質(zhì)譜技術(shù)在DNA甲基化研究中的應(yīng)用

黃新鳳 葉金波 劉建軍

DNA 甲基化是DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）將S-2腺苷蛋氨酸（S-2 adenosine methionine，SAM）上活化的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA鏈中，是哺乳動(dòng)物中最常見(jiàn)和研究得最為深入的表觀遺傳修飾。而胞嘧啶C-5位點(diǎn)的甲基化（5-甲基-脫氧胞苷，5mdC）是最主要的DNA甲基化形式［1］，主要發(fā)生在CpG核苷酸序列中。人類基因組中絕大多數(shù)散在分布的CpG位點(diǎn)為甲基化修飾，而CpG島（定義為長(zhǎng)度大約1 kb，G+C含量大于55％并以二核苷酸CpG形式出現(xiàn)）通常為非甲基化狀態(tài)（尤其與啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)的CpG島區(qū)域），并與基因的表達(dá)密切相關(guān)［2］。DNA 甲基化異常主要包括整體基因組和基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的改變，基因組甲基化改變導(dǎo)致染色質(zhì)穩(wěn)定性降低，基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變則會(huì)干擾基因轉(zhuǎn)錄，使基因正常表達(dá)受損，可引起細(xì)胞的異常增殖和癌變［3］。此外，DNA 甲基化還與機(jī)體衰老、轉(zhuǎn)座子沉默、X 染色體失活及基因印記的形成有關(guān)［1-3］。

近年來(lái)，DNA甲基化成為了生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，研究方法不斷發(fā)展，而以往建立在常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)之上的研究方法存在某些缺陷，如克隆和PCR擴(kuò)增缺乏甲基轉(zhuǎn)移酶，5mdC不能保存下來(lái)，且此修飾存在于DNA雙鏈的大溝中而雜交技術(shù)難以識(shí)別等。此外，基于親和富集/剔除、甲基化敏感的核酸內(nèi)切酶消化或亞硫酸氫鹽修飾的DNA預(yù)處理方法，已建立了一系列分析技術(shù)，它們能與其他的研究方法聯(lián)合檢測(cè)5mdC標(biāo)記的存在和位點(diǎn)，例如測(cè)序、雜交、質(zhì)譜檢測(cè)、凝膠電泳和PCR等，它們?cè)陟`敏度、分辨率、重復(fù)性、誤差、通量、成本和定量的程度上存在差異［4，5］。質(zhì)譜（Mass spectrometry）以高敏感性、高通量、高準(zhǔn)確率、高分辨率、快速且重復(fù)性好而成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵技術(shù)，尤其在檢測(cè)大樣本的微量甲基化時(shí)，高靈敏度、高通量和定量DNA甲基化分析方法是必需的，質(zhì)譜聯(lián)合液相色譜（Liquid chromatogram）等技術(shù)在這方面顯示了巨大潛力。本文將分別闡述利用質(zhì)譜和色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)研究DNA甲基化的方法。

1 啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢測(cè)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）在遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)和核酸研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如單核苷酸多態(tài)性基因分型、突變檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異和剪接變異檢測(cè)等［6］。結(jié)合堿基特異性酶切反應(yīng)與MALDITOF-MS檢測(cè)原理，Sequenom公司的MassARRAY檢測(cè)系統(tǒng)，是用于單核苷酸多態(tài)性分型和DNA甲基化定量檢測(cè)的技術(shù)體系，具備高通量的檢測(cè)性能，實(shí)現(xiàn)多重CpG位點(diǎn)的分析檢測(cè)，可量化＜5％的甲基化改變［7］，能用于基因組任何區(qū)域（如啟動(dòng)子區(qū)）或候選基因的DNA甲基化定量分析［8］。

圖1 MassARRAY檢測(cè)啟動(dòng)子甲基化的基本原理［9］

如圖1所示，基因組DNA 經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（C→U），而甲基化的胞嘧啶保持不變；設(shè)計(jì)5'-端含T7啟動(dòng)子的引物擴(kuò)增DNA雙鏈，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度一般為200-600bp，堿性磷酸酶混合液去除反應(yīng)體系中游離的核苷酸；再加入T7 RNA聚合酶等進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和堿基特異性的酶切反應(yīng)；Nanodispenser從384孔板裂解反應(yīng)液中取微量溶液轉(zhuǎn)入基質(zhì)芯片上，質(zhì)譜儀收集質(zhì)譜圖［9］。

