聯(lián)合檢測(cè)血漿SFRP2、RNF180基因甲基化在胃癌臨床診斷中的價(jià)值*

宋毓飛 張 謝 孫蓓蕾 張學(xué)松 黃詩(shī)良 黃志剛

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院消化內(nèi)科(315040)

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年因胃癌死亡的患者約73.8萬(wàn)例，總體5年生存率僅約20%，是一種嚴(yán)重威脅人群身體健康的疾病［1-2］。目前胃癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍為內(nèi)鏡下取活檢的病理結(jié)果，尚缺乏理想的非侵入性檢查手段。早期胃癌無(wú)特異性癥狀，導(dǎo)致許多患者未能及時(shí)就診治療，漏診率高。尋找并開(kāi)發(fā)痛苦小且準(zhǔn)確性高的篩查方法(如血液檢查)對(duì)提高胃癌早期診斷率和5年生存率非常重要。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中主要的基因?qū)W改變，且此改變發(fā)生在胃癌早期階段［3-4］。本研究通過(guò)應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)法檢測(cè)胃癌患者和對(duì)照者血漿中腫瘤凋亡相關(guān)因子SFRP2［5］和RNF180［6］基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，旨在評(píng)估這兩種基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為胃癌早期診斷以及篩查提供新的非侵入性方法，從而改善胃癌的5年生存率。

材料與方法

一、臨床資料

收集2011年6月-2013年6月浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胃小腸外科67例胃癌患者的血漿標(biāo)本，其中男42例，女25例，年齡31～89歲，中位年齡62歲。納入條件:①患者術(shù)前均經(jīng)胃鏡活檢確診為胃癌，術(shù)后經(jīng)病理切片再次確診;②患者術(shù)前均未接受過(guò)任何放、化療;③術(shù)前無(wú)其他腫瘤病史。全部病例均按WHO標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM系統(tǒng)(2010年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理分型。另收集同期51名正常健康體檢者的血漿標(biāo)本作為對(duì)照，其中男30名，女21名，年齡30～81歲，中位年齡56歲。本研究方案獲得寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有胃癌患者和健康志愿者均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

取受試者周?chē)o脈血3 mL，置于EDTA處理過(guò)的抗凝管中，3 000×g離心15 min，取上清，標(biāo)記，置于－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.DNA 提取:每份血漿標(biāo)本取 400 μL，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)說(shuō)明書(shū)提取DNA，最終以80 μL AE洗脫液洗脫，存于－20℃冰箱備用。

2.DNA 修飾:取 2 μg DNA，按照 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)亞硫酸鹽處理后，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，修飾后的DNA用30 μL EB重新溶解，用于MSP檢測(cè)。

3.MSP法:設(shè)計(jì) MSP引物序列(表1)。PCR反應(yīng)體系總體積共為50 μL，內(nèi)含2 μL DNA樣品，10 μL 緩沖液(Kapa Biosystems)，1 μL 10 mmol/L dNTP(Kapa Biosystems)，上下游引物(150 mmol/L)各 1 μL，0.5 U Taq 酶(Kapa Biosystems)0.2 μL，超純水34.8 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s，Tm+8℃(Tm 為 DNA解鏈溫度)30 s，72℃1 min，共10個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，Tm ℃ 30 s，72 ℃1 min，共38個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 μg/mL)鑒定，每孔加樣量 10 μL，電泳緩沖液為1×TAE。電泳結(jié)束后，紫外檢測(cè)儀下觀察并拍照。

表1 SFRP2［7］、RNF180 MSP 甲基化引物序列

甲基化判定:PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶而不出現(xiàn)非甲基化條帶的樣品，判定為基因甲基化;出現(xiàn)非甲基化條帶而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因非甲基化;甲基化條帶和非甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，判定為基因甲基化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。用多因素Logistic回歸法分析2個(gè)基因甲基化預(yù)測(cè)胃癌的能力。優(yōu)勢(shì)比(OR)和95%CI用于分析各基因甲基化間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿SFRP2、RNF180基因甲基化表達(dá)

對(duì)照組和胃癌患者血漿中SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為37.3%(19/51)和67.2%(45/67)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為23.5%(12/51)和53.7%(36/67)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)(圖1)。

