植物乳桿菌在馬鈴薯秧藤汁液中的適應(yīng)性馴化培養(yǎng)研究

張雄杰等

摘要 將一株高產(chǎn)酸植物乳桿菌，在含有馬鈴薯秧藤汁液的一組MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)移接種培養(yǎng)，組內(nèi)5個培養(yǎng)基中的秧藤汁液濃度呈階梯性遞增狀態(tài)，對完成連續(xù)馴化培養(yǎng)后的菌種進(jìn)行冷凍干燥保存。進(jìn)一步將該馴化菌和未馴化菌進(jìn)行同步解凍激活后，分別接入含有馬鈴薯秧藤固體顆粒的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，結(jié)束后分離出各自培養(yǎng)基中的馬鈴薯秧藤固體顆粒部分和液體部分，采用比色法分別測定固體和液體部分中糖苷生物堿的含量；分別測定液體部分的pH值和總細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明：在馴化菌的培養(yǎng)體系中，總細(xì)菌細(xì)胞數(shù)含量顯著高于對照組；pH值顯著低于對照組；馬鈴薯秧藤固體顆粒中糖苷生物堿含量明顯低于對照組；培養(yǎng)液中的糖苷生物堿顯著高于對照組。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯秧藤；植物乳桿菌；糖苷生物堿；青貯飼料

中圖分類號 S816.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）14-0269-03

Study on the Cultivation of Lactobacillus of Adaptive Acclimation to the Juice of Potato Cane

ZHANG Xiong-jie 1 LU Peng-fei 2 CHEN Hao 3 LI Zhi-qiang 3 LIU Quan-guo 3

（1 Innner Mongolia Horizon Oasis Research Center of Characteristic Biologic Resource，Hohhot Innner Mongolia 010018；

2 Inner Mongolia Agriculture University； 3 Innner Mongolia Greed Seed industry of Potato Co.，Ltd）

Abstract In the experiment，the plant lactobacillus which have high acid production was transferred into a group of MRS liquid nutrient medium for the continuous transfer and cultivation，In this group of 5 liquid medium the juice of potato cane was the ladder of increasing state.Then，the freeze drying of the strains after continuous cultivation was carried out.Further，after thawing activation of the domesticated bacteria and not domesticated bacteria synchronously，They were inoculated to the liquid nutrient medium which included the juice of potato cane cultivate 48 h.After the training the potato cane solid particles and liquid parts in the medium was each separated.The contents of the Glycosides alkaloids in the solid and liquid parts were determined respectively by colorimetric method；pH values and total bacterial count were determined in the liquid parts.The results showed that in the cultivation system of the domesticated bacteria，the total bacterial cell number was significantly higher than that of the control group；pH value was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids content in the potato cane solid particles was significantly lower than that of the control group；Glycosides alkaloids in the liquid were significantly higher than those in the control group.

Key words potato cane；Lactobacillus plantarum；Glycosides alkaloids；silage

馬鈴薯秧藤是馬鈴薯植株的地上部分，是在收獲塊莖后剩余的副產(chǎn)品。在傳統(tǒng)的馬鈴薯種植業(yè)中，秧藤一般作為廢棄物被處理；在現(xiàn)代化的馬鈴薯種植業(yè)中，為促進(jìn)塊莖薯皮提早老化、便于機械收獲土豆作業(yè)以及預(yù)防各類病原體傳播，一般在土豆收獲前幾天至十幾天，采用化學(xué)殺秧、機械打秧等方式，將秧藤打碎還田或清除出田地的田間管理措施，這使得馬鈴薯秧藤資源具有了容易收集、分布集中、數(shù)量龐大的可開發(fā)利用優(yōu)勢。研究表明，馬鈴薯秧藤不僅可以作為還田綠肥、青貯飼料[1-4]，而且馬鈴薯秧藤中含有的70余種生物活性物質(zhì)[5-9]糖苷生物堿、茄尼醇、揮發(fā)油等均是具有開發(fā)價值的化工醫(yī)藥原料，具有很好的開發(fā)前景，但目前國內(nèi)尚無成熟的綜合開發(fā)利用技術(shù)。endprint