擴(kuò)增產(chǎn)物完全的堿基特異性裂解可產(chǎn)生適合MALDI-TOF-MS檢測(cè)范圍的短小核苷酸片段，該系統(tǒng)所配備的數(shù)據(jù)庫(kù)含參考序列的信息，由特定的算法計(jì)算序列的分子量改變并搜索相應(yīng)的參考序列，從而發(fā)現(xiàn)序列的變化。由于C→T變化致使反義鏈中G→A變化，含有甲基化CpG 位點(diǎn)的片段與不含甲基化CpG位點(diǎn)的片段每個(gè)CpG 位點(diǎn)之間分子量相差16 Da。計(jì)算獲得核苷酸片段中每個(gè)CpG單位的相對(duì)甲基化率（單個(gè)CpG 單位可含有多個(gè)CpG位點(diǎn)），EpiTYPER軟件對(duì)各CpG 位點(diǎn)或CpG 單位進(jìn)行甲基化定量分析。EpiTYPER系統(tǒng)提供先進(jìn)方便的DNA甲基化定量分析手段，提供數(shù)字和圖像注釋工具并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與檢測(cè)的核苷酸序列相匹配［9，10］（圖2和圖3）。

MassARRAY系統(tǒng)突出特點(diǎn)是能以極高的精確度快速進(jìn)行基因型識(shí)別，直接獲得序列的甲基化信息。研究者們對(duì)該技術(shù)平臺(tái)不斷優(yōu)化，例如，采用不同堿基特異性的酶切反應(yīng)，得到不同組合的核苷酸片段，目的序列的覆蓋率增加，95％以上的序列能夠被檢測(cè)出［11］。Thomson設(shè)計(jì)了統(tǒng)計(jì)分析軟件分析來(lái)自EpiTYPER數(shù)據(jù)以檢驗(yàn)亞硫酸氫鹽處理的效率的高低［12］。Wong等［13］用干燥的血樣提取高純度的DNA并進(jìn)行高效的亞硫酸氫鹽修飾，降低了樣本要求，使該技術(shù)應(yīng)用范圍擴(kuò)大。

圖2 MassARRAY系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果［10］

該方法也存在一定不足，如碎裂的核苷酸片段中，只有單個(gè)堿基對(duì)的改變能夠被軟件推測(cè)出，更加復(fù)雜的突變和多態(tài)性則難以檢出［14］。CG位點(diǎn)是常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，甲基化的胞嘧啶經(jīng)過(guò)脫氨基變成胸腺嘧啶，此多態(tài)性不能被亞硫酸氫鹽處理所辨別，會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化檢測(cè)的錯(cuò)誤［15］。SNP的存在會(huì)改變核苷酸片段斷裂的模式和分子量，而EpiTYPER不能分辨出，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。當(dāng)核苷酸片段的分子量超出軟件分析（1.5-7kD）范圍時(shí)，此核苷酸片段上一系列CG位點(diǎn)的信息難以獲得；多個(gè)CG位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)在同一核苷酸片段上且需要同時(shí)分析時(shí)，導(dǎo)致分辨率下降。PCR和亞硫酸氫鹽處理也是實(shí)驗(yàn)誤差的重要來(lái)源，獲得純凈的PCR產(chǎn)物對(duì)于檢測(cè)和分析至關(guān)重要。復(fù)雜組織中細(xì)胞類型的異質(zhì)性或同質(zhì)細(xì)胞表觀遺傳性狀的不一致使得分析變得復(fù)雜，結(jié)果可靠性也會(huì)下降［16］。

