健那綠B和鐵蘇木精對線粒體染色比較

吳艷

摘 要 就健那綠B和鐵蘇木精對線粒體的染色進(jìn)行比較，指出兩者區(qū)別。

關(guān)鍵詞 健那綠B 鐵蘇木精 線粒體

中圖分類號 Q-33

觀察細(xì)胞中的線粒體和葉綠體是高中生物教材《分子與細(xì)胞》中的實驗，在不同版本的教材中，對線粒體染色所用的試劑分別給的是“健那綠B”和“鐵蘇木精”。很多人對這是一種試劑還是兩種不同試劑感到疑惑，嘗試在百度中搜“健那綠”一詞，結(jié)果在百度百科和百度文庫中都顯示這樣的信息：健那綠中文別名“詹納氏綠”、“雙氮嗪綠”、“鐵蘇木精”。健那綠B到底是不是鐵蘇木精？如果不是，它們對線粒體染色有何區(qū)別？下面就健那綠B和鐵蘇木精對線粒體染色進(jìn)行一些比較。

1 化學(xué)性質(zhì)

1.1 健那綠B

就健那綠B名稱：即雙氮嗪綠，英文名為Janus green B，曾被翻譯為詹納斯綠B。

分子式：C30H31N6Cl（圖1）。

健那綠B屬于堿性染料，本身為棕色或深棕色結(jié)晶性粉末。由于本身帶有N元素加上解離后呈正電荷，所以具有親水性，溶水后溶液呈藍(lán)色；微溶于醇。

1.2 蘇木素、蘇木精、鐵蘇木精

蘇木素英文名：hematoxylin，也拼成haematoxylin。

分子式：C16H12O6（圖2）。

蘇木素是一種堿性染料，是從洋蘇木中提取的一種染色劑，多為淡黃色或淺褐色的細(xì)粉末，略微溶于冷水及乙醚，溶于乙醇和熱水，也溶于堿性氫氧化物、硼砂、甘油等。因為沒有雙鍵的醌式結(jié)構(gòu)，蘇木素本身沒有染色能力，經(jīng)氧化后會成為具有雙鍵醌式結(jié)構(gòu)的蘇木精，同媒染劑一起使用，就具有很強(qiáng)的染色能力。

根據(jù)蘇木精溶液所用媒染劑的不同，可分為鋁蘇木精（用的是三價鋁鹽）、鐵蘇木精（用的是三價鐵鹽）等不同種類。常用的兩種鐵蘇木精溶液有Weigert氏溶液（使用氯化鐵銨作為媒染劑）和Heidenhain氏溶液（使用硫酸鐵銨作為媒染劑）。

2 染色原理及特點

2.1 健那綠B

健那綠B進(jìn)入活細(xì)胞后，可在細(xì)胞中被解離而帶有正電荷，與帶有負(fù)電荷的線粒體內(nèi)膜電性吸引，從而在線粒體內(nèi)膜上積累。健那綠B在氧化狀態(tài)下為有色，呈藍(lán)綠色；在還原狀態(tài)下為無色。因線粒體內(nèi)膜具有細(xì)胞色素氧化酶，使健那綠B始終處于氧化狀態(tài)而呈藍(lán)綠色；細(xì)胞質(zhì)中沒有細(xì)胞色素氧化酶，健那綠B被還原而呈無色狀態(tài)。

線粒體能在健那綠B染液中維持?jǐn)?shù)小時活性，在這期間通過高倍顯微鏡可以觀察到生活狀態(tài)的線粒體形態(tài)和分布。并非任何染料都可用于活體染色，只有那些對細(xì)胞無毒或毒性很小的染料且要配成濃度很低的溶液才能用于活體染色。健那綠B是可以專一性對線粒體進(jìn)行染色的活體染色劑。盡管如此，健那綠B也只能用于對動、植物體分離出來的活細(xì)胞或組織進(jìn)行體外活體染色；如果將它直接注入動物體內(nèi)，可以導(dǎo)致動物很快死亡。

健那綠B并非只能對活細(xì)胞的線粒體進(jìn)行染色。對于已經(jīng)死亡的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)呈氧化狀態(tài)，在健那綠B染液的作用下，整個細(xì)胞會被染成藍(lán)綠色；由于細(xì)菌細(xì)胞膜上存在氧化酶，故細(xì)菌細(xì)胞也可被染成藍(lán)綠色。

2.2 鐵蘇木精

蘇木素經(jīng)氧化后形成具有發(fā)色功能的雙鍵醌式結(jié)構(gòu)的蘇木精，再與媒染劑結(jié)合形成“媒染劑-染料-組織”的復(fù)合體，從而使材料顯現(xiàn)顏色。媒染劑含鹽種類不同，被染材料顯示的顏色也不同：用鐵鹽做媒染劑，材料可呈現(xiàn)深藍(lán)色至深褐色沉淀；用鋁鹽做媒染劑，材料通常顯示為藍(lán)白色。由三價鐵鹽作為媒染劑的鐵蘇木精，只能對固定液固定后的細(xì)胞和組織進(jìn)行染色。