圖1 SFRP2、RNF180基因MSP電泳圖

二、SFRP2、RNF180基因異常甲基化與臨床病理特征相關(guān)性

胃癌患者血漿SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)(表2);RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率與性別、年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P＜0.01)(表2)。

表2 胃癌患者血漿SFRP2、RNF180基因甲基化率與臨床病理特征的相關(guān)性(n)

三、SFRP2、RNF180甲基化預(yù)測(cè)胃癌能力以及兩者聯(lián)合診斷胃癌的能力

Logistic回歸顯示，RNF180基因異常甲基化水平(OR=3.0，95%CI:1.3 ～7.0，P ＜0.01)對(duì)胃癌的預(yù)測(cè)能力稍優(yōu)于SFRP2基因(OR=2.7，95%CI:1.2～6.1，P ＜0.01)。胃癌患者能檢測(cè)到 SFRP2 或RNF180基因甲基化水平的敏感性、特異性分別為77.6%和54.9%，而同時(shí)檢測(cè)到兩種基因甲基化的敏感性和特異性分別為42.7%和88.2%，OR值為5.6(95%CI:2.1 ～14.8)，說(shuō)明兩種基因聯(lián)合檢測(cè)能提高胃癌臨床診斷率，優(yōu)于任一基因的單獨(dú)檢測(cè)(表3)。

討 論

20余年前，Shapiro等［8］發(fā)現(xiàn)消化道惡性腫瘤患者血清中游離DNA含量明顯高于良性病變患者［(412±63)ng/mL對(duì)(118±14)ng/mL］。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)這些游離DNA的研究發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳學(xué)改變，如基因甲基化、基因點(diǎn)突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象等，其中DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中主要的基因?qū)W改變［4，8］。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)，DNA甲基化的改變可通過(guò)影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)而參與癌癥的發(fā)生，這為通過(guò)檢測(cè)血漿DNA甲基化狀態(tài)來(lái)篩查早期胃癌提供了可能。

在胃癌患者術(shù)后組織中已發(fā)現(xiàn)許多甲基化狀態(tài)異常的基因。DNA修復(fù)基因hMLH1與胃癌患者術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)，其在胃癌組織中的甲基化率明顯高于遠(yuǎn)處正常組織(5.7%對(duì)0%)［9］。p16可抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存率密切相關(guān)，Wu等［10］發(fā)現(xiàn)胃癌的甲基化率明顯高于癌旁正常組織(85.9%對(duì)12.0%)。RUNX3為RUNX轉(zhuǎn)錄家族成員，與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Zhang等［11］的研究顯示胃癌組織RUNX3甲基化率為57.6%，甲基化患者中RUNX3表達(dá)明顯低于非甲基化患者。DAPK是正向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在胃癌組織中的甲基化率高于正常組織(12.8% 對(duì) 2.7%)［12］。SFRP2 為腫瘤抑制因子，與臨床特征無(wú)相關(guān)性，其在胃癌組織中的甲基化率明顯高于正常組織［5，7，13］。RNF180 是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌因子，目前國(guó)內(nèi)外還少有其與臨床特征相關(guān)性的報(bào)道，Cheung等［14］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中RNF180甲基化率明顯高于正常組織(76%對(duì)0%)，但該研究例數(shù)很少，有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究前期對(duì)上述6個(gè)基因進(jìn)行了甲基化預(yù)實(shí)驗(yàn)篩查，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)血漿中腫瘤抑制因子SFRP2和RNF180基因甲基化水平對(duì)胃癌的臨床診斷價(jià)值最高。SFRP2通過(guò)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化使基因沉默，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，此信號(hào)途徑與包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［7，15］。本研究結(jié)果顯示胃癌中 SFRP2基因敏感性和特異性分別為67.2%、62.8%，SFRP2甲基化水平與臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。

