外源瘦素對(duì)蛋雞能量代謝及OB—R基因表達(dá)的影響

張楠楠　白康　陳輝等

摘要： 為了研究外源瘦素對(duì)蛋雞的能量代謝調(diào)控、瘦素受體基因表達(dá)的影響，選用25羽30周齡、體況相似的海蘭褐商品蛋雞，隨機(jī)分成5組，每組5羽：Ⅰ組為自由攝食組；Ⅱ組為禁食對(duì)照組，注射瘦素稀釋液（0 75%PBS-BSA）；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為試驗(yàn)注射組，在第8至第10天注射瘦素，注射水平分別為50、200、400 μg/（kg·d）。結(jié)果表明：與Ⅰ、Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅴ組采食量顯著下降（P<0 05），試驗(yàn)Ⅲ至Ⅴ組的采食量分別為Ⅱ組的92 86%、89 89%、75 46%；Ⅱ組體質(zhì)量相對(duì)于Ⅰ組極顯著下降（P<0 01），相對(duì)于Ⅲ、Ⅳ組顯著下降（P<0 05），其余各組間均無明顯差異，其中試驗(yàn)Ⅱ至Ⅴ組蛋雞的體質(zhì)量分別為Ⅰ組體質(zhì)量的92 25%、99 18%、98 53%、95 30%；與Ⅴ組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組的腹脂率差異顯著（P<0 05），分別僅為Ⅴ組的58 98%、45 84%、58 71%，其余各組間均無明顯差異；與Ⅰ、Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組葡萄糖含量差異顯著（P<0 05），分別為Ⅱ組的72 64%、61 15%、59 59%，而試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅰ組無顯著差異；各組甘油三酯含量無明顯變化，在各組之間差異不顯著；試驗(yàn)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟OB-R基因表達(dá)量分別為Ⅱ組的35 19%、617%、741%、3 09%，試驗(yàn)各組之間OB-R基因表達(dá)量差異不顯著。綜上所述，瘦素對(duì)蛋雞食欲具有抑作用，瘦素使蛋雞采食量下降，表現(xiàn)為體質(zhì)量降低，葡萄糖、甘油三酯含量、肝臟OB-R基因表達(dá)量隨著瘦素注射量的增加呈下降的趨勢。

關(guān)鍵詞： 外源性瘦素；跖部靜脈注射；蛋雞；注射水平；能量代謝；OB-R基因

中圖分類號(hào)：S831 915 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0198-04

瘦素（leptin，LEP），是一種由肥胖基因（obese gene，ob基因） 編碼、特定mRNA翻譯，經(jīng)過加工修飾而成的蛋白質(zhì)類產(chǎn)物，1994年由Zhang等首次發(fā)現(xiàn) [1]。瘦素通過結(jié)合瘦素受體發(fā)揮其廣泛的生理作用，瘦素具有抑制食欲，調(diào)節(jié)能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌、生長、生殖、免疫反應(yīng)等多種功能。脂肪是禽類機(jī)體重要的儲(chǔ)存與提供能量的物質(zhì)之一，蛋雞的脂肪主要集中在腹部與肌胃上，而肝臟被認(rèn)為是雞脂質(zhì)合成的最主要場所 [2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素發(fā)揮其促進(jìn)蛋雞能量代謝等生物功能需要OB-R（瘦素受體）的介導(dǎo)，雞OB-R在脂肪、肝臟中都有一定的表達(dá) [5]。目前，瘦素在蛋雞上的相關(guān)研究依然較少，本試驗(yàn)通過對(duì)蛋雞注射外源瘦素，觀察外源瘦素對(duì)蛋雞能量代謝及腹脂、肝臟OB-R基因表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步研究外源瘦素在蛋雞上的相關(guān)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用雞為30周齡、體況相似的海蘭褐商品蛋雞。瘦素：粉狀，純度≥97%，批號(hào)：L3772-1MG，美國Sigma公司。

1 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選擇20羽30周齡、體質(zhì)量相近[（1 560 ±114） g]的蛋雞，隨機(jī)分為5組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組，每組5羽雞。預(yù)試期1周，第8至第13天為試驗(yàn)期，試驗(yàn)期每天8：00注射組通過跖部靜脈注射經(jīng)0 75%PBS-BSA稀釋液稀釋后的商品化重組小鼠瘦素，注射水平分別為50、200、400 μg/（kg·d），對(duì)照組注射稀釋液。具體試驗(yàn)處理方案見表1。