不同的鐵蘇木精溶液，染色對象有一定差異：用氯化鐵銨作為媒染劑的Weigert氏鐵蘇木精是實驗室使用的標(biāo)準(zhǔn)鐵蘇木精溶液，特別是在染色顯示肌纖維時；用硫酸鐵銨作為媒染劑的Heidenhain氏鐵蘇木精用于細(xì)胞學(xué)染色觀察，比如用于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中線粒體的觀察。

3 試劑配制

3.1 健那綠B配制

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的健那綠B染液配制：稱取0.5 g健那綠溶解于50 mL生理鹽水中，加溫至30～40℃，使其充分溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

3.2 鐵蘇木精配制

Weigert氏溶液配制：

A液：1 g蘇木素、100 mL無水乙醇；

B液：4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的無水氯化鐵溶液、1 mL濃鹽酸、100 mL蒸餾水。

在酒精中溶解蘇木素，微熱。在另一個容器中混合鹽酸、氯化鐵和蒸餾水。兩種溶液都很穩(wěn)定，可以放置6個星期不變質(zhì)。染色前，把兩溶液等量混合，得到深黑色混合液，即可染色?；旌弦嚎梢员４?～2 d。

Heidenhain氏溶液配制：

染色劑：0.5 g蘇木素、10 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、90 mL蒸餾水；

媒染劑：25 g硫酸鐵銨、100 mL蒸餾水。

把染色劑和媒染劑分開配制，放置4～5星期成熟。染色時再混合。

4 染色操作

4.1 使用健那綠B對線粒體染色

為了防止葉綠體對線粒體的掩蓋和顏色的干擾，一般采用動物細(xì)胞或不含葉綠體的植物細(xì)胞進(jìn)行線粒體觀察。人的口腔上皮細(xì)胞易于取得，觀察方便，在多種版本高中生物教材中被廣泛應(yīng)用。在載玻片上滴加1～3滴健那綠B染液，將獲取的口腔上皮細(xì)胞浸入染液中，健那綠B可以很快進(jìn)入動物細(xì)胞中，即刻就可以顯微鏡下觀察。如果材料是不含葉綠體的植物細(xì)胞（例如洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞），染色過程和動物細(xì)胞相同，只是由于植物細(xì)胞有中膠層和細(xì)胞壁的存在，染色時間稍長（約10 min）。兩種不同材料制作的臨時裝片，均可通過高倍鏡觀察著色后的線粒體。

4.2 使用鐵蘇木精對線粒體染色

鐵蘇木精染色的對象通常是動物組織如白鼠的小腸、胰腺、肝臟、腎臟等，需要用到多種試劑材料，操作步驟繁瑣，耗時較長。近幾年，不少專家嘗試將實驗操作步驟改良，效果較好，方法如下：將獲取的新鮮動物組織塊置入Regaud固定液固定2 d，然后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的重鉻酸鉀溶液中鉻化5 d，經(jīng)蒸餾水約4 h換洗后放入鐵明礬溶液中媒染15 h，再置入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的蘇木精染液中染色1 d。染色后的組織塊在0.25%鐵明礬水溶液中分色5～6 h，在緩慢的自來水中藍(lán)化。然后用常規(guī)方法進(jìn)行乙醇脫水、二甲苯透明、浸石蠟并進(jìn)行石蠟包埋，切片3～4 μm厚度，烘干后經(jīng)2道二甲苯脫蠟就可用中性樹膠封片，制成切片標(biāo)本。

5 實驗觀察

線粒體普遍存在動植物細(xì)胞中，雖然是在細(xì)胞中比較大的細(xì)胞器，但較葉綠體小很多，常見的有短棒轉(zhuǎn)和圓球狀，一般直徑為0.5～1.0 μm，長1.5～3.0 μm，光鏡下可見，但大小幾乎接近光學(xué)顯微鏡的最低分辨率。

5.1 健那綠B染色后觀察

高倍顯微鏡下看到的線粒體，呈藍(lán)綠色的棒狀和圓球狀，隨細(xì)胞質(zhì)流動而運動；調(diào)節(jié)顯微鏡焦距，可觀察到不同層面上線粒體的情況。

5.2 鐵蘇木精染色后觀察

經(jīng)鐵蘇木精染色后制成的動物組織切片標(biāo)本，高倍顯微鏡下可清晰看到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體顆粒和細(xì)胞核呈現(xiàn)深藍(lán)色、底襯呈現(xiàn)淺灰色。

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