Nrf2信號通路抑制劑對細粒棘球蚴作用的研究

王卓，姜玉峰，邢國強，呂海龍

Nrf2信號通路抑制劑對細粒棘球蚴作用的研究

王卓，姜玉峰，邢國強，呂海龍

目的研究Nrf2信號通路抑制劑DRB對體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)活力的影響。方法從自然感染細粒棘球蚴病的羊肝中獲取新鮮細粒棘球蚴原頭節(jié)，并于RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。實驗分為DMSO空白對照組，25 g/L、50 g/L、75 g/L DRB處理組。通過伊紅染色，在倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)活力和形態(tài)變化，并繪制生長活力曲線。在掃描電鏡下觀察原頭節(jié)超微結構變化。結果對照組和25 g/L DRB處理組體外作用細粒棘球蚴原頭節(jié)后，不同時間原頭節(jié)活力比較，差異無統(tǒng)計學意義(F空白對照組=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB處理組=0.658，P＞0.05)。50 g/L DRB處理組和75 g/L DRB處理組體外作用細粒棘球蚴原頭節(jié)后，不同時間原頭節(jié)活力比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F50g/LDRB處理組=6.686，P＜0.01;F75g/LDRB處理組=10.756，P＜0.01)。隨著用藥時間的延長和藥物濃度的增加，DRB對原頭節(jié)活力的抑制效果增強，且原頭節(jié)超微結構發(fā)生改變。結論高濃度的Nrf2抑制劑對體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)有抑制作用，并且有一定的濃度和時間依賴性。Nrf2信號通路是抗氧化應激反應的關鍵因子，對細粒棘球蚴Nrf2信號通路進行研究，可能為治療細粒棘球蚴病提供一個新思路。

細粒棘球絳蟲;原頭節(jié);Nrf2信號通路;DRB;體外研究

王卓，姜玉峰，邢國強，等．Nrf2信號通路抑制劑對細粒棘球蚴作用的研究［J］．中國全科醫(yī)學，2015，18 (29):3601－3605．［www.chinagp.net］

Wang Z，Jiang YF，Xing GQ，et al．Influence of Nrf2 signaling pathway inhibitor on echinococcus granulosus［J］．Chinese General Practice，2015，18(29):3601－3605．

棘球蚴病(echinococcosis)又稱包蟲病(hydatid disease)，發(fā)生在棘球蚴絳蟲的中絳期幼蟲，常寄生于人體器官及其他動物體內，從而造成對人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展危害性極大的寄生蟲病，且該寄生蟲病是人和牲畜共同患有。據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)，棘球蚴絳蟲存在許多種類。發(fā)生在我國多為細粒棘球蚴病，又稱為囊型包蟲病(cystic echinococcosis，CE)及多房棘球蚴病，又稱為泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)。這兩種分型疾病分別由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，E.m)寄生在人體內部器官或者動物體內致病。我國新疆等地此病發(fā)病率高［1－4］。細粒棘球蚴可寄生在人體多個器官，但以肝臟最為常見(占50%～70%)，其次為肺臟(占20%～30%)，在腦、腎、脾等器官中亦可見到［5］。目前的肝細粒棘球蚴病治療方案中，手術治療是首選，并在術后予以藥物輔助治療。臨床上手術采用的術式為“閉合式肝包蟲外膜內外囊完整摘除術”［6］，這種手術方法的優(yōu)點在于手術創(chuàng)傷小、術后并發(fā)癥少和可根治性等，可降低肝細粒棘球蚴病的術后復發(fā)率。但是，手術過程中存在頭節(jié)泄露以及切除不完全等問題，術后復發(fā)率也由此而升高。鑒于這種情況，術后的藥物輔助治療成為關鍵。近年來，許多學者在抗棘球蚴病藥物方面做了大量研究，例如對吡喹酮、阿苯達唑、甲苯達唑等藥物的作用進行了詳細研究及臨床效果觀測。上述藥物作為患者在術后使用的輔助治療手段，其結果并不令人滿意。更嚴重的是，有研究表明，患者在服用上述藥物過程中，會產(chǎn)生嚴重的不良反應，甚至對生命造成危害［7－9］。