Agrawal等［17］利 用 MassARRAY 技 術(shù) 平 臺(tái) 對(duì)80例急性骨髓性白血病病人骨髓樣本的腫瘤抑制基因C/EBP基因啟動(dòng)子區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化且基因表達(dá)水平下降，說(shuō)明該病的發(fā)生可能與此基因啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)。Raval［8］發(fā)現(xiàn)，因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致死亡相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）基因沉默幾乎發(fā)生在所有的慢性B淋巴細(xì)胞白血病病例中。在乳腺癌危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)［18］，神經(jīng)管缺陷的危險(xiǎn)因素研究［19］，慢性B淋巴細(xì)胞白血?。?］、結(jié)直腸癌［20］和孕婦產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)性診斷［21］等方面，MassARRAY技術(shù)平臺(tái)都已有研究成果。

圖3 MassARRAY檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［9］

除MassARRAY技術(shù)平臺(tái)外，根據(jù)質(zhì)譜對(duì)核苷酸的分析依賴其電荷狀態(tài)的特性，Tost等［22］開(kāi)發(fā)了一種稱作GOOD assay分析樣品的準(zhǔn)備方法。亞硫酸氫鹽處理樣品和甲基化PCR 擴(kuò)增目的片段后，堿性磷酸酶消化未反應(yīng)的底物。因?yàn)橐?'-末端堿基有磷硫橋，底物為α-S-dNTP，延伸產(chǎn)物為磷硫骨架，而用磷酸二酯酶只能消化正常的磷酸骨架，磷硫骨架卻能抗消化。烷基化中和磷硫骨架鏈后用MALDITOF-MS分析。該方法只需少量樣品，可實(shí)現(xiàn)多通路檢測(cè)，但實(shí)驗(yàn)步驟較多，并利用酶消化會(huì)致檢測(cè)樣品純度降低、雜質(zhì)多，還需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，不利于推廣應(yīng)用?；陔暮怂幔≒eptide nucleic acid，PNA）與DNA結(jié)合的特異性高、不易被核酸酶降解、雜交后熱穩(wěn)定性好并能在低鹽狀態(tài)下穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)，Schatz等［23］建立了一種PNA探針雜交結(jié)合MALDITOF檢測(cè)研究CpG島甲基化的技術(shù)，亞硫酸氫鹽處理DNA樣品后，擴(kuò)增目的片段，并固定于固相介質(zhì)上，與含有甲基化位點(diǎn)的PNA探針雜交，去除非特異性結(jié)合后，洗脫下來(lái)的探針直接進(jìn)行MALDITOF-MS分析，分子量的大小與序列文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得序列的甲基化信息。該方法能多重平行分析多個(gè)甲基化位點(diǎn)，所需樣品量小，但需設(shè)計(jì)探針，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)步驟較多，限制了該技術(shù)的推廣。

2 全基因組DNA甲基化檢測(cè)

研究基因組DNA甲基化水平的思路主要有：3H標(biāo)記的甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（3H-SAM）與DNA反應(yīng)后，檢測(cè)結(jié)合于DNA上的同位素標(biāo)記的甲基基團(tuán)［24］，該方法需要的DNA樣品量大，結(jié)果不能直接反映DNA雙鏈中5mdC的比率；基于DNA甲基化限制性內(nèi)切酶的5mdC含量檢測(cè)［25］，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣且效率較低；應(yīng)用特異性的抗5mdC抗體進(jìn)行間接免疫熒光法檢測(cè)，所需樣品量大且精確性較低［26］；酶解或酸解DNA雙鏈為單個(gè)核苷，以色譜技術(shù)分離檢測(cè)，或在色譜分離的基礎(chǔ)上質(zhì)譜檢測(cè)。以色譜技術(shù)檢測(cè)基因組DNA甲基化水平的方法主要有薄層色譜（TLC）［27］、氣相色譜（GC）［28］、液相色譜（HPLC）［29，30］、毛細(xì)管電泳（CE）［31］等，此類方法可提供準(zhǔn)確且重復(fù)性較好的結(jié)果，但也有不足。薄層色譜實(shí)驗(yàn)的花費(fèi)較少，但準(zhǔn)確度不高且需大量的DNA樣品；氣相色譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，但核苷是強(qiáng)極性的化合物，進(jìn)樣前需進(jìn)行衍生化處理；液相色譜能彌補(bǔ)氣相色譜方法的缺陷，但紫外檢測(cè)器不能選擇性地檢測(cè)化合物，這要求將DNA水解后所有的核苷達(dá)到全部分離，或至少使目標(biāo)化合物與其他核苷完全分離，且紫外檢測(cè)器靈敏度有限，DNA樣品量要求大；毛細(xì)管電泳的分離效率較高，但DNA水解樣品中的基質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性影響很大。