試驗(yàn)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，按照我國NY/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行配制，其營養(yǎng)組成和營養(yǎng)水平見表2。

1 3 樣品采集與制備

試驗(yàn)期以d為單位，稱取每羽雞體質(zhì)量。試驗(yàn)期的第10天10：00通過跖部采集血液至肝素鈉真空采血管中，3 000 r/min 離心10 min，取血漿，-20 ℃保存。

試驗(yàn)結(jié)束后，于早晨對(duì)所有蛋雞采取頸靜脈放血宰殺，迅速剖開腹腔，在無RNA降解酶的環(huán)境下，取黃豆粒大小的肝臟與脂肪組織包裹于高溫滅菌的鋁箔紙中，放于標(biāo)記好的紗布袋中，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1 4 指標(biāo)測定

1 4 1 體質(zhì)量、腹脂沉積率的測定 試驗(yàn)期以天（d）為單位，通過稱取每羽雞的體質(zhì)量記錄采食量。

腹脂率：剝離將屠宰蛋雞的腹脂（包括肌胃上的脂肪），然后在電子天平上稱質(zhì)量，計(jì)算腹脂率。

1 4 2 血液指標(biāo)的測定 甘油三酯（TG）含量的測定采用GPO-PAP法，試劑盒購自中生北控生物科技有限公司；血糖（GLU）含量測定采用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行，試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑公司。

1 4 3 腹脂、肝臟中OB-R mRNA表達(dá)水平的測定

1 4 3 1 總RNA的提取和檢測 取30～50 mg組織，用 E Z N A TM Total RNA Kit II提取試劑盒（OMEGA）進(jìn)行總RNA提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用紫外吸收測定法測定RNA的 D260 nm、D280 nm、RNA樣本的質(zhì)量濃度、純度（D260 nm/D280 nm）。

1 4 3 2 反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA及cDNA第1鏈的檢測 （1）DNA第1鏈的制備。根據(jù)所測RNA質(zhì)量濃度來調(diào)整RNA體積，使各個(gè)樣品RNA濃度一致，保證反轉(zhuǎn)錄體系中所加的RNA量相同。用TransScriptⅡFirst-Stand cDNA合成試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。25 μL反應(yīng)體系為：5 μL RNA（1 μg/μL）、1 25 μL Oligo（dT18）、12 5 μL 2×ES Reaction Mix、1 25 μL EasyscriptTM Ri/RT Enzyme Mix、5 μL RNase-free Water。將以上組分輕輕混勻，于42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min，將得到的cDNA于-20 ℃保存。

（2）cDNA第1鏈的檢測。用持家基因β-actin對(duì)所得cDNA進(jìn)行檢測，β-actin的引物對(duì)cDNA擴(kuò)增片段長度為110 bp，而基因組擴(kuò)增片段長度為328 bp，若RNA樣品中有DNA的污染，則cDNA檢測會(huì)擴(kuò)增出105、328 bp 2個(gè)片段。

1 4 3 3 引物設(shè)計(jì)與合成 選擇β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為參比基因，在GenBank中查找OB-R、β-actin的基因序列，應(yīng)用Primer 5、Oligo 6 0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)已知的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表3），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以持家基因β-actin為內(nèi)參、OB-R為目的基因，以合成的cDNA為模板，按照普通PCR程序，初步擴(kuò)增檢測所合成引物的特異性。

1 4 3 4 PCR反應(yīng) 用Easy-TaqDNA Polymerase試劑盒對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，15 μL反應(yīng)體系為：7 5 μLPCR Mix、各0 2 μL目的基因上下游引物、1 2 μL cDNA、5 9 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1 4 3 5 PCR產(chǎn)物的回收及克隆測序 瓊脂糖凝膠電泳分離：在紫外燈下割取目的片段，用DNA回收試劑盒純化，將回收的DNA片段與載體連接，用E coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆，挑取陽性克隆并用PCR鑒定后，送到華大基因有限公司進(jìn)行測序。

