顯較低，大量細(xì)胞保持原有的圓球形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞顏色鮮艷，幾乎沒有內(nèi)容物外泄，僅有少量空殼細(xì)胞及碎片。

圖1 Scenedesmus sp.經(jīng)液氮研磨（A）與超聲破碎（B）處理后顯微照片

2.2 蛋白提取方法的比較

經(jīng)丙酮沉淀和TCA-丙酮沉淀兩種方法純化后的蛋白樣品復(fù)溶效果略有差異，對其進(jìn)行蛋白定量。結(jié)果顯示，丙酮沉淀法得到的蛋白樣品濃度為5mg/mL，而TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白樣品濃度略低，為3.5mg/mL。但PAGE膠檢驗蛋白豐度時發(fā)現(xiàn)：丙酮沉淀法制備的蛋白樣品條帶較少且不清晰，樣品中的蛋白種類單一（圖2-A）。TCA-丙酮法純化蛋白獲得的蛋白樣品種類多，條帶豐富清晰（圖 2-B）。

圖2 丙酮沉淀法（A）與TCA-丙酮沉淀法（B）提取微藻Scenedesmus sp.蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3 不同氮源培養(yǎng)微藻蛋白表達(dá)差異

比較正常培養(yǎng)基（硝態(tài)氮）與氨態(tài)氮培養(yǎng)基培養(yǎng)的微藻其蛋白表達(dá)的差異發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)模式的微藻蛋白表達(dá)發(fā)生了很大的變化（圖3-A和3-B）。和正常培養(yǎng)基相比，氨氮培養(yǎng)的微藻表達(dá)蛋白譜中有85個表達(dá)量降低的蛋白（圖3-C），25個表達(dá)升高的蛋白（圖3-D）。根據(jù)pH和MW選擇了26個表達(dá)量降低的蛋白和6個表達(dá)量升高的蛋白進(jìn)行飛行質(zhì)譜MALDI-TOF-MS/MS檢測（圖4）。檢測結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，這些蛋白涉及光合作用、二氧化碳固定、糖酵解、蛋白質(zhì)合成及非正常折疊蛋白降解、細(xì)胞分裂和物質(zhì)運(yùn)輸，以及自由基清除等途徑（表2）。由于微藻相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫目前尚不完備，因此飛行質(zhì)譜結(jié)果在數(shù)據(jù)庫上檢索匹配率較低，僅檢測到9個蛋白，其中6個表達(dá)量降低的蛋白分別為：甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（A24）、烯醇化酶（A28）、肌動蛋白（A50）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（A70和A82）和細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白（A83）。3個表達(dá)含量增高的蛋白分別是：50S核糖體蛋白（B05）、Fe-氫化酶（B15）和30S 核糖體蛋白（B17）。

3 討論

柵藻Scenedesmus sp.細(xì)胞體積較大，細(xì)胞壁的三層結(jié)構(gòu)提供堅固的保護(hù)壁，因此超聲細(xì)胞破碎法無法有效地破碎細(xì)胞，而液氮研磨作為最劇烈的破細(xì)胞方法，同時加入裂解液和反復(fù)凍融的協(xié)同作用，樣品破碎較完全，可作為一種有效快速的破碎細(xì)胞提取蛋白的方法使用。

藻類細(xì)胞中含有大量的鹽、核酸、多糖和脂質(zhì)等物質(zhì)，尤其是鹽離子，對雙向電泳的結(jié)果影響極大。鹽離子濃度過高通常會導(dǎo)致聚焦電流過大，聚焦時間過長或最終達(dá)不到設(shè)定電壓等問題，嚴(yán)重的會導(dǎo)致IPG膠條拱起或燒壞。雙向電泳蛋白樣品不僅要求純度高，蛋白豐度也有很高的要求。如果在蛋白提取或純化過程中損失大量的蛋白，就失去了差異蛋白分析的意義。本實驗通過丙酮沉淀和TCA-丙酮沉淀兩種方法純化蛋白發(fā)現(xiàn)：丙酮沉淀法制備的蛋白樣品條帶較少且不清晰，樣品中的蛋白種類單一，說明在提取過程中有大量的蛋白損失。此法不可作為一種有效的蛋白純化手段用于雙向電泳。TCA-丙酮法純化法獲得的蛋白樣品種類多，表現(xiàn)為條帶豐富清晰，說明TCA-丙酮法較之丙酮法，在蛋白純度和豐度上具有顯著的優(yōu)勢，用此法純化的蛋白適于雙向電泳實驗。