色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析基因組DNA甲基化的基本原理是用酶或酸分解DNA鏈為單個(gè)核苷，色譜分離的基礎(chǔ)上采用質(zhì)譜檢測(cè)器測(cè)定核苷含量，樣本需要量少，靈敏度高，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展使大規(guī)模、高通量、全自動(dòng)檢測(cè)分析成為可能。Rossella等［32］報(bào)道的基于色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析全基因組DNA甲基化水平的方法主要有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS），Zhang等［33］報(bào)道采用親水相互作用色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HILIC-MS），但此方法使用很少。由于DNA核苷為強(qiáng)極性化合物，因此采用GC-MS方法分析全基因組DNA甲基化時(shí)需要對(duì)核苷進(jìn)行衍生化處理，衍生化步驟不僅繁瑣，而且衍生化不充分會(huì)給結(jié)果帶來(lái)極大誤差。HPLCMS/MS方法具有高靈敏性和選擇性，且不需對(duì)核苷進(jìn)行衍生化處理，給全基因組DNA甲基化定量分析帶來(lái)了新的解決思路，實(shí)驗(yàn)步驟也相對(duì)簡(jiǎn)單（主要包括：優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，用脫氧胞苷和5-甲基脫氧胞苷梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將水解并超濾去蛋白的DNA樣品上樣檢測(cè)，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得甲基化率的大小）?，F(xiàn)對(duì)HPLC-MS/MS檢測(cè)全基因組DNA甲基化的方法概括，見(jiàn)表1。

采用不同的色譜儀、色譜柱及質(zhì)譜儀可建立不同的檢測(cè)方法，各種方法各具特點(diǎn)。表1中的方法強(qiáng)調(diào)提高敏感度（減少分析所需的DNA量，降低檢出限）和通量，新方法的建立也以高通量、快速準(zhǔn)確、價(jià)廉為目標(biāo)。近年來(lái)，由于超高效液相色譜大幅度改善了液相色譜的分離度、樣品通量和靈敏度，速度和分離度分別是傳統(tǒng)HPLC的9倍和1.7倍，在低流速下，增加了峰濃度，提高離子源的效率，使靈敏度至少提高了3倍［33］，并在液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用領(lǐng)域得到廣泛發(fā)展。擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的關(guān)鍵，對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好、分析速度快，為提高分析的靈敏度并與質(zhì)譜聯(lián)用，發(fā)展了窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑＜0.2 mm的微徑柱，能增加靈敏度，減少樣品量，通過(guò)使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度，容易控制柱溫。質(zhì)譜檢測(cè)器方面，Yang等［34］報(bào)道，三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器比離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度更高，可避免連續(xù)分析中離子喪失的影響。

DNA甲基化定量也是該技術(shù)的關(guān)鍵之一，有文獻(xiàn)報(bào)道直接采用外標(biāo)法定量并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)度量甲基化率，另一些文獻(xiàn)則采用昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)15N3-dC 和15N5-dG［36］、［15N3］2-dc 和［methyl-d3，ring-6-d1］-5-methyl-2-dc［29］，及生物合成的穩(wěn)定同位素［U-15N］-dc和［U-15N］- 5mdC［43］，它們分別代表 2dC和 5mdC。Bagnyukova等［44］報(bào)道，HPLCICP-MS（電感耦合等離子體質(zhì)譜）檢測(cè)同位素31P和189Os（分別代表dC和5mdC）的量來(lái)定量甲基化比率。此外，有學(xué)者［34-45］采用5mdC和2-脫氧鳥(niǎo)苷（dG）物質(zhì)的量比值法（［5mdC］/［dG］比值法）進(jìn)行定量，這種方法的原理是假設(shè)DNA雙鏈中［5mdC］+［dC］=［dG］，DNA分子中5mdC與dG物質(zhì)的量的比值便可作為全基因組DNA甲基化計(jì)算公式的替代，不需考慮檢測(cè)和分析中物質(zhì)的損失，因?yàn)榉肿雍头帜副戎捣治鰰?huì)以相同的方式相互影響和抵消，可避免高成本同位素內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。但該方法在原理上也存在缺陷，即由于DNA分子中部分dG堿基會(huì)發(fā)生修飾，形成如O6-甲基化、C8-羥基化等修飾鳥(niǎo)苷，使得DNA分子中［5-mdC］+［dC］≈［dG］，給準(zhǔn)確性帶來(lái)誤差。總體來(lái)說(shuō)，目前報(bào)道的HPLC-MS/MS技術(shù)分析全基因組DNA甲基化水平的方法幾乎都未找到合適的內(nèi)標(biāo)來(lái)校正儀器誤差并進(jìn)行準(zhǔn)確定量［36］。因此，還需進(jìn)一步發(fā)展新型的基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)全基因組DNA甲基化的方法。

