超高效液相色譜—熒光法測(cè)定番石榴中多菌靈農(nóng)藥殘留

李盛安+馮敏鈴

摘要 建立了超高效液相色譜（UPLC）對(duì)番石榴中多菌靈（MBC）殘留的分析方法。番石榴經(jīng)乙腈提取后，MCX小柱凈化，熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量；對(duì)樣品前處理和色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化。通過比較QuEChERS法與加速溶劑萃取ASE 2種提取方式，對(duì)比NH2和MCX固相萃取柱凈化效果，確定番石榴中多菌靈的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：多菌靈含量在0.01～0.50 μg/mL間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。添加0.05～1.00 μg/mL濃度，平均回收率在84.6%～93.5%，方法最低檢出限為0.004 mg/kg，方法定量限為0.020 mg/kg。方法具有前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高、經(jīng)濟(jì)、分析速度快等特點(diǎn)，適合在番石榴大規(guī)模上市前集中批量快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 多菌靈殘留；超高效液相色譜；熒光檢測(cè)器；MCX小柱；番石榴

中圖分類號(hào) S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）14-0116-02

番石榴營養(yǎng)豐富，VC含量極高，果實(shí)具有治療糖尿病及降低血糖的藥效，葉片也可以治療腹瀉。果實(shí)除了能鮮食外，還可加工成果汁、濃縮汁、果粉、果醬、濃縮漿、果凍等[1-2]。由于種植番石榴可獲得較好的經(jīng)濟(jì)效益，其在珠江三角洲地區(qū)種植面積廣，已成為廣大農(nóng)民發(fā)家致富的一條有效途徑。

多菌靈又名棉萎靈、苯并咪唑44號(hào)，化學(xué)名2-苯并咪唑基氨基甲酸甲酯，是一種廣譜性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果等多種病害的防治[3-6]。農(nóng)戶常用多菌靈農(nóng)藥來預(yù)防番石榴炭疽病，多菌靈農(nóng)藥目前還未列入農(nóng)業(yè)行政主管部門的例行監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，且大型農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)農(nóng)殘快速檢測(cè)試劑盒只針對(duì)果蔬中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)。因此，開發(fā)一種快速簡(jiǎn)單檢測(cè)多菌靈農(nóng)藥殘留的方法迫在眉睫。本試驗(yàn)使用超高效液相色譜議UPLC進(jìn)行檢測(cè)，采用了小內(nèi)徑柱，柱效提高，有更好的分離效果，多菌靈保留時(shí)間為5.356 min。通過簡(jiǎn)化樣品前處理過程、選擇合適的固相萃取小柱及流動(dòng)相，以達(dá)到回收率高、檢出限低的要求，本方法具有簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的特點(diǎn)，且熒光檢測(cè)器響應(yīng)值高，定性、定量準(zhǔn)確，滿足批量樣品檢測(cè)的工作要求，可在番石榴大規(guī)模上市前應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑。多菌靈標(biāo)樣（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所100 μg/mL）；乙腈、甲醇（德國merck色譜純）；鹽酸、無水硫酸鈉、氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水硫酸鎂、醋酸 （廣州化學(xué)試劑廠 GR）；癸烷磺酸鈉（阿拉丁GR）；磷酸、三乙胺（天津市科密歐 HPLC）；PSA（N-丙基乙二胺）、石墨炭黑（美國Agilent）；離子對(duì)試劑：吸取7.0 mL磷酸于200 mL水中，加入1.0 g癸烷磺酸鈉，超聲溶解，再加入10.0 mL三乙胺，稀釋到1 000 mL；磷酸鹽緩沖溶液（0.02 mol/L，pH值6.8）：1.38 g磷酸二氫鈉和1.41 g磷酸氫二鈉溶于900 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，定容至1 000 mL。

1.1.2 儀器與設(shè)備。電子天平（Precisa公司）；旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司XW-80A）；振蕩搖床（IKA KS501）；pH計(jì)（Sartorius PP-20-P11）；氮吹儀（天津恒奧 HGC-24A）；離心機(jī)（Sigma公司3-30k）；Waters超高效液相色譜儀（帶熒光檢測(cè)器）；分散機(jī)（德國IKA T18）；加速溶劑萃取ASE（DIONEX ASE100）；超純水器（Millipore公司Mini-Q）；固相萃取柱：NH2小柱（Agilent 500 mg，6 mL）；MCX小柱（Waters 150 mg，6 mL）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理。將番石榴四分法切碎后置于食品攪拌機(jī)中打漿，用塑料樣品瓶-18 ℃密封保存。

1.2.2 提取。準(zhǔn)確稱取試樣25.00 g（精確至0.01 g）于100 mL具塞離心管中，放入陶瓷均質(zhì)子（防止鹽結(jié)塊），加入約5 g無水硫酸鈉，再加入25 mL乙腈，蓋上蓋子，在搖床上振搖20 min后取出。以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，使乙腈和水分層。吸取5 mL乙腈提取液在50 ℃氮吹儀吹至近干，備用。

1.2.3 凈化。往吹至近干的試管中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸漩渦溶解殘?jiān)? min后，分2次待過柱。將MCX小柱依次用3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行預(yù)洗，待液面到達(dá)填料表面時(shí)，迅速加入提取液，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗不收集。最后用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，重復(fù)1次，擠干，收集。50 ℃氮吹儀吹至近干后，用1.0 mL流動(dòng)相溶解，過0.2 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。取1支多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，全部轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。相當(dāng)于濃度為10.00 μg/mL多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后置于-18 ℃條件下保存，有效期為1個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用流動(dòng)相定容現(xiàn)配現(xiàn)用，相當(dāng)于多菌靈濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL。