對不同氮源培養(yǎng)的微藻進(jìn)行蛋白提取發(fā)現(xiàn)，氨氮培養(yǎng)的微藻在同樣提取條件下得到的蛋白樣品濃度始終低于MSE培養(yǎng)的微藻蛋白樣品。說明氨氮培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量降低，這一結(jié)果與之前的報道一致［14］。如前所述，低濃度的氨態(tài)氮可以更容易被微藻吸收利用，但高濃度的氨態(tài)氮卻可以抑制微藻的生長。而更高濃度的氨態(tài)氮則會對微藻產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。這些毒害作用包括較低的生物量合成速率、油脂含量以及細(xì)胞代謝速率。顯然，這些宏觀的表征的變化是由細(xì)胞內(nèi)部代謝調(diào)控的變化引起的，甚至可能在基因表達(dá)調(diào)控的層面。比較正常培養(yǎng)基（硝態(tài)氮）與氨態(tài)氮培養(yǎng)的微藻蛋白表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，氨氮毒害下微藻蛋白表達(dá)確實發(fā)生了很大的變化。相比于正常狀態(tài)，氨氮培養(yǎng)的微藻表達(dá)蛋白譜中有85個表達(dá)量降低的蛋白，25個表達(dá)升高的蛋白。值得注意的是，有些蛋白點雖然具有不同的相對分子量和pH（A70和A82），但其飛行質(zhì)譜檢測結(jié)果卻是同樣的蛋白。其他的研究也曾報道過類似的現(xiàn)象并推測它們是同一個基因的表達(dá)產(chǎn)物，只是表達(dá)后修飾不同而引起的，或者也可能是隸屬于同一個蛋白家族［15］。飛行質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，這些蛋白涉及光合作用、二氧化碳固定、糖酵解、蛋白質(zhì)合成及非正常折疊蛋白降解，細(xì)胞分裂和物質(zhì)運(yùn)輸，以及自由基清除等途徑。以上結(jié)果為后續(xù)深入的氨氮毒性機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

圖3 硝態(tài)氮（A和C）與氨態(tài)氮（B和D）培養(yǎng)的微藻Scenedesmus sp.蛋白表達(dá)差異

圖4 檢測的26個表達(dá)量降低的蛋白和5個表達(dá)量升高的蛋白局部放大圖

4 結(jié)論

本實驗通過比較兩種微藻細(xì)胞破碎方法和兩種微藻細(xì)胞蛋白純化方法，確定了通過液氮研磨破碎細(xì)胞和TCA-丙酮沉淀提純蛋白質(zhì)的雙向電泳蛋白樣品提取方法，用此方法不僅細(xì)胞破碎完全，且提取的蛋白溶解性好、純度高、豐度高。運(yùn)用這種提取工藝初步探究了氨氮毒害作用下柵藻Scenedesmus sp.蛋白表達(dá)差異，檢測到的差異單白涉及光合作用，二氧化碳固定、糖酵解、蛋白質(zhì)合成及非正常折疊蛋白降解、細(xì)胞分裂和物質(zhì)運(yùn)輸，以及自由基清除等途徑等代謝通路。

表2 MALDI-TOF-MS/MS檢測到的柵藻Scenedesmus sp.在氨態(tài)氮與硝態(tài)氮作用下差異表達(dá)的蛋白

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