表1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)全基因組DNA 甲基化方法

現(xiàn)階段，已有學(xué)者采用HPLC-MS/MS研究疾病與全基因組DNA甲基化的關(guān)聯(lián)，例如，Lim等［43］用HPLC-ESI/MS研究無(wú)癥狀的大腸腺癌患者外周血白細(xì)胞全基因組DNA甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)全基因組DNA甲基化可能是大腸腺癌早期的致病因子。Bagnyukova等［44］研究發(fā)現(xiàn)，遺傳毒性致肝癌物二乙基氨基芴致雄性SD大鼠肝臟組織全基因組DNA甲基化水平大幅度下降，但未在雌性小鼠的肝臟組織中發(fā)現(xiàn)此特征，而且雄性和雌性SD大鼠的腎臟中也不存在此特征。Choi等［45］用HPLC-ESI/MS檢測(cè)Vitamin B-12缺乏致SD大鼠結(jié)腸DNA甲基化水平改變，初步認(rèn)為這可能是腫瘤的誘因。

3 結(jié)語(yǔ)

DNA甲基化作為重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，不僅是當(dāng)前生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，也在毒物的安全性評(píng)價(jià)中具有廣闊的應(yīng)用前景，其改變?cè)谠S多毒物的毒理學(xué)機(jī)制中起著重要作用。近年來(lái)，已有學(xué)者研究毒物引起的DNA甲基化狀態(tài)改變來(lái)探討其可能的毒理學(xué)機(jī)制。例如，Tao等［46］研究發(fā)現(xiàn)，飲用水氯化消毒副產(chǎn)物（DBPs）引起的全基因組DNA和c-myc基因低甲基化的能力與它們致小鼠和大鼠腎臟和肝臟腫瘤及促進(jìn)腫瘤發(fā)展的能力相關(guān)聯(lián)。Pereira等［47］的研究表明，蛋氨酸作為甲基供體可抑制二氯乙酸（DCA）誘導(dǎo)的B6C3F1小鼠全基因組DNA甲基化水平下降，并抑制肝臟腫瘤進(jìn)展，但未改變DCA所誘導(dǎo)的肝臟/體重比值和過(guò)氧化物酶增加，說(shuō)明蛋氨酸對(duì)肝癌的抑制與其對(duì)DNA低甲基化的抑制有關(guān)，也說(shuō)明了DNA低甲基化對(duì)于DCA誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生是至關(guān)重要的。DNA甲基化研究對(duì)毒物早期潛在毒效應(yīng)的探測(cè)、實(shí)驗(yàn)濃度組的設(shè)置、劑量-反應(yīng)曲線的有效定義和種屬之間合適的濃度外推具有重大意義，將促進(jìn)對(duì)毒物毒理學(xué)機(jī)制的研究，加快毒理學(xué)的發(fā)展［48］。在大規(guī)?；蚪M方面探索DNA甲基化特征，質(zhì)譜以其高通量、高準(zhǔn)確性和高靈敏度的特點(diǎn)將發(fā)揮著重要作用。熟悉其優(yōu)勢(shì)和不足是利用該技術(shù)平臺(tái)的基礎(chǔ)，隨著自動(dòng)化、微型化技術(shù)的發(fā)展和軟件算法的改進(jìn)，質(zhì)譜技術(shù)將在高靈敏度、高精確性和低成本的基礎(chǔ)上開(kāi)展高通量的研究。

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