1 4 3 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 采用 TransStart Taq DNA Polymerase 熒光定量試劑盒對(duì)樣品的cDNA、內(nèi)參基因、陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，整個(gè)反應(yīng)在ABI 7 500序列擴(kuò)增儀中進(jìn)行。15 μL反應(yīng)體系為：1 2 μL cDNA、各0 2 μL目的基因上、下游引物、7 5 μSYBR Real Master Mix、5 9 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃12 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。72～95 ℃，每0 2 ℃讀板1次，1 s/次，每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用ΔΔCT算法計(jì)算樣品中目標(biāo)基因相對(duì)與持家基因的表達(dá)量，最后取平均值。CT指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量等于目的基因的表達(dá)量平均值除以參比基因的表達(dá)量平均值，即獲得目的基因的1個(gè)相對(duì)比值，用以表示其mRNA 表達(dá)水平。

1 5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS Statistics 17 0軟件ANVON模塊進(jìn)行方差分析，各組間的平均值采用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX- 5]±s）表示，P<0 05為差異顯著，P<0 01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2 1 外源性重組小鼠瘦素對(duì)蛋雞能量代謝的影響

2 1 1 外源瘦素對(duì)蛋雞采食量、體質(zhì)量、腹脂率的影響 由表4可以看出，外源瘦素對(duì)蛋雞采食量的影響表現(xiàn)為：與Ⅰ、Ⅱ組相比，Ⅴ組采食量顯著下降（P<0 05），Ⅲ至Ⅴ組采食量分別為Ⅱ組的92 86%、89 89%、75 46%；與Ⅰ組相比，Ⅱ至Ⅳ組采食量差異不顯著。對(duì)蛋雞體質(zhì)量的影響表現(xiàn)為：所有的禁食組在禁食2 d之后出現(xiàn)蛋雞體質(zhì)量顯著下降的現(xiàn)象，Ⅱ組與Ⅰ組相比下降極顯著（P<0 01），與Ⅲ、Ⅳ組相比下降顯著（P<0 05），其余各組間均無明顯差異，其中Ⅱ～Ⅴ組蛋雞體質(zhì)量分別為Ⅰ組的92 25%、99 18%、98 53%、9530%。對(duì)蛋雞腹脂率影響表現(xiàn)為：與Ⅴ組相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組腹脂率差異顯著（P<0 05），分別僅為Ⅴ組的58 98%、4584%、58 71%，其余各組間均無明顯差異。

2 1 2 外源瘦素對(duì)血漿中葡萄糖、甘油三酯含量的影響由

2 2 外源瘦素對(duì)蛋雞OB-R基因定量表達(dá)的影響

2 2 1 總RNA的提取和RT-PCR擴(kuò)增 由圖1可以看出，各組總RNA提取后在瓊脂糖凝膠電泳圖上顯示出2條清晰的條帶，分別為28S、18S rRNA。經(jīng)生物學(xué)軟件分析，28S、18S rRNA條帶的亮度比值>1 5，表明總RNA無降解。用分光光度計(jì)測定RNA濃度結(jié)果表明，所有樣品的總RNA的 D260 nm/D280 nm 均在2 0左右，表明無蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。確定提取的RNA質(zhì)量完好后，可用于后續(xù)的cDNA的合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

cDNA質(zhì)量檢測：以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用 β-actin 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所得片段長度為110 bp，若RNA中存在污染，則可得到1條長度為328 bp的擴(kuò)增引物。所有cDNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，所得產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中均顯示出長度為110 bp的單一條帶（圖2），未見長度為328 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明RNA中無DNA污染，符合PCR反應(yīng)的要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2 2 2 外源性重組小鼠瘦素對(duì)蛋雞OB-R基因定量表達(dá)的影響 由表6可見，試驗(yàn)各組之間腹脂OB-R基因表達(dá)量及肝[CM（25]臟OB-R基因的表達(dá)量差異均不顯著，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組腹脂OB-R基因表達(dá)量分別為自由攝食組的49 37%、 1013%、27 85%、29 11%；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟OB-R基因的表達(dá)量分別為禁食對(duì)照組的35 19%、6 17%、7 41%、3 09%。

