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    外周血循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)方法及應(yīng)用

    2015-09-10 05:21:32楊超程昌明楊慧敏邱耕
    分子診斷與治療雜志 2015年1期
    關(guān)鍵詞:突變型核酸外周血

    楊超程昌明楊慧敏邱耕★

    外周血循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)方法及應(yīng)用

    楊超1,2程昌明1楊慧敏1,2邱耕1,2★

    腫瘤是一種威脅人類(lèi)健康的重大疾病。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是基于分子水平上癌基因(oncogenes)的激活和抑癌基因(anti-oncogene)的失活所致。基因突變分析對(duì)于腫瘤診斷和預(yù)后至關(guān)重要。早期診斷被認(rèn)為是提高癌癥病人治愈率,降低其死亡率最有效的途徑。外周血循環(huán)腫瘤核酸中可檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞一致的基因突變。這些基因突變的檢測(cè)可以為腫瘤的分期及藥物的治療療效和預(yù)后提供豐富的信息。因此,外周血循環(huán)腫瘤DNA突變檢測(cè)為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的研究方向和領(lǐng)域。

    腫瘤;循環(huán)腫瘤DNA;基因突變分析;外周血

    [KEY WORDS]Tumor;Circulating tumor DNA;Gene mutation analysis;Peripheral blood

    分子診斷是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ),利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化,為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療提供信息和決策依據(jù)。人類(lèi)的許多遺傳性疾病、惡性腫瘤等重大疾病都是由于基因結(jié)構(gòu)的變異所引起,因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)基因熱點(diǎn)突變的早期、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的確認(rèn),對(duì)于人類(lèi)相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及早期治療具有非常重要的意義。

    1 腫瘤發(fā)生狀況與早期診斷

    腫瘤是一類(lèi)威脅人類(lèi)健康的重大疾病。2008年全球腫瘤新發(fā)病例1 270萬(wàn)例,死亡760萬(wàn)例(美國(guó)NIH數(shù)據(jù))[1-2]。預(yù)計(jì)到 2020年,全球腫瘤患者總數(shù)將超過(guò)1 500萬(wàn)人,死亡人數(shù)超過(guò)艾滋病、瘧疾和結(jié)核病的總和,全球每年用于腫瘤診療的費(fèi)用超過(guò)2 100億美元[3]。我國(guó)的腫瘤發(fā)病狀況同樣不容樂(lè)觀(guān),據(jù)衛(wèi)生部最新統(tǒng)計(jì)資料顯示,我國(guó)大中城市腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),每年新增近260萬(wàn)腫瘤患者。我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó),不僅腫瘤發(fā)病率高,而且死亡率也很高,惡性腫瘤患者年死亡率接近30%,5年以上生存率僅為31.77%[4]。目前臨床廣泛使用的手術(shù)切除、放療和化療等難以解決中晚期腫瘤治療的問(wèn)題,在可預(yù)期的未來(lái),通過(guò)對(duì)現(xiàn)有治療方案的改善遠(yuǎn)不能大幅度降低腫瘤患者的死亡率。

    實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷是提高腫瘤治愈率,降低腫瘤患者死亡率的有效途徑。2005年世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)就指出:如果能夠早期發(fā)現(xiàn),40%以上的癌癥是可以治愈的,包括乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等最常見(jiàn)的癌癥[5]。由于在腫瘤發(fā)生的早期,患者沒(méi)有明顯的體征變化,難以通過(guò)一般生化和影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤的蹤跡。而當(dāng)患者有明顯體征時(shí),腫瘤往往已經(jīng)發(fā)展到中晚期,錯(cuò)失了治療的最佳時(shí)機(jī)。無(wú)論是手術(shù)治療還是放化療,大部分中晚期腫瘤病人都預(yù)后不良,生存時(shí)間極為有限。腫瘤血清蛋白標(biāo)志物檢測(cè)是幫助發(fā)現(xiàn)早期腫瘤的一種重要方法,但是現(xiàn)有腫瘤血清蛋白標(biāo)志物普遍存在特異性不強(qiáng)的問(wèn)題。目前常用的腫瘤血清蛋白標(biāo)志物如甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、糖鏈抗原-125(carbohydrate antigen 125,CA125)等,并非腫瘤細(xì)胞所特有,也會(huì)存在于某些良性腫瘤、胚胎組織、甚至正常組織中。以肝細(xì)胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)為例,HCC是一種高度惡性腫瘤,早期多無(wú)明顯癥狀,確診時(shí)往往已屬中、晚期。目前HCC缺乏有效治療手段,中晚期HCC切除后復(fù)發(fā)率高,易轉(zhuǎn)移,其死亡率已居我國(guó)腫瘤死亡率的第二位。AFP是目前應(yīng)用最廣泛的HCC腫瘤標(biāo)志物,但仍有30%~40%的HCC患者AFP水平為正常,而活動(dòng)性肝病、生殖腺胚胎瘤患者和妊娠婦女的AFP水平也會(huì)升高[6]。如何從健康人群中發(fā)現(xiàn)腫瘤的高危個(gè)體,并進(jìn)行早期診斷,目前尚缺乏行之有效的方法。