1.2.5 色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 2.1×150 mm 3.5 μm；流動(dòng)相：甲醇∶水（v/v）=6∶4；流速0.2 mL/min；檢測(cè)波長：熒光FLR激發(fā)波長286 nm、發(fā)射波長315 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相選擇

本試驗(yàn)分別考查了甲醇+癸烷磺酸鈉離子對(duì)試劑溶液（40+60）、乙腈+水（50+50）、甲醇+水（60+40）、乙腈+磷酸鹽緩沖溶液（80+20）作為流動(dòng)相對(duì)多菌靈的分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述幾種流動(dòng)相都能分離多菌靈，而考慮到對(duì)環(huán)境的影響因素和配制過程的復(fù)雜程度，選擇毒性相對(duì)較小、價(jià)格便宜且配制過程簡(jiǎn)單的甲醇+水（60+40）作為流動(dòng)相，多菌靈在番石榴基質(zhì)中的超高效液相色譜圖如圖1所示。endprint

2.2 固相萃取柱的選擇

分別選取6 mL的NH2小柱與MCX小柱做加標(biāo)回收試驗(yàn)，將NH2與MCX小柱進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)每種小柱做3個(gè)平行，選擇平均回收率高的作為凈化柱，NH2小柱凈化方法如下：按上述1.2.2步驟后，往吹至近干的試管加入2 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）漩渦溶解殘?jiān)? min后，待過柱。將NH2小柱用3 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）進(jìn)行預(yù)洗，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱子吸附層表面時(shí)，迅速加入提取液，再用3 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）淋洗，重復(fù)1次，擠干，收集。在用50 ℃氮吹儀吹至近干后，用1.0 mL甲醇溶解，過0.2 μm濾膜，待測(cè)。

結(jié)果表明：NH2小柱平均回收率接近65%，MCX小柱平均回收率則接近90%，因此，選擇MCX小柱作為凈化小柱。

2.3 樣品前處理的選擇

本試驗(yàn)前處理方法與加速溶劑萃取ASE進(jìn)行加標(biāo)回收提取效率比較，提取液氮吹近干后，按上述1.2.3步驟操作。結(jié)果表明：本試驗(yàn)方法與加速溶劑萃取ASE回收率都大于80%，皆可以作為多菌靈的提取方法。但考慮到加速溶劑萃取ASE操作復(fù)雜、萃取池少、需要定時(shí)更換儀器消耗品等特點(diǎn)，難以滿足快速批量檢測(cè)的需要。最后選擇乙腈振蕩提取，適合樣品量大，能快速篩查，滿足了批量檢測(cè)的工作要求。

2.4 固相萃取與QuEChERS的比較

QuEChERS是一種簡(jiǎn)單快速的樣品提取和凈化方法，多用于水果蔬菜中的多農(nóng)藥殘留檢測(cè)[7-12]。對(duì)比試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：稱5 g加標(biāo)質(zhì)控樣品于50 mL試管中，依次加入5 g無水硫酸鈉、1.5 mL醋酸、20 mL乙腈，振蕩搖床上振搖20 min取出，5 000 r/min離心5 min。取出乙腈提取液10 mL加入1 000 mg無水硫酸鈉、300 mg PSA（N-丙基乙二胺）、50 mg石墨炭黑旋渦混合5 min，5 000 r/min離心3 min。上清液過0.2 μm濾膜，待測(cè)。結(jié)果表明，經(jīng)QuEChERS方法前處理后供色譜上機(jī)分析時(shí)，干擾物質(zhì)較多，樣品分析基線分離不理想，目標(biāo)峰難以積分，不能準(zhǔn)確地定性、定量，容易出現(xiàn)假陽性。QuEChERS方法前處理簡(jiǎn)單，凈化后多供GC/MS或LC/MS分析[9-15]。由于質(zhì)譜分析法是對(duì)樣品離子質(zhì)荷比（m/z）的測(cè)定來進(jìn)行分析的一種分析方法，定性的準(zhǔn)確度要高于色譜分析。但由于GC/MS與LC/MS價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、維護(hù)成本高等特點(diǎn)不容易普及，因此本試驗(yàn)超高效液相色譜法不采用QuEChERS方法做前處理方法。

2.5 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

用不含多菌靈的番石榴空白溶液作基質(zhì)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得線性方程y=2 941 333x-19 929.5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。按本方法測(cè)定的結(jié)果，以3倍信噪比確定多菌靈分析物的檢出限（S/N=3）為0.004 mg/kg，10倍信噪比定量限（S/N=10）為0.020 mg/kg。

2.6 回收率與精密度

以不含多菌靈的番石榴溶液作空白基質(zhì)添加一定量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品做添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度重復(fù)測(cè)定6次，同時(shí)做空白試驗(yàn)。如表所示，添加平均回收率在84.6%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.74%～3.15%（表1）。說明該方法具有較好的回收率和精密度，可以滿足相關(guān)檢測(cè)要求。

3 結(jié)論與討論

通過優(yōu)化提取溶劑、樣品凈化等前處理方法建立了超高效液相色譜法測(cè)定番石榴中多菌靈農(nóng)藥殘留的方法。本方法采用超高效液相色譜達(dá)到了節(jié)約試劑，減少有機(jī)試劑對(duì)環(huán)境污染的目的，具有樣品前處理操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高和快速等特點(diǎn)，較高的靈敏度和精密度滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要，適用于番石榴樣品中多菌靈殘留快速、批量檢測(cè)的工作要求，在實(shí)際檢測(cè)過程中可以將其作為常規(guī)殘留檢測(cè)方法使用。

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