3 討論

3 1 外源性瘦素對(duì)蛋雞采食量、體質(zhì)量、腹脂率的影響

體質(zhì)量、體內(nèi)脂肪沉積情況是衡量家禽生長發(fā)育狀況的關(guān)鍵指標(biāo)，體質(zhì)量、脂肪質(zhì)量的過高或過低都會(huì)對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能造成不利影響 [6]。王淑紅等研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞產(chǎn)蛋后期體質(zhì)量對(duì)產(chǎn)蛋量有極顯著影響，體質(zhì)量大于2 102 g時(shí)，蛋雞的生產(chǎn)性能較差 [7]。Cassy等研究認(rèn)為，瘦素對(duì)雞的采食量、體質(zhì)量的調(diào)控與雞的年齡和品系有關(guān) [8]。蛋雞采食量也會(huì)直接或間接影響體質(zhì)量、脂肪的沉積量，瘦素具有降低采食量的作用，Cassy等研究報(bào)道，通過腹腔內(nèi)注射重組雞瘦素[1 mg/（kg·d）]使56日齡蛋雞攝食量顯著降低38%，9日齡蛋雞攝食量顯著降低15% [8]。宋岳強(qiáng)研究表明，在連續(xù) 2 d 對(duì)家鴨進(jìn)行靜脈注射外源性瘦素后發(fā)現(xiàn)，瘦素可以降低家鴨體質(zhì)量 [9]。本試驗(yàn)中，2 d的禁食引起所有禁食組的蛋雞體質(zhì)量、腹脂率下降，經(jīng)過重新提供水料，隨著外源性重組小鼠瘦素水平的升高，蛋雞體質(zhì)量卻還一直呈現(xiàn)下降趨勢，與宋岳強(qiáng)的研究結(jié)果 [9]基本一致，但是蛋雞的腹脂率總體呈現(xiàn)增加的趨勢。試驗(yàn)Ⅴ組腹脂率與試驗(yàn)Ⅱ組相比顯著增加（P<0 05），由于瘦素有抑制脂肪沉積的作用，可以推斷短期注射外源性瘦素對(duì)脂肪的沉積可能無明顯影響，而對(duì)蛋雞體質(zhì)量影響較為顯著。

3 2 外源性瘦素對(duì)血漿中葡萄糖、甘油三酯含量的影響

瘦素通過與外周組織受體結(jié)合而影響一系列機(jī)體代謝過程，糖、脂肪提供動(dòng)物生命活動(dòng)所需的能量。葡萄糖在動(dòng)物機(jī)體糖代謝過程中起著關(guān)鍵作用，是機(jī)體主要的供能物質(zhì)，其含量高低與生產(chǎn)性能的發(fā)揮關(guān)系密切，而甘油三酯是脂類代謝過程中的1種重要中間代謝產(chǎn)物，能反映機(jī)體脂肪合成與分解的狀況。瘦素與糖、脂代謝有著復(fù)雜關(guān)系，瘦素缺乏可能會(huì)導(dǎo)致肥胖與糖尿病的發(fā)生 [10]。Cheung等給予小鼠注射重組瘦素后，發(fā)現(xiàn)小鼠代謝效率、能量消耗增加，葡萄糖敏感神經(jīng)元受到抑制 [11]。有研究在小鼠肝臟中灌注高濃度的瘦素發(fā)現(xiàn)，磷化酶活性、肝糖原分解受到抑制，肝糖原儲(chǔ)存增加，葡萄糖濃度降低 [12]，說明瘦素能通過促進(jìn)能量消耗并抑制糖異生對(duì)機(jī)體代謝進(jìn)行調(diào)控。瘦素能夠抑制脂肪的沉積，促進(jìn)脂肪的水解，增加能量消耗，可直接作用于胰島細(xì)胞，對(duì)糖、脂代謝進(jìn)行調(diào)控 [13]。Shimabukuro等用瘦素處理離體的胰島組織，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自由脂肪酸的氧化速度升高，甘油三酯含量降低 [14]。Bado等研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜上皮中存在著瘦素，許多短型的Ob-R在空腸、回腸表達(dá)，抑制腸道對(duì)糖的吸收，降低載脂蛋白量，從而減少乳糜顆粒中的甘油三酯 [15]。本試驗(yàn)中，Ⅲ至Ⅴ組蛋雞的葡萄糖、甘油三酯與禁食對(duì)照組相比均下降了，Ⅲ、Ⅳ組葡萄糖含量與對(duì)照組相比顯著下降（P<0 05），各組間甘油三酯含量差異不顯著。試驗(yàn)中蛋雞血液中葡萄糖、甘油三酯水平與瘦素注射水平呈負(fù)相關(guān)，與Aiston等研究結(jié)果 [16]基本相符，而由瘦素導(dǎo)致的血液中葡萄糖、甘油三酯水平的下降也可能是蛋雞體質(zhì)量下降的原因之一。但是有關(guān)瘦素對(duì)糖、脂代謝的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未清晰，仍有待研究。