    2 外周血核酸檢測(cè)與腫瘤分子診斷

    研究表明,腫瘤發(fā)生的根本原因在于分子水平上特定基因結(jié)構(gòu)的改變。腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常表現(xiàn)為多種基因結(jié)構(gòu)改變(如突變、重組等)導(dǎo)致癌基因的激活或抑癌基因的失活,且不同發(fā)展階段其癌基因或抑癌基因的活性有所差別[7-9]。通常,從最初的基因結(jié)構(gòu)改變到發(fā)生癌癥,大約需要十余年時(shí)間。所以,如果能在基因結(jié)構(gòu)改變到轉(zhuǎn)化為癌癥的這個(gè)階段檢測(cè)到患者血液中腫瘤特異性核酸標(biāo)志物,就可以對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行有效的診斷和預(yù)測(cè),獲得良好的治療效果[10-12]。

    腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移伴隨其發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程,它包括一系列內(nèi)在聯(lián)系的步驟,即粘附、降解和移動(dòng)。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)分泌抑制黏附因子表達(dá)的物質(zhì)降低細(xì)胞的粘附性,增加其運(yùn)動(dòng)能力。因此,在腫瘤發(fā)生的早期,腫瘤細(xì)胞就已具有侵襲和微轉(zhuǎn)移的特性[13]。研究發(fā)現(xiàn),具備侵襲和微轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細(xì)胞可以破壞宿主結(jié)締組織而進(jìn)入脈管系統(tǒng)。除此之外,診療操作也可使腫瘤細(xì)胞人為擴(kuò)散進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)。通??梢园岩蜃园l(fā)或診療操作進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞稱(chēng)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)[14]。顯然,如果能在腫瘤早期患者的外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞,了解腫瘤細(xì)胞的基因突變狀況,對(duì)于腫瘤的早期診斷和個(gè)體化治療都具有十分重要的意義[15-16]。在腫瘤發(fā)生的早期,進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞數(shù)量很少,通常約1×108個(gè)白細(xì)胞和5×1010個(gè)紅細(xì)胞中僅有數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞,常規(guī)的檢測(cè)手段如影像學(xué)及血清腫瘤標(biāo)記物檢查等,無(wú)法直接發(fā)現(xiàn)這些通過(guò)外周血液循環(huán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。因此,為了提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出率,需在檢測(cè)前對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集。目前,循環(huán)腫瘤細(xì)胞最主要的富集方法是免疫磁性分離法(immunomagnetic separation,IMS),見(jiàn)圖1。該方法通過(guò)磁珠表面的特異性單抗與腫瘤細(xì)胞表面抗原發(fā)生免疫識(shí)別反應(yīng),從血液中分離出待檢測(cè)腫瘤細(xì)胞[17-18]。這些特異性單抗主要針對(duì)上皮細(xì)胞抗原,如上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)等;或器官特異性標(biāo)志物,如前列腺特定抗原(prostate-specific antigen,PSA)、人表皮生長(zhǎng)因子受體 (human epidermal growthfactor receptor,HER)的抗體等[19-20]。由于目前尚無(wú)循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性抗原,針對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞所采用的抗體識(shí)別能力較差,往往會(huì)造成假陽(yáng)性或假陰性檢測(cè)結(jié)果,這些檢測(cè)特異性和靈敏性問(wèn)題限制了循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用[21-22]。

