GC法測(cè)定不同產(chǎn)地五味子藤莖中揮發(fā)油含量

徐思思，徐惠芳

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北武漢430010）

五味子為木蘭科五味子屬多年生木質(zhì)藤本，主產(chǎn)于遼寧、黑龍江、吉林等省，俗稱“北五味子”。具益氣生津、補(bǔ)腎養(yǎng)心、收斂固澀的功效［1］。五味子中主要含有多糖、揮發(fā)油和木脂素類成分等［2］。五味子藤莖為其干燥藤莖，人們常把曬干的藤莖代替花椒，習(xí)稱“山花椒藤”［3］。五味子藤莖曬干后有優(yōu)良的保健、調(diào)味功效［4］。

目前對(duì)五味子果實(shí)及種子的研究較多［5-6］，而五味子藤莖揮發(fā)油方面的研究則相對(duì)較少［7-8］。揮發(fā)油中主要含大量倍半萜烯成分，其中蒎烯對(duì)白色念珠菌有明顯的抑菌與殺菌作用，以及抗氧化、抗衰老作用［9］；檸檬烯具有抑菌活性與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用［10］；月桂烯和蒎烯是合成萜類單體香料的重要原料。本研究側(cè)重對(duì)不同栽培環(huán)境下五味子藤莖中揮發(fā)油含量進(jìn)行研究，為五味子的藥食兩用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與試劑

五味子藤莖材料主要采集于東北及華北地區(qū)野生品，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室陳科力教授鑒定為木蘭科植物五味子的藤莖。藥材經(jīng)洗凈后，自然干燥，粉碎過40目篩，備用。

對(duì)照品：α-蒎烯（批號(hào)：110897-200502，含量≥99%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、β-蒎烯（批號(hào)：YA0402SB13，含量≥99%，上海源葉生物科技有限公司）、月桂烯（批號(hào)：YA0402SA13，含量≥85%，上海源葉生物科技有限公司）、檸檬烯（批號(hào)：20130116，含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、正十三烷（批號(hào)：CAS＃629-50-5，含量≥99%，上海源葉生物科技有限公司）。正己烷為色譜級(jí)，乙醚、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 6890N氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器，石英毛細(xì)管柱（大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司），Agilent化學(xué)工作站，SARTORIUS-CP225D十萬分之一天平（德國(guó)SARTORIUS公司）。揮發(fā)油提取器，萬能粉碎機(jī)（北京普諾眾達(dá)科技有限公司），ME104E型電子分析天平（梅特勒-托利多公司），KD-DTC3102型電子分析天平（梅特勒-托利多公司），電子調(diào)溫電熱套（北京科華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），微量進(jìn)樣器等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 nm×0.5 μm）；檢測(cè)器：FID；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；檢測(cè)器溫度：250℃；程序升溫：柱溫從50℃開始，以8℃/min升溫至 130 ℃；載氣：N2；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比 10∶1；進(jìn)樣量：1 μL。理論板數(shù)按 α-蒎烯計(jì)算大于10000。對(duì)照品和樣品色譜圖見圖1［11-12］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 取正十三烷適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用色譜級(jí)正己烷稀釋至刻度線，搖勻，配成濃度為10.19 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