環(huán)指蛋白R(shí)NF180是膜結(jié)合的E3泛素連接酶，包含RING finger和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤形成密切相關(guān)［14，16］。有研究發(fā)現(xiàn)RNF180 mRNA以及蛋白表達(dá)在胃癌細(xì)胞株、胃癌組織中下調(diào)或消失，且此現(xiàn)象在其他消化道系統(tǒng)癌癥中未發(fā)現(xiàn)，提示RNF180可能是一種新的胃癌特異性腫瘤抑制因子［14］。本研究首次探討了血漿中RNF180甲基化表達(dá)水平與胃癌患者臨床資料以及病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示胃癌患者血漿中RNF180甲基化率顯著高于正常健康者，且與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，提示其與胃癌預(yù)后密切相關(guān);RNF180診斷胃癌的特異性較高，但敏感性較低，與SFRP2聯(lián)合可提高其臨床診斷率，聯(lián)合檢測(cè)胃癌血漿SFRP2、RNF180的OR值最高，優(yōu)于任一基因單獨(dú)檢測(cè)。

表3 SFRP2、RNF180基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)診斷胃癌的能力

綜上所述，從血漿中尋找基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的特異性腫瘤標(biāo)志物，對(duì)胃癌臨床診斷和預(yù)測(cè)有積極的意義。本研究結(jié)果顯示，利用MSP聯(lián)合檢測(cè)血漿SFRP2和RNF180基因甲基化，可作為微創(chuàng)檢測(cè)方法，有望成為新的輔助胃癌診斷和篩查的分子生物學(xué)指標(biāo)。本研究所采用的MSP為定量方法，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)根據(jù)前期結(jié)果，對(duì)SFRP2和RNF180進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合檢測(cè)血漿中SFRP2和RNF180基因甲基化水平作為胃癌非侵入性早期篩查的可行性和可信性。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

2 Crew KD，Neugut AI.Epidemiology of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(3):354-362.

3 Shi J，Qu YP，Hou P.Pathogenetic mechanisms in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2014，20(38):13804-13819.

4 Qu Y，Dang S，Hou P.Gene methylation in gastric cancer［J］.Clin Chim Acta，2013，424:53-65.

5 Kinoshita T，Nomoto S，Kodera Y，et al.Decreased expression and aberrant hypermethylation of the SFRP genes in human gastric cancer［J］.Hepatogastroenterology，2011，58(107-108):1051-1056.

6 Deng J，Liang H，Ying G，et al.Methylation of CpG sites in RNF180 DNA promoter prediction poor survival of gastric cancer［J］.Oncotarget，2014，5(10):3173-3183.

7 Cheng YY，Yu J，Wong YP，et al.Frequent epigenetic inactivation of secreted frizzled-related protein 2(SFRP2)by promoter methylation in human gastric cancer［J］.Br J Cancer，2007，97(7):895-901.

8 Shapiro B，Chakrabarty M，Cohn EM，et al.Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease［J］.Cancer，1983，51(11):2116-2120.

9 Jin J，Xie L，Xie CH，et al.Aberrant DNA methylation of MGMT and hMLH1 genes in prediction of gastric cancer［J］.Genet Mol Res，2014，13(2):4140-4145.

10 Wu YC，Lv P，Han J，et al.Enhanced serum methylated p16 DNAs is associated with the progression of gastric cancer［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(4):1553-1562.

11 Zhang YW，Eom SY，Yim DH，et al.Evaluation of the relationship between dietary factors， CagA-positive Helicobacter pylori infection，and RUNX3 promoter hypermethylation in gastric cancer tissue［J］.World J Gastroenterol，2013，19(11):1778-1787.

12 Yao D，Shi J，Shi B，et al.Quantitative assessment of gene methylation and their impact on clinical outcome in gastric cancer［J］.Clin Chim Acta，2012，413(7-8):787-794.

13 Hiraki M，Kitajima Y，Koga Y，et al.Aberrant gene methylation is a biomarker for the detection of cancer cells in peritoneal wash samples from advanced gastric cancer patients［J］. AnnSurgOncol， 2011， 18(10):3013-3019.

14 Cheung KF，Lam CN，Wu K，et al.Characterization of the gene structure， functional significance， and clinical application of RNF180，a novel gene in gastric cancer［J］.Cancer，2012，118(4):947-959.

15 Nojima M，Suzuki H，Toyota M，et al.Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer［J］.Oncogene，2007，26(32):4699-4713.

16 Ogawa M，Mizugishi K，Ishiguro A，et al.Rines/RNF180，a novel RING finger gene-encoded product，is a membranebound ubiquitin ligase［J］.Genes Cells，2008，13(4):397-409.