本研究在體外培養(yǎng)細粒棘球蚴原頭節(jié)，將不同濃度的Nrf2抑制劑DRB體外作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)，觀察原頭節(jié)的變化情況。旨在為細粒棘球蚴病的藥物治療方法尋找一個新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器主要試劑:DRB、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司)，小牛血清(Gibco公司)。儀器:37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(Nuaire公司)，CHK Olympus倒置顯微鏡(Olympus optical公司)，掃描電鏡LEO1430VP(Olympus optical公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外培養(yǎng)細粒棘球蚴原頭節(jié)將自然感染細粒棘球蚴病的綿羊肝臟(新疆石河子市西部牧業(yè)有限公司提供)用75%乙醇溶液消毒表面，在超凈臺中，用注射器反復吸取羊肝表面的囊泡，把含原頭節(jié)的囊液移入無菌瓶中。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗原頭節(jié)3次，沉淀充分后去除瓶內上層液體。清洗后的原頭節(jié)用伊紅染色法進行活力測試，染色標準為95%以上拒染。將原頭節(jié)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并加入雙抗(青霉素和鏈霉素)，放于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.2 Nrf2抑制劑DRB體外作用細粒棘球蚴原頭節(jié)實驗分為DMSO空白對照組，25 g/L、50 g/L、75 g/L DRB處理組。將在體外培養(yǎng)3 d后的細粒棘球蚴原頭節(jié)用PBS清洗3次后，分別加入到上述培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察細粒棘球蚴原頭節(jié)活力情況在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，每天均勻抽取150μl液體(平均含原頭節(jié)90～120個)，抽取的原頭節(jié)用伊紅染色后，在倒置顯微鏡下觀察其變化情況。存活的原頭節(jié)因蟲壁保護作用，不會被伊紅染色作用為紅色，相反，死亡的原頭節(jié)或活力差的原頭節(jié)因蟲壁通透性增強，會被染為紅色。由此，計算每天原頭節(jié)活力。每3 d更換培養(yǎng)液，重復加藥。實驗重復3次。

1.2.4 掃描電鏡觀察細粒棘球蚴原頭節(jié)超微結構將原頭節(jié)用PBS反復清洗3次后，4%戊二醛將原頭節(jié)固定24 h，再將原頭節(jié)用50%乙醇溶液脫水5 min，70%乙醇溶液脫水10 min，80%乙醇溶液脫水30 min，90%乙醇溶液脫水1 h，最后用100%乙醇脫水過夜。脫水處理后的原頭節(jié)進行真空噴金LOOA0，在掃描電鏡下觀察原頭節(jié)超微結構變化情況。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料的比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡觀察細粒棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)倒置顯微鏡下觀察，空白對照組和25 g/L DRB處理組原頭節(jié)散在分布，可見原頭節(jié)活動，蟲體結構飽滿，呈橢圓形，內部豐富充實，結構清晰完整，鈣顆粒清亮而明顯(見圖1A～D)。50 g/L DRB處理組作用第3天，原頭節(jié)活動度較空白對照組減弱(見圖1E)，第6天，原頭節(jié)活動度較空白對照組明顯減弱，原頭節(jié)蟲體變小(見圖1F)。75 g/L DRB處理組作用第3天，出現(xiàn)蟲體邊緣不規(guī)整，空泡增多，鈣顆粒明顯減少(見圖1G)，第6天，原頭節(jié)蟲體嚴重皺縮，頂突上的小鉤排列紊亂，部分脫落，吸盤變型，內部結構消失(見圖1H)。

圖1 倒置顯微鏡觀察經(jīng)不同濃度DRB處理后的原頭節(jié)形態(tài)Figure 1 Form of protoscoleces treated by different concentrations of DRB observed under inverted microscope

2.2 DRB對細粒棘球蚴原頭節(jié)活力影響空白對照組和25 g/L DRB處理組體外作用細粒棘球蚴原頭節(jié)后，不同時間原頭節(jié)活力比較，差異無統(tǒng)計學意義(F空白對照組=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB處理組=0.658，P＞0.05)。50 g/LDRB處理組和75 g/LDRB處理組體外作用細粒棘球蚴原頭節(jié)后，不同時間原頭節(jié)活力比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F50g/LDRB處理組=6.686，P＜0.01; F75g/LDRB處理組=10.756，P＜0.01，見圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察DRB對細粒棘球蚴原頭節(jié)超微結構影響通過掃描電鏡觀察，空白對照組和25 g/L DRB處理組作用第6天，原頭節(jié)體態(tài)飽滿充實，呈橢圓形，并且形態(tài)結構完整，沒有觀察到原頭節(jié)結構顯著變化(見圖3A、B)。50 g/L DRB處理組作用第3天，原頭節(jié)蟲體表層出現(xiàn)輕微褶皺，但大體形態(tài)并未改變(見圖3C);作用第6天，原頭節(jié)表層出現(xiàn)明顯皺縮，蟲體表面結構受到一定程度破壞，蟲體形態(tài)發(fā)生改變(見圖3D)。75 g/L DRB處理組作用第3天，原頭節(jié)吸盤變型，頭鉤排列紊亂，蟲體表層發(fā)生嚴重皺縮(見圖3E);處理第6天，原頭節(jié)蟲體大部分凹陷，蟲體結構嚴重破壞，甚至蟲體潰解(見圖3F)。