3 3 外源性瘦素對(duì)蛋雞肝臟OB-R基因定量表達(dá)的影響

外源性瘦素主要通過OB-Rb來發(fā)揮其生物學(xué)功能，動(dòng)物生長發(fā)育到一定階段后，瘦素作為動(dòng)物繁殖系統(tǒng)的一個(gè)重要信號(hào)，使體內(nèi)脂肪的含量持續(xù)升高，脂肪是動(dòng)物機(jī)體貯存能量的重要物質(zhì)，在動(dòng)物能量代謝中發(fā)揮著重要的作用，瘦素可作為抑制性信號(hào)，對(duì)脂肪的沉積起負(fù)調(diào)節(jié)作用 [17]。蛋雞的脂肪主要集中在腹部與肌胃上，腹脂是家禽體內(nèi)蓄積脂肪的主要部位，雞腹脂質(zhì)量約占體脂質(zhì)量的22%，而腹脂的合成與分解受肝臟的調(diào)控，肝臟在機(jī)體能量代謝中發(fā)揮著重要的作用。但是蛋雞過多的腹脂會(huì)影響其生產(chǎn)性能，因此可以通過肌肉注射外源激素來抑制脂肪的沉積，瘦素發(fā)揮其促進(jìn)蛋雞能量代謝等生物功能須要OB-R的介導(dǎo)。相關(guān)試驗(yàn)證實(shí)，OB-R基因在動(dòng)物肝臟和腹脂中均有表達(dá)，在肉雞、火雞上發(fā)現(xiàn)的受體中，只有長型受體（OB-Rb）被分離鑒定，主要分布于腦部、卵巢，在肝臟、腎臟、小腸中也有分布 [5]，肝臟中OB-R基因表達(dá)量較大，有利于借助瘦素發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中的瘦素mRNA水平與胖瘦程度呈正相關(guān) [18]。宋岳強(qiáng)研究報(bào)道，禁食可抑制家鴨卵巢瘦素受體mRNA的表達(dá)，注射外源性瘦素可以促進(jìn)卵巢瘦素受體mRNA的表達(dá) [9]；Cassy等研究表明，對(duì)蛋雞進(jìn)行短期禁食同樣能抑制雞卵巢OB-R基因表達(dá) [8]。在本試驗(yàn)中，2 d的禁食使肝臟中OB-R mRNA基因表達(dá)量有下降的趨勢，差異不顯著，瘦素發(fā)揮其功能則有可能受到一定程度的限制，與宋岳強(qiáng)研究結(jié)果 [9]不盡一致，與Cassy等的研究結(jié)論 [8]類似，具體原因需進(jìn)一步深入研究。外源性瘦素對(duì)肝臟中OB-R基因表達(dá)的影響不顯著，瘦素有可能不通過調(diào)整OB-R基因而通過別的途徑來影響脂肪沉積。

4 結(jié)論

瘦素對(duì)蛋雞食欲具有抑作用，使蛋雞采食量下降，表現(xiàn)為體質(zhì)量降低，葡萄糖、甘油三酯含量以及肝臟OB-R基因表達(dá)量隨著瘦素注射量的增加呈下降的趨勢。本試驗(yàn)中，400 μg/（kg·d） 注射水平對(duì)蛋雞的影響較為明顯，但是外源性瘦素對(duì)腹脂、肝臟中OB-R基因表達(dá)的影響不顯著，瘦素有可能不通過調(diào)整OB-R基因來影響脂肪沉積。

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