    圖1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)[14]

    除循環(huán)腫瘤細(xì)胞外,實(shí)現(xiàn)腫瘤分子診斷的另一種方法是外周血循環(huán)核酸檢測(cè)。腫瘤患者外周血中的循環(huán)核酸除了來(lái)源于凋亡的正常細(xì)胞外,還有來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的核酸物質(zhì)。1977年Leon等[23]人首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清或血漿中的循環(huán)核酸濃度高于正常人約10~100倍,該結(jié)論為腫瘤分子診斷提供了新的思路和方法。從外周血循環(huán)核酸的濃度看,在早期腫瘤患者血清或血漿中就可檢測(cè)出較高濃度的循環(huán)核酸,而且這種循環(huán)核酸濃度的變化要遠(yuǎn)早于影像學(xué)等檢測(cè)到的腫瘤組織變化[24-25]。關(guān)于腫瘤患者外周血循環(huán)核酸升高的原因有多種解釋?zhuān)饕幸韵?種觀(guān)點(diǎn) (圖2):(1)循環(huán)腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶的裂解;(2)腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死;(3)腫瘤細(xì)胞增生旺盛,自發(fā)性所釋放的核酸[26-27]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,按腫瘤患者外周血循環(huán)核酸濃度推算,每毫升血中至少應(yīng)含1 000~10 000個(gè)腫瘤細(xì)胞,而實(shí)際每毫升血中僅能檢測(cè)到數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞,顯然循環(huán)腫瘤細(xì)胞或微轉(zhuǎn)移灶的裂解并非外周血循環(huán)核酸濃度升高的主要原因[28]。腫瘤細(xì)胞自發(fā)性釋放核酸的觀(guān)點(diǎn)能較好地解釋腫瘤患者外周血出現(xiàn)高水平游離核酸的現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞相對(duì)正常細(xì)胞更容易脫落,脫落的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液后會(huì)被人體免疫細(xì)胞攻擊殺死,在酶的作用下成為核酸碎片,造成腫瘤患者血清中循環(huán)核酸濃度升高。但是現(xiàn)在越來(lái)越多證據(jù)也表明,除腫瘤細(xì)胞增生旺盛時(shí)自發(fā)釋放核酸外,腫瘤細(xì)胞凋亡也是外周血循環(huán)游離核酸的一個(gè)重要來(lái)源。

    圖2 外周血中循環(huán)核酸的主要來(lái)源[27]

    相比于從數(shù)以?xún)|計(jì)的血細(xì)胞中分離出數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù),往往更容易從高濃度的外周血循環(huán)核酸中發(fā)現(xiàn)來(lái)自腫瘤細(xì)胞的核酸標(biāo)志物,而且循環(huán)核酸中的突變基因與腫瘤的相關(guān)性高,具有更好的特異性,可作為腫瘤診斷的重要標(biāo)志物。通過(guò)對(duì)外周血循環(huán)核酸中腫瘤核酸標(biāo)志物進(jìn)行定性和定量檢測(cè),不僅可用于腫瘤篩查、早期診斷、輔助診斷、良惡性鑒別和臨床分期,對(duì)監(jiān)測(cè)療效、判斷預(yù)后、預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也具有重要價(jià)值[29-31]。由于外周血循環(huán)腫瘤核酸標(biāo)志物檢測(cè)所需的樣本是外周血,易于取得,避免了活組織取樣對(duì)人體的傷害,作為一種微創(chuàng)性檢測(cè)技術(shù),尤其適合健康人群和腫瘤高危人群的篩查,以及腫瘤患者術(shù)后的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

    3 外周血循環(huán)突變基因檢測(cè)