圖2 DRB體外作用原頭節(jié)活力曲線Figure 2 Vitality curves of protoscoleces influenced in vitro by DRB

圖3 掃描電鏡觀察經(jīng)不同濃度DRB處理原頭節(jié)超微結構的變化Figure 3 Changes of ultrastructure of protoscoleces treated by different concentrations of DRB observed under SEM

3 討論

Nrf2是存在于眾多生物體內的核轉錄因子。Nrf2在1994年被研究人員發(fā)現(xiàn)，屬于CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族(cap'n'collar subfamily of basic leucinezipper)，該家族有6個成員，即Bach1、Bach2、Nrf1、NF－F2、Nrf2和Nrf3，并且廣泛表達于人體組織中［10］。Nrf2能夠直接影響抗氧化酶序列(antioxidant response element，ARE)的表達情況，從而在機體的氧化應激反應中發(fā)揮重要作用。在正常的生理狀態(tài)下，細胞質中的Nrf2與Keap1(Kelch－like ECH－associated protein 1)大量結合并在胞質中快速降解，通過Keap1－Cullin E3連接酶，造成Nrf2/Keap1泛素化［11］。有學者研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin－1(Cav－1)是Keap1所特有的Nrf2抑制劑，可幫助水泡運輸，從而抑制人血紅素氧合酶1(HO－1)和硫氧還蛋白還原酶Ⅰ這兩種參與細胞氧化還原平衡的表達［12－13］。在細胞質和細胞核中，Cav－1可以與Nrf2不需要媒介而直接結合。同時研究發(fā)現(xiàn)，若Cav－1在肺上皮細胞中高水平表達，會導致Nrf2在細胞中的活性降低，從而使細胞內抗氧化酶的表達也相應下降［14］。

在Keap1調節(jié)的氧化劑或親電化學傳感過程中，由于MAPK信號通路中，例如JNK蛋白、ERK、P38等磷酸化后，Nrf2可以得到釋放［15］，釋放后的Nrf2逐漸轉運并積累在擁有異質二聚體等轉錄因子(c－Jun、AP－1家族、M fa和c－Fos)的細胞核中［16］，輔助因子復合物特異性結合ARE序列，并廣泛調控編碼抗氧化酶基因，其中包括了谷胱甘肽－S轉移酶(GST)、NADPH醌氧化還原酶－1(NQO－1)、血紅素加氧酶－1(HO－1)、UDP－葡糖醛酸基轉移酶等［17］。

研究表明，通過激活GSK－3激酶，使其進入細胞核，并發(fā)生一系列磷酸化反應，導致Nrf2由細胞核轉運到細胞質中，并在泛素蛋白酶體系中降解。Nrf2信號通路也由此停止表達，以致影響抗氧化酶的一系列表達［18］。Rada等［19］提出了一種依賴Keap1的新型假說，在Nrf2的Neh6區(qū)域，由GSK－3對其產(chǎn)生絲氨酸殘基磷酸化作用，把細胞核中的Nrf2釋放出來，再和Trcp/ Cullin1 E3連接酶復合物進行泛素化結合。

Nrf2信號轉導通路被認為是氧化應激調控的重要樞紐，并且現(xiàn)在又有一些新的證據(jù)表明，如表觀遺傳機制［20］和多態(tài)性［21］可參與調節(jié)Nrf2信號通路的轉錄活性。有研究說明轉錄抑制劑DRB作用于腫瘤細胞，可以使腫瘤細胞內Nrf2的表達降低，并且對腫瘤細胞造成損傷［22］。