圖1 五味子藤莖樣品（A）和對(duì)照品（B）色譜圖

2.2.2 供試品溶液配制 精密稱取一定粉碎度的五味子藤莖粉末50.00 g，置1000 mL圓底燒瓶中，參照2010版《中國(guó)藥典》第一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法。加一定比例的水與碎瓷片數(shù)片，振搖，混合后連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加入飽和氯化鈉溶液使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶為止。置電子調(diào)溫電熱套上浸泡一定時(shí)間，之后緩緩加熱至沸，并保持微沸約數(shù)小時(shí)。提取完畢后，停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器下端的活塞，將氯化鈉溶液緩緩放出，至油層上端到達(dá)刻度0線上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其下端恰與刻度0線平齊。讀取揮發(fā)油量，收集揮發(fā)油于2 mL EP管中，加適量無水硫酸鈉脫水，密閉，振搖，至烘箱中45℃靜置5 h。加2 mL乙醚于揮發(fā)油提取器中，緩緩振搖，使黏附于壁上的揮發(fā)油溶于乙醚中，收集乙醚萃取液于2 mL EP管中，加少量無水硫酸鈉脫水，常溫?fù)]干乙醚。待兩管中揮發(fā)油變成澄清的淡黃色后，合并。將脫水后的純凈揮發(fā)油置于5 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，加色譜級(jí)正己烷定容至刻度，搖勻，即得，備用［9］。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 分別取對(duì)照品α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和檸檬烯適量，精密稱定，置于2 mL容量瓶中，分別加色譜級(jí)正己烷稀釋至刻度線，搖勻，配成濃度分別為 5.46 mg/mL，6.92 mg/mL，6.45 mg/mL，5.45 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別用相應(yīng)量程移液槍精密吸取 α-蒎烯對(duì)照品母液 0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.30 mL；β-蒎烯對(duì)照品母液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL；月桂烯對(duì)照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL；檸檬烯對(duì)照品母液 0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL，將上述溶液依次對(duì)應(yīng)分別置于5 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，再加正己烷（色譜級(jí)）稀釋至刻度線，搖勻，吸取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。以各對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

α-蒎烯所得回歸曲線方程為：Y=9.178X-0.0463，R2=0.9997；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.0218 mg/mL~0.3280 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

β-蒎烯所得回歸曲線方程為：Y=11.02X-0.0196，R2=0.9994；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.0692 mg/mL~0.6920 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

月桂烯所得回歸曲線方程為：Y=5.082X-0.034，R2=0.9998；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.0129 mg/mL~0.2580 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

檸檬烯所得回歸曲線方程為：Y=13.56X-0.0852，R2=0.9996；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.0109 mg/mL~0.2180 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液1 μL，按上述2.1項(xiàng)下色譜條件同法進(jìn)樣（n=6），記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，并計(jì)算RSD值。結(jié)果4種對(duì)照品峰面積比的RSD依次為1.42%、1.71%、0.95%、1.87%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液1 μL，室溫放置，于 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h 時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)樣，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，并計(jì)算RSD值。結(jié)果4種對(duì)照品峰面積比的RSD分別為1.03%，1.34%，1.48%，1.79%。結(jié)果表明在12 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品藥材6份，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按上述2.1項(xiàng)下色譜條件同法進(jìn)樣 1 μL（n=6），計(jì)算 α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和檸檬烯的平均含量分別為 15.47 μg/g，101.50 μg/g，15.86 μg/g，4.74 μg/g；RSD 分別為 1.45%，1.62%，1.28%，1.81%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 選取已知含量的同一樣品五味子藤莖粉末，每份約50.00 g，精密稱量，分別加入 α-蒎烯 50 μL、β-蒎烯 0.5 mL、月桂烯 50 μL、檸檬烯20 μL上述2.2.3對(duì)照品溶液，按2.2.2方法制備，平行操作此過程，制得6份加樣回收率試驗(yàn)供試品溶液，按上述2.1項(xiàng)下色譜條件同法進(jìn)樣1 μL測(cè)定，計(jì)算回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

分別精密吸取供試品溶液1 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。樣品信息及測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品信息及含量測(cè)定結(jié)果 （μg/g）

3 分析討論

本研究通過選取10個(gè)五味子藤莖樣品，樣品來源主要以東北為主、華北為輔，因北方地區(qū)常以五味子干燥藤莖作為食用調(diào)料，故將揮發(fā)油成分作為研究指標(biāo)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，五味子藤莖揮發(fā)性成分總含量以東北地區(qū)較高，其中遼寧省含量普遍偏高。五味子藤莖樣品中4種揮發(fā)性成分含量差異較大，從含量平均值上而言，β-蒎烯>月桂烯>α-蒎烯>檸檬烯。

五味子作為常用中藥，常以果實(shí)入藥。五味子資源豐富，目前對(duì)藤莖等非藥用部位的研究開發(fā)較少。本研究測(cè)定了五味子藤莖中4種揮發(fā)性成分的含量，為五味子藤莖的藥用價(jià)值提供了一定的科學(xué)依據(jù)和參考。

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