    在腫瘤患者的外周血循環(huán)核酸中,大多數(shù)是來(lái)源于正常細(xì)胞凋亡所釋放的核酸 (簡(jiǎn)稱(chēng)為野生型),來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的核酸(簡(jiǎn)稱(chēng)為突變型)在循環(huán)核酸總量中所占比例非常低。研究發(fā)現(xiàn),在中晚期癌癥患者外周血循環(huán)核酸總量中所占的比例一般僅為8%~10%左右,在腫瘤早期甚至低至0.01%~1.7%[32-34]。此外,突變型與野生型相比僅一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的差別,所造成的基因理化特性改變甚微,無(wú)疑使檢測(cè)循環(huán)核酸中的低含量的突變型核酸極為困難,這也對(duì)該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度提出了更高的要求。

    目前,DNA測(cè)序法是核酸序列分析的 “金標(biāo)準(zhǔn)”,由于外周血循環(huán)核酸檢測(cè)中大量野生型的存在,直接測(cè)序僅能檢測(cè)到樣本中比例高于20%的突變型,難以達(dá)到檢測(cè)外周血循環(huán)核酸中低含量突變型核酸的要求[35-36]。另外,由于外周血循環(huán)核酸中存在大量的野生型,常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)對(duì)微少突變型進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)容易產(chǎn)生偏向性擴(kuò)增,即野生型由于數(shù)量占優(yōu)而被優(yōu)先擴(kuò)增,導(dǎo)致樣本中突變型的相對(duì)比例進(jìn)一步降低,不利于后續(xù)的突變型的檢測(cè)。除此之外,非特異擴(kuò)增的干擾,實(shí)驗(yàn)過(guò)程的繁瑣以及諸多不確定因素的影響導(dǎo)致此類(lèi)方法對(duì)突變型的檢測(cè)靈敏度也只能達(dá)到1%~10%左右[37-40],常見(jiàn)突變檢測(cè)技術(shù)見(jiàn)表1。因此,如何提高突變檢測(cè)的靈敏度,實(shí)現(xiàn)對(duì)循環(huán)核酸中腫瘤細(xì)胞特異性核酸標(biāo)志物的檢測(cè)是生物醫(yī)學(xué)研究者亟待解決的難題。

    表1 常見(jiàn)突變檢測(cè)技術(shù)的靈敏度Table 1 Sensitivity for detecting mutation of the routine gene analysis methods

    近年來(lái)的研究表明,單純的生物學(xué)方法已很難進(jìn)一步提高突變檢測(cè)的靈敏度,而將納米材料與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合,借助納米材料的獨(dú)特性質(zhì)提高對(duì)生物分子的檢測(cè)靈敏度已逐步成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[49-50]。美國(guó)納斯達(dá)克上市的Luminex公司研發(fā)的液相懸浮芯片技術(shù) (又稱(chēng)微球依賴(lài)的懸浮點(diǎn)陣技術(shù),Luminex xMAPTM),將熒光微球與探針特異性延伸反應(yīng)結(jié)合,最后采用自行開(kāi)發(fā)的液相芯片熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),為高通量核酸分析提供了新的平臺(tái),具有檢測(cè)時(shí)間短,微陣列應(yīng)用靈活等優(yōu)點(diǎn)[51-52],見(jiàn)圖 3。Cheng等[53-55]提出了基于磁性微球和微乳液PCR方法的BEAMing技術(shù),通過(guò)乳液PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)微少突變基因進(jìn)行擴(kuò)增,避免了大量野生型基因?qū)ξ⑸偻蛔兓驍U(kuò)增的干擾,而且將擴(kuò)增的突變基因富集在磁珠表面,再通過(guò)熒光分子信標(biāo)(molecular beacon)探針雜交過(guò)程將突變信號(hào)轉(zhuǎn)化為磁性微球的熒光信號(hào),最后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),該方法對(duì)點(diǎn)突變基因的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01%。但是上述兩種方法的檢測(cè)步驟煩瑣,對(duì)設(shè)備要求較高,而且檢測(cè)設(shè)備和試劑均需進(jìn)口,檢測(cè)價(jià)格不菲,在我國(guó)難以得到廣泛使用。此外,上述兩種技術(shù)均采用熒光標(biāo)記和分析方法,由于熒光染料比較容易淬滅,對(duì)突變檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性也有一定程度的影響。

    圖3 基于納米材料的Barcode DNA蛋白檢測(cè)技術(shù)[50]