鑒于秧藤生物堿在青貯壓實操作中有一部分進(jìn)入自由流動的汁液浸出，且生物堿能夠溶于稀酸溶液的特點，在馬鈴薯秧藤綜合開發(fā)利用中，一方面需要將秧藤青貯發(fā)酵產(chǎn)酸，使有害生物堿被乳酸溶解并隨汁液脫出；另一方面要求溶出后進(jìn)入汁液里的生物堿不被降解，能被進(jìn)一步提取利用。選擇高產(chǎn)酸性能的植物乳桿菌，更有利于促進(jìn)這一過程。為此，需要對選定的高產(chǎn)酸性能的植物乳桿菌，在馬鈴薯秧藤汁液中進(jìn)行適應(yīng)性馴化培養(yǎng)。為此，開展了本研究工作，旨在為緩解馬鈴薯集中種植區(qū)（多為農(nóng)牧交錯地區(qū)）青貯飼料匱乏的問題，尋找一條具有高附加值的馬鈴薯秧藤生物活性物質(zhì)提取加工路徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 馬鈴薯秧藤及汁液。鮮秧藤均采自內(nèi)蒙古格瑞得馬鈴薯種業(yè)公司種植的種薯大田，品種為大西洋、費烏瑞它、克新1號、荷蘭十五及布爾班克；汁液在使用前用壓榨器取得；秧藤及汁液在加入培養(yǎng)基前預(yù)先滅菌處理。

1.1.2 儀器及試劑。試驗在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院實驗室進(jìn)行。主要儀器：常規(guī)微生物實驗儀器；主要試劑：四氫呋喃∶水∶乙腈∶乙酸（50∶30∶20∶1，V/V）混合提取液；0.03%（W/V）聚甲醛磷酸溶液；a-茄堿標(biāo)準(zhǔn)（krompotatosprouts），SIGMA，Chemistry Co U.S.A等。

1.1.3 供試菌種及準(zhǔn)備。植物乳桿菌（Lactobacillus plantar-um），凍干安瓶原種ACCC11016購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。原種經(jīng)過前期的培養(yǎng)研究，進(jìn)一步從中馴化培育出一株高產(chǎn)酸菌，擴(kuò)繁后再次凍干保存?zhèn)溆谩Ｓ们霸俅位罨簩⒗鋬龈稍锏木N按無菌操作要求從安瓿管中取出，放入5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，于28 ℃在培養(yǎng)箱中復(fù)蘇48 h。取200 μL復(fù)蘇后的菌種懸液涂布于MRS固體平板進(jìn)行二次復(fù)蘇，在培養(yǎng)箱中于28 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

1.1.4 培養(yǎng)基的配制。試驗中使用的4種培養(yǎng)基分別為MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、含馬鈴薯秧藤汁的液體培養(yǎng)基、含馬鈴薯秧藤顆粒的液體培養(yǎng)基。其中含馬鈴薯秧藤汁的液體培養(yǎng)基的配制：在MRS液體培養(yǎng)基的配方基礎(chǔ)上，分別添加馬鈴薯秧藤汁20、40、80、160、320 mL后定容至1 000 mL，制成1、2、3、4、5號共5個濃度梯度的培養(yǎng)基；含馬鈴薯秧藤顆粒的液體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的配方基礎(chǔ)上，添加馬鈴薯鮮秧藤切碎顆粒（2 mm≤？覫≤5 mm）100 g，后定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌細(xì)胞計數(shù)法。培養(yǎng)液中的細(xì)菌數(shù)測定使用直接涂片計數(shù)法[10]。

1.2.2 糖苷生物堿含量測定方法。馬鈴薯鮮秧藤、秧藤汁液、發(fā)酵后秧藤碎顆粒、發(fā)酵后含秧藤汁培養(yǎng)基液中的生物堿（全稱1，6-糖苷生物堿totalsglyeoalka-olids，下稱TGA）含量的測定方法，采用周寶利[11]和霍權(quán)恭[12]的文獻(xiàn)中使用的分光光度法，原理是TGA和聚甲醛磷酸可發(fā)生特定的呈色反應(yīng)。①標(biāo)樣配制：吸取0.50 mL 0.8 g/L的a-茄堿標(biāo)液于25 mL比色管中，準(zhǔn)確加入4.00 mL聚甲醛磷酸顯色劑，室溫反應(yīng)30 min，以試劑空白為參比，用1 cm比色皿，于620 nm波長處測定吸光度值。②試樣前處理：稱取馬鈴薯秧藤約50 g（或發(fā)酵后馬鈴薯秧藤碎顆粒約100 g、或發(fā)酵后含馬鈴薯藤汁培養(yǎng)液500 mL），加120 mL提取液，于高速組織搗碎機中搗碎10 imn并成漿狀，快速濾紙過濾（其中發(fā)酵液樣品需先作預(yù)想處理），濾液1 250 g離心5 min，準(zhǔn)確量取上清液100 mL，加2 mL冰乙酸，超聲波振蕩5 min。氨水調(diào)節(jié)pH值至10.5，沸水浴濃縮至干，冷卻后，用少量pH值10.5的氨水洗滌殘留物2次，并以7 800倍重力離心，棄去清液。殘留物水浴蒸干，用3.00 mL 7%磷酸溶解，7 800倍重力再離心5 min，清液供測定糖苷生物堿使用。