目前，在各種感染性疾病中，越來越關注Nrf2信號通路。膿毒血癥是由于寄主的免疫應答反應，解除了對細菌、真菌或病毒的管制，發(fā)生感染，導致多器官功能衰竭，甚至死亡。Nrf2－/－小鼠被證明較野生型小鼠對LPS誘導的膿毒性休克更敏感，暴露于相同LPS致死劑量情況下也有較高的死亡率［23］。此外，Nrf2信號通路在呼吸系統(tǒng)疾病的病理生理學方面也具有重要作用［24］。查加斯病是由克氏錐形蟲感染引起，患者可能出現(xiàn)心臟、消化道系統(tǒng)炎癥，并且由氧化應激反應導致細胞死亡。用Nrf2誘導劑包括鈷原卟啉(CoPP)、蘿卜硫素、紫檀芪或N－乙酰半胱氨酸作用小鼠后，表現(xiàn)出克氏錐形蟲感染率下降［25］。瘧疾是由瘧原蟲感染所引起的一種嚴重疾病。疾病的嚴重程度與過度炎性反應和不受控制的瘧原蟲增殖相關。相關研究報道，Nrf2誘導劑誘導感染惡性瘧原蟲的巨噬細胞，能夠恢復其吞噬能力，這可能是一個治療瘧疾的新方法［26］。人類感染細粒棘球蚴病，由于原頭節(jié)在體內器官中增殖，形成囊泡，可導致器官衰竭。在治療方面手術是首選的治療方式，但是在手術過程中難以避免原頭節(jié)泄露，導致復發(fā)。術后服用藥物，控制復發(fā)是輔助治療的關鍵?，F(xiàn)在臨床用于治療包蟲病的藥物主要為阿苯達唑和氟苯達唑等，這些藥物不僅需要大劑量長時間給藥，而且部分患者不能耐受藥物產(chǎn)生的嚴重不良反應。有研究報道，20%的高滲氯化鈉溶液在短時間內對原頭節(jié)的殺傷力可達100%，但是若在術中用于病灶的局部灌洗，會引起嚴重不良反應，并會對周圍正常肝組織造成一定程度的傷害［27］。

本研究探討了Nrf2抑制劑對細粒棘球蚴原頭節(jié)生長和形態(tài)結構的影響，實驗結果表明，高濃度的Nrf2抑制劑DRB對體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)有抑制作用，并且有一定的濃度和時間依賴性。目前，細粒棘球蚴疾病的治療仍是全球性的難題。Nrf2是調節(jié)氧化應激反應的重要元件，對其進行研究有助于從分子水平認識細粒棘球蚴的生長、發(fā)育、存活調控機制。

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Influence of Nr f2 Signaling Pathway Inhibitor on Echinococcus Granulosus

WANG Zhuo，JIANGYu－feng，XINGGuoqiang，et al．Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Shihezi University，Shihezi832003，China

Objective To investigate the in vitro effect of Nrf2 signaling pathway inhibitor DRB on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces．Methods We obtained fresh echinococcus granulosus protoscoleces from lamb liver naturally infected with echinococcosis granulose and conducted in vitro culture in RPMI1640medium．The sampleswere divided into four groups:DMSO control group，25 g/LDRB group，50 g/LDRB group and 75 g/LDRB group．By eosin staining，the activity and morphological changes of echinococcus granulosus protoscoleces were observed under inverted microscope，and activity curvesweremade．The ultrastructure of protoscoleceswas observed under scanning electronmicroscope．Results There were not significantly different in vitro effect of control group and 25 g/L DRB group on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces in different time(Fcontrol=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB=0.658，P＞0.05)．There were significantly different in vitro effect of50 g/LDRB group and 75 g/LDRB group on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces in different time (F50g/LDRB=6.686，P＜0.01;F75g/LDRB=10.756，P＜0.01)．With the lengthening ofmedication time and the increase of drug concentration，the inhibiting effect of DRB on protoscoleces vitality was strengthened，and the ultrastructure was changed．Conclusion High concentrations of DRB inhibitors can all inhibit in vitro cultured echinococcus granulosus protoscoleces，the dependence on concentration and time length exists．Nrf2 signaling pathway is a key factor for antioxidant stress．The study on the Nrf2 signaling pathway of echinococcus granulosusmay provide a new thought for the treatment of echinococcus granulosus．

Echinococcus granulosus;Protoccoleces;Nrf2 signaling pathway;DRB;In vitro

R 383.33

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.023

2015－04－13;

2015－08－10)

(本文編輯:賈萌萌)

國家自然科學基金資助項目(81360410)

832003新疆石河子市，石河子大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科(王卓，邢國強，呂海龍);石河子大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室(姜玉峰)

呂海龍，832003新疆石河子市，石河子大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科;E－mail:lvhl1999@126.com