    目前針對(duì)外周血腫瘤細(xì)胞循環(huán)核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì),作者所在研究團(tuán)隊(duì)利用生物芯片上海國(guó)家工程研究中心的現(xiàn)有資源,通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)專(zhuān)利,并向有關(guān)專(zhuān)家、學(xué)者咨詢(xún),基于磁納米材料技術(shù)設(shè)計(jì)了兩條微少突變基因檢測(cè)技術(shù)路線(xiàn),其技術(shù)具有特異性高、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。技術(shù)路線(xiàn)一,見(jiàn)圖4:采用乳液PCR(emulsion PCR)結(jié)合等位基因特異性擴(kuò)增(allele-specific amplification)的懸浮液相芯片技術(shù)檢測(cè)核酸突變型,簡(jiǎn)稱(chēng)EARMS技術(shù)。該技術(shù)以乳液PCR作為靶基因擴(kuò)增方式,避免了大量野生型對(duì)微量突變型擴(kuò)增的干擾,通過(guò)等位基因特異性引物,實(shí)現(xiàn)突變型的特異性擴(kuò)增和標(biāo)記。同時(shí),該技術(shù)結(jié)合磁性微球的特性,利用磁性分離方法將突變型分子數(shù)量轉(zhuǎn)化為磁珠的數(shù)量。最后通過(guò)熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀對(duì)磁珠表面的突變型分子熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),以達(dá)到對(duì)突變型進(jìn)行定量或定性分析的目的[55]。本技術(shù)將微少突變型的特異性擴(kuò)增和標(biāo)記簡(jiǎn)化為一步反應(yīng),大大縮減了檢測(cè)步驟,降低了檢測(cè)成本。模擬樣本檢測(cè)結(jié)果顯示,該技術(shù)對(duì)突變基因的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1%~0.01%,基本滿(mǎn)足了外周血循環(huán)腫瘤核酸標(biāo)志物檢測(cè)的要求。

    圖4 乳液PCR結(jié)合等位基因特異性擴(kuò)增的懸浮液相芯片技術(shù)檢測(cè)微少突變基因[55]

    技術(shù)路線(xiàn)二,見(jiàn)圖5:采用磁珠分離技術(shù)結(jié)合連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction,LDR)對(duì)核酸突變型進(jìn)行特異性富集,最后采用高靈敏的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行突變型檢測(cè)。該技術(shù)主要包括PCR預(yù)擴(kuò)增、LDR連接和電化學(xué)發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記、磁珠捕獲、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)4個(gè)步驟。首先對(duì)細(xì)胞或非細(xì)胞體系中提取的基因組DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,然后針對(duì)發(fā)生點(diǎn)突變的堿基設(shè)計(jì)檢測(cè)探針和匹配探針,其中檢測(cè)探針5′端連接識(shí)別分子,匹配探針的3′端標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光信號(hào)分子。兩種探針以突變型為模板進(jìn)行連接反應(yīng)。然后通過(guò)表面帶有與探針識(shí)別分子匹配的捕獲分子的磁珠捕獲LDR連接產(chǎn)物。最后分離出磁珠,用電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)磁珠表面的突變型信號(hào)[56]。該技術(shù)具有快速、高效、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),可以檢測(cè)到樣品中含量低至0.01%的突變型型,具有極高的檢測(cè)靈敏度,并能達(dá)到多個(gè)突變同時(shí)檢測(cè)的目的,在腫瘤早期檢測(cè)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

    圖5 連接酶檢測(cè)反應(yīng)結(jié)合磁珠富集的電化學(xué)發(fā)光-突變基因檢測(cè)技術(shù)[56]

    上述核酸突變型檢測(cè)技術(shù)主要針對(duì)外周血中腫瘤相關(guān)靶基因或突變進(jìn)行檢測(cè),可用于腫瘤的早期篩查、術(shù)后監(jiān)控以及用藥指導(dǎo)等,具有靈敏度高、特異性好、成本低的優(yōu)點(diǎn)。而且,由于所檢測(cè)樣本主要來(lái)源于外周血,來(lái)源豐富,易于獲取,避免了手術(shù)等手段對(duì)人體的傷害。本項(xiàng)目所涉及的相關(guān)技術(shù)作為一類(lèi)微創(chuàng)性的檢測(cè)技術(shù),尤其適合健康人群和腫瘤高危人群的篩查,以及腫瘤患者術(shù)后的長(zhǎng)期監(jiān)控。目前,作者所在單位正以以上相關(guān)技術(shù)作為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)相應(yīng)的腫瘤檢測(cè)系列產(chǎn)品和服務(wù),推進(jìn)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。

    4 結(jié)語(yǔ)

    目前,腫瘤的臨床診斷仍然依賴(lài)于病理或細(xì)胞學(xué)檢查,然而通過(guò)有創(chuàng)性組織活檢往往會(huì)給患者造成巨大的痛苦,因此探尋一種新的腫瘤診斷方法是當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。由于外周血循環(huán)核酸包含來(lái)自腫瘤細(xì)胞的核酸,具有和惡性腫瘤相關(guān)的分子生物學(xué)特征,可作為敏感高效的腫瘤分子標(biāo)志物,它不僅能提供關(guān)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展?fàn)顩r的豐富信息,而且相對(duì)活組織取樣等創(chuàng)傷性取樣方式,循環(huán)核酸檢測(cè)具有取樣方便、微創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn),便于連續(xù)檢測(cè)和隨訪(fǎng)追蹤。所以基于外周血循環(huán)核酸開(kāi)發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)及結(jié)果判定簡(jiǎn)單的腫瘤早期檢測(cè)方法將會(huì)成為腫瘤分子診斷技術(shù)研究的一個(gè)熱點(diǎn)和重要發(fā)展方向。隨著外周血循環(huán)核酸基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究在深度及廣度上的日益加大,外周血循環(huán)核酸的檢測(cè)將為腫瘤篩查診斷、療效觀(guān)察及預(yù)后監(jiān)測(cè)展示出了廣闊的臨床應(yīng)用前景。

    隨著生物技術(shù)的發(fā)展,腫瘤的早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)、個(gè)體化治療以及復(fù)發(fā)監(jiān)控等越來(lái)越受益于腫瘤分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及其檢測(cè)方法的完善。盡管目前科學(xué)界對(duì)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全明了,但基因結(jié)構(gòu)的變化仍被認(rèn)為是誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生關(guān)鍵因素。通過(guò)對(duì)外周血循環(huán)核酸中來(lái)自腫瘤細(xì)胞的特異性基因結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行檢測(cè)是腫瘤分子診斷的一個(gè)重要研究方向。高靈敏度微少突變型檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)將為腫瘤分子診斷提供一種準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)工具,不僅有助于提高我國(guó)腫瘤的診治水平,填補(bǔ)國(guó)內(nèi)相關(guān)技術(shù)空白,而且也將推動(dòng)分子診斷行業(yè)的發(fā)展,獲取巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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    The detection methods and applications of circulating tumour DNA in peripheral blood

    YANG Chao1,2,CHENG Changming1,YANG Huimin1,2,QIU Geng1,2★
    (1.National Engineering Center for Biochip at Shanghai,Shanghai,China,201203;2.Shanghai Biomedical Lab Co.,Ltd,Shanghai,China,200436)

    Tumor is a major threat to human health.Recent studies showed that oncogenesis were on account of the activation of oncogene and the inactivation of tumor suppressor gene at the molecular level.Gene mutation analysis is crucial in the diagnosis and prognosis of tumor.Early diagnosis has been proved to be the most effective way to improve the survival rates and decrease the mortality of cancer patients.Tests showed that gene mutations in the circulating tumor in peripheral blood were the same as what in tumor cells.The detection of these gene mutations may provide abundant information for the staging of tumor and the rapeutic effect and prognosis of drug.Hence, detecting of tumor-associated mutation in circulatory DNA in peripheral blood provides new direction for tumor early-stage diagnosis and therapy.

    上海市科技成果轉(zhuǎn)化和產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(13CT1900900)

    1.生物芯片上海國(guó)家研究中心,上海 201203 2.上海伯豪醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,上海 200436

    邱耕,E-mail:qiugeng@shbiochip.com

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