1.2.3 試驗步驟。試驗步驟分為四步，分別為乳酸菌適應(yīng)性能的馴化培養(yǎng)→馴化培養(yǎng)效果檢測試驗→對秧藤脫毒能力測定→培養(yǎng)液中生物堿含量的測定，具體如表1所示。

（1）菌種適應(yīng)性馴化培養(yǎng)。將激活的植物乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，取菌落接種于1號“馬鈴薯秧藤汁液體培養(yǎng)基”中進(jìn)行適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，48 h后轉(zhuǎn)接入2號，以此方法依次接入3、4、5號。經(jīng)過連續(xù)5個培養(yǎng)期的馬鈴薯秧藤汁液濃度遞增的培養(yǎng)后，將所得菌種擴(kuò)繁、冷凍干燥保存。

（2）馴化培養(yǎng)效果檢測。以未馴化菌作為對照，將馴化菌接入含有秧藤顆粒的液體培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，過濾去除秧藤顆粒，測試培養(yǎng)基液體部分中的pH值和細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。

（3）秧藤脫毒能力測定。對上述（1）中凍干的馴化菌和未馴化前的凍干菌進(jìn)行同步活化。將2種細(xì)菌分別接入“馬鈴薯秧藤顆粒液體培養(yǎng)基”中，培養(yǎng)48 h后，過濾培養(yǎng)液，挑揀選取馬鈴薯秧藤顆粒。將挑揀出的馬鈴薯秧藤顆粒稱重，測試2種菌培養(yǎng)下馬鈴薯秧藤顆粒中糖苷生物堿的含量；同時測試未經(jīng)過發(fā)酵的新鮮馬鈴薯秧藤顆粒作為共同的對照。

（4）浸出液中生物堿含量測定。對上述（1）中凍干的馴化菌和未馴化前的凍干菌進(jìn)行同步活化。將2種細(xì)菌分別接入3組“馬鈴薯秧藤顆粒液體培養(yǎng)基”中，各自培養(yǎng)24、48、72 h后，終止培養(yǎng)，過濾培養(yǎng)液，去除薯秧藤顆粒，保留過濾的培養(yǎng)液。測試培養(yǎng)液中糖苷生物堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的馴化培養(yǎng)結(jié)果

從表2可以看出，經(jīng)過多代數(shù)馴化培養(yǎng)的乳酸菌，對含有秧藤汁培養(yǎng)基的適應(yīng)性增強，繁殖數(shù)量多；而未經(jīng)馴化的乳酸菌適應(yīng)差，繁殖數(shù)量較少。該試驗尚不能確定乳酸菌的遺傳變異，但至少可以說明其對不同濃度秧藤汁有較強的適應(yīng)性變化，應(yīng)用在在馬鈴薯藤發(fā)酵生產(chǎn)實踐中可以提高成活率，加快發(fā)酵速度。endprint

2.2 對秧藤脫毒能力測定的結(jié)果

從表3可以看出，馴化菌的發(fā)酵過程對培養(yǎng)基中的馬鈴薯秧藤顆粒中的生物堿脫出能力起到增強的效果。馴化菌的繁殖能力強、產(chǎn)酸多，環(huán)境pH值下降快，生物堿溶出并隨汁液分流去除較多，秧藤中殘留較少。

2.3 培養(yǎng)液中生物堿含量的測定結(jié)果

從表4可以看出，馴化菌對培養(yǎng)基中的馬鈴薯秧生物堿降解能力強于未馴化菌；二者的培養(yǎng)液中早期均殘留有較高的生物堿，隨著時間的推移，含量逐漸減少。由此表明，乳酸菌發(fā)酵過程不僅能溶解出生物堿，而且對生物堿有降解作用[11-12]。

3 結(jié)論與討論

新鮮秧藤的生物堿含量在100～300 mg/kg·dm之間，與李克來的測試結(jié)果相近。若成年牛采食一次用鮮秧藤5 kg，食入的生物堿達(dá)1 g，可達(dá)到中毒量，所以新鮮秧藤必須經(jīng)過處理才能作為飼料。利用植物乳酸菌發(fā)酵新鮮秧藤，可使得秧藤中的生物堿溶出，含量降低到100 mg/kg·dm的安全線以下，從而起到脫除毒性的作用。使用經(jīng)過馴化的專用植物乳酸菌，有更強的溶出生物堿能力，含量降低到30 mg/kg·dm以下，達(dá)到對秧藤更好的脫毒效果。此外，利用這一馴化菌，發(fā)酵浸出液中保存有較多生物堿，含量達(dá)到20 mg/mL以上，但隨發(fā)酵持續(xù)時間，呈逐步降解趨勢。建議在發(fā)酵早期，從發(fā)酵浸出液中收集生物堿，用于進(jìn)一步